Artykuł metodologiczny

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55115

⸱

19 stycznia 2018

 , 
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Streszczenie

Rozwój guza i naczyń nowotworowych, jak również reakcja guza na terapie, są wysoce dynamicznymi procesami biologicznymi. Histologia dostarcza informacji statycznych i często nie jest wystarczająca do prawidłowej interpretacji. Ocena przyżyciowa, w której proces jest śledzony w czasie, dostarcza dodatkowych i często nieoczekiwanych informacji. Wraz ze stworzeniem transgenicznych zwierząt wykazujących ekspresję markerów specyficznych dla komórek i znaczników żywych komórek, ulepszeniami sprzętu do obrazowania oraz opracowaniem kilku komór do obrazowania, mikroskopia przyżyciowa stała się ważnym narzędziem do lepszego zrozumienia procesów biologicznych. W artykule opisano eksperymentalny projekt badania rozwoju naczyń nowotworowych i efektów terapeutycznych w sposób przestrzenny i czasowy. Za pomocą tej konfiguracji można wizualizować i śledzić etap rozwoju naczynia, tworzenie komórek końcówki i światła, przepływ krwi, wynaczynienie, ustalone łożysko naczyniowe i zniszczenie naczyń. Ponadto można również śledzić efekty terapeutyczne, losy wewnątrznowotworowe i lokalizację związków chemioterapeutycznych.

Wprowadzenie

Podczas gdy badania in vitro umożliwiają obrazowanie kinetyczne procesów w wysokiej rozdzielczości, eksperymenty in vitro nie umożliwiają oceny we właściwym kontekście. Na przykład interakcja komórek nowotworowych z przedziałami zrębu lub dostarczanie i dystrybucja leków wewnątrz guza nie mogą być badane na płytce hodowlanej. Modele zwierzęce są zatem wykorzystywane do naśladowania ludzkiej fizjologii i patologii. Jednak obrazowanie podłużne procesów, zwłaszcza w rozdzielczości subkomórkowej, jest trudne. Metody obrazowania molekularnego, takie jak rezonans magnetyczny (MRI), tomografia komputerowa emisji pojedynczych fotonów (SPECT) i pozytonowa tomografia emisyjna (PET), mają dobre głębokości penetracji, ale brakuje im rozdzielczości lub nie ilustrują struktur anatomicznych. Obrazowanie optyczne zapewnia wysoką rozdzielczość i umożliwia obrazowanie struktur, ale towarzyszy mu słaba lub minimalna penetracja1. Zastosowanie mikroskopii przyżyciowej w połączeniu z technologiami komór okiennych, takich jak grzbietowy fałd skórny lub okno brzuszne, pozwala na obrazowanie in vivo2,3,4. Technologia ta ma wyraźne zalety, ponieważ pozwala na obrazowanie podłużne w ciągu godzin, a nawet dni, w celu obrazowania procesów we właściwym kontekście (np. interakcji komórka-komórka w obrazowanej tkance) oraz w rozdzielczościach na granicach optycznych zaawansowanych mikroskopów konfokalnych i wielofotonowych.

Wprowadzenie transgenicznych zwierząt z fluorescencyjnymi znacznikami specyficznymi dla komórek lub białek otwiera mnóstwo możliwości eksperymentów in vivo i ex vivo. Na przykład interakcje komórka-komórka, produkcja białek i reakcja na manipulację lub terapię mogą być badane in vivo przy użyciu tych modeli5,6,7,8. Co ważne, pozycję w miejscu i czas można określić za pomocą odpowiedniego sprzętu do obrazowania i metodologii. W tym artykule przedstawiono mikroskopię przyżyciową zwierząt wykazujących ekspresję markera śródbłonka w połączeniu ze środkami do wstrzykiwań w guzie zagnieżdżonym w zmodyfikowanej komorze okiennej grzbietowego fałdu skórnego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z holenderskim prawem, a protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach Erasmus MC, Rotterdam, Holandia.

1. Mysz odbiorcy

  1. Kiedy urodzą się myszy transgeniczne, należy przeprowadzić badania przesiewowe zwierząt pod kątem odpowiedniego genotypu przy użyciu standardowych procedur9.
    UWAGA: W niniejszym manuskrypcie przedstawiono dane uzyskane z linii eNOStag-GFP line9 opracowanej wewnętrznie oraz zakupionej linii ROSA-mTmG (stock 007676)10.
  2. Używaj myszy w wieku 12 tygodni lub starszych i ważących powyżej 20 g.

2. Mysz darczyńca

UWAGA: Fragment guza do implantacji w oknie grzbietowym jest pobierany od nietransgenicznego zwierzęcia dawcy. W zależności od typu guza stosuje się myszy normalne (z guzami syngenicznymi) lub z niedoborem odporności (ksenoprzeszczepy).

  1. Hodować komórki nowotworowe w pożywce z odpowiednimi dodatkami w kolbach hodowlanych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Usunąć pożywkę z kolb komórkowych, przemyć raz 1x PBS i odłączyć komórki za pomocą 0,25% trypsyny.
  3. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych. Zebrać komórki, odwirować w temperaturze 1 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS.
  4. Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórek 20 μl błękitu trypanowego, który barwi martwe komórki. Policz liczbę żywych i martwych komórek za pomocą hemocytometru; Liczba martwych komórek nie powinna przekraczać 10%.
  5. Ponownie odwiruj komórki w temperaturze 1 200 x g przez 5 minut i ponownie zawieś osad komórek w lodowatym PBS, uzyskując 1 milion komórek na 100 μl. Przetransportuj komórki na lodzie na salę operacyjną.
  6. Znieczulić zwierzę za pomocą izofluranu/O2. Włącz tlen i dostosuj przepływ do 0,5 ml/min. Ustaw waporyzator izofluranu na 3%. Po kilku minutach umieść mysz w komorze anestezjologicznej.
    UWAGA: Napełnij komorę, aby upewnić się, że jest gotowa do użycia, aby zminimalizować stres.
  7. Gdy mysz zostanie uspokojona, przyprowadź zwierzę do roboczego stołu grzewczego, utrzymywanego w temperaturze 37 °C, i umieść pysk w stożku nosowym do znieczulenia.
    1. UWAGA: Zwierzę jest odpowiednio uspokojone, gdy nie zostanie odnotowana reakcja na uszczypnięcie w opuszkę stopy.
  8. Ogolić mysz, aby lepiej uwidocznić miejsce wstrzyknięcia. Zaszczepić za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml; wstrzyknąć 100 μl komórek w bok myszy i pozwolić na rozwój guza.
  9. Poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Za pomocą mikronożyczek i kleszczy rozetnij skórę w miejscu guza i wypreparuj guz. Umieść guz na szalce Petriego z PBS. Za pomocą mikronożyczek i kleszczy pokrój guz na fragmenty o wielkości około 1 mm3 (Rysunek 1A-a).
    UWAGA: Guz myszy dawcy powinien być wystarczająco duży, aby dać wystarczającą ilość materiału, ale należy unikać dużych, martwiczych guzów. W przypadku większości nowotworów wystarcza średnia średnica 10 mm.

3. Implantacja komory okiennej

  1. Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach aseptycznych. Autoklawować narzędzia chirurgiczne (Rysunek 1A) i materiały komór (Rysunek 1B).
    UWAGA: Zastosowana tutaj komora okienna, o łącznej masie 1,1 g, wykonana jest z polieteroeteroketonu (PEEK), lekkiego, syntetycznego materiału kompatybilnego z rezonansem magnetycznym. PEEK jest 3,4-krotnie lżejszy od tytanu, który jest powszechnie stosowany w literaturze do tych okien. Jest odporny na większość chemikaliów, jest obojętny, nie wywołuje reakcji immunologicznych i jest wytrzymały. To okno jest również mniejsze w porównaniu z poprzednio opublikowanymi oknami. Myszy wyposażone w to okienko wykazują pełną zdolność ruchu, mogą wspinać się i przybierać na wadze porównywalnie do myszy bez komory okiennej. Ponieważ zwierzę może gryźć okno, okna syntetyczne mogą trwać nieco krócej w porównaniu z oknami tytanowymi; Są jednak łatwe do wykonania i niedrogie. Te konkretne okna są produkowane we własnym zakresie i można je nabyć na życzenie.
  2. Uspokoić mysz biorcę za pomocą wziewnych środków znieczulających (tj. izoflukranu/O2) w komorze anestezjologicznej. Przyłóż mysz do podgrzewanego stołu operacyjnego w temperaturze 37 °C i umieść pysk w stożku nosowym do znieczulenia (patrz krok 2.6). Nałóż maść na oczy, aby uniknąć wysuszenia.
  3. Usuń włosy z całych pleców, goląc się i nakładając żel do depilacji. Uważaj, aby cały żel został usunięty, ostrożnie spłukując zwierzę ciepłą wodą z kranu. Osusz zwierzę i oczyść skórę 70% etanolem.
    UWAGA: Procedurę golenia można również wykonać dzień przed implantacją okienka. Krem należy dokładnie usunąć ciepłą wodą z rąk, ponieważ może to spowodować podrażnienie skóry.
  4. Zaznacz linię środkową na grzbiecie myszy markerem, aby zapewnić symetryczne ustawienie komory. Zmień położenie myszy, pociągnij skórę do klapki, używając linii środkowej jako pozycji składanej, i chwyć środek klapki. Ustaw okno tak, aby górna część ramy znajdowała się co najmniej 2 mm poniżej linii środkowej i zakreśl markerem obszar widoku okna na skórze.
  5. Używając uchwytu na skalpel/ostrza o rozmiarze 15 i mikronożyczek, usuń skórę wzdłuż narysowanej okrągłej linii. Uważaj, aby nie uszkodzić spodniej powięzi.
    UWAGA: Tworzy to obszar widoku z okna komory, w której przeszczepiony jest guz.
  6. Pociągnij fałd skórny i za pomocą dziurkacza do uszu przebij otwory o średnicy 1 mm przez skórę, po jednym z każdej strony view obszar (Rysunek 1A-b).
    UWAGA: Są to otwory na dwie do mocowania ram okiennych razem.
  7. Umieść wykonaną na zamówienie ramę przedniej komory za pomocą (rysunki 1B-a, 1B-c) i umieść tylną ramę (Rysunek 1B-b) na. Umieść nakrętki (Rysunek 1B-d) na tylnej ramie na.
    UWAGA: te służą do mocowania komór razem z fałdem skórnym, a następnie służą do unieruchamiania komory podczas oceny pod mikroskopem.
  8. Pociągnij skórę 2-3 mm powyżej górnej części ramek i upewnij się, że obszar widoku okna do przeszczepu pasuje do obszaru komory. Umieść igły 23 G przez dwa małe otwory na szwy (Rysunek 1B, strzałka) w górnej części ramy. Dokręć nakrętki na za pomocą mikrośrubokręta (Rysunek 1A-c) i clampuchwyt igły, aby unieruchomić nakrętki.
    UWAGA: Podejmij środki ostrożności, aby upewnić się, że skóra nie obraca się wokół i nie dokręcaj zbyt mocno.
  9. Zastąp igły szwami, zaczynając od góry, aby przymocować oprawki do skóry. Zrób to dla 5 par otworów na szwy (Rysunek 1B, biała strzałka) w ramie.
  10. Obróć mysz, aby odsłonić tylną część komory okiennej. Umieścić gruby kawałek szkła wypełniającego o średnicy 10 mm i grubości 0.55 mm (rysunek 1B-e), a następnie standardową szklankę nakrywkową o średnicy 12 mm (rysunek 1B-f). Zabezpiecz je pierścieniem ustalającym (Rysunek 1B-g) w obszarze tylnej komory.
    UWAGA: Szyba wypełniająca zapobiega otwieraniu się przestrzeni między deską rozdzielczą a oknem po przedniej stronie, które służy do obrazowania.
  11. Uwodnić obszar widoku okna, w którym zostanie wprowadzony guz, wypełniając strzykawkę o pojemności 1 ml sterylnym 0,9% NaCl. Pozwól, aby kilka kropel spadło na ten obszar widzenia. Usuń nadmiar soli fizjologicznej sterylną bawełnianą końcówką.
  12. W powięzi utwórz kieszeń wystarczająco dużą, aby pomieścić fragment guza o wielkości 1 mm3 (ryc. 1A-a) za pomocą igły 25 G, której końcówka jest zgięta pod kątem 90 ° (ryc. 1A-d). Za pomocą uchwytu na igłę lub kleszczyków Kelly'ego włóż fragment guza na środek obszaru widoku okna do przeszczepu w tej kieszeni.
  13. Zamknąć obszar widzenia okna za pomocą standardowej szyby nakrywkowej o grubości 12 mm i pierścienia ustalającego.
    UWAGA: Może tworzyć się pęcherzyk powietrza, ale zniknie on w ciągu kilku godzin.

4. Opieka przed i po opiece nad zwierzęciem

  1. Podawać leki przeciwbólowe (tj. 0,05 mg/kg buprenorfiny) podskórnie, zgodnie z aprobatą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu pod lampą grzewczą.
  2. Myszy z oknami należy umieszczać pojedynczo w klatce i w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 32 °C i wilgotności powyżej 50%. Upewnij się, że butelki z wodą mają temperaturę otoczenia przed umieszczeniem ich na klatce, aby zapobiec wyciekom. Używaj klatek i urozmaiceń, które umożliwiają swobodny ruch oraz dostęp do pożywienia i wody.
    UWAGA: Ponieważ ta komora okienna jest bardzo dobrze tolerowana, myszy wykazują normalne zachowanie. Indywidualna obudowa zapobiega uszkodzeniom komory okiennej spowodowanym przez inne myszy, a wysoka temperatura/wilgotność zapobiega wychłodzeniu i odwodnieniu fałdu skórnego.
  3. Regularnie sprawdzaj mysz pod kątem przegryzionych szwów, poluzowanych/nakrętek lub pękniętego szkła nakrywkowego. W takim przypadku należy natychmiast naprawić i wymienić. Do zabezpieczenia okna można zastosować osłonę wykonaną z lekkiego materiału.

5. Obrazowanie przyżyciowe

UWAGA: W tej procedurze używany jest mikroskop wielofotonowy i odpowiednie oprogramowanie sterujące. W tym przypadku wykorzystywane są pakiety oprogramowania, które zostały dostarczone wraz z mikroskopami. Zasadniczo każdy pakiet oprogramowania, który jest dostarczany z mikroskopem i jest przeznaczony do sterowania mikroskopem i rejestrowania obrazów, będzie służył temu celowi.

  1. Włącz system: komputer/mikroskop, zasilanie konfokalnej jednostki sterującej, moc lasera i emisja lasera. Na przykład za pomocą tego oprogramowania uruchom oprogramowanie i zainicjuj stół mikroskopu (Rysunek 1E-a i 1E-c), klikając "zainicjuj tabelę". Włącz system i ustaw go w trybie umożliwiającym komputerowi sterowanie mikroskopem, tabelą xy, pozycjonowaniem z i przechwytywaniem obrazu.
  2. Włącz światło fluorescencyjne (Rysunek 1E-b).
    UWAGA: Służy do oceny obrazów fluorescencyjnych przez oko wraz z jasnym polem.
  3. Włącz wykonaną na zamówienie platformę z kontrolowaną temperaturą (Rysunek 1C-c; opisaną bardziej szczegółowo w Omówieniu) ustawioną na 37 °C.
  4. Włączyć jednostkę anestezjologiczną za pomocą izofluranu/O2 (ryc. 1E-d). Zamontuj rurkę anestezjologiczną na stoliku mikroskopu (ryc. 1C-e). Zamontuj zacisk na stoliku xy, aby zamocować pysk anestezjologiczny
    5. .
  5. Wstępnie oceń zwierzę, aby ustalić etap rozwoju naczynia nowotworowego; zależy to od szybkości wzrostu guza, ale może się różnić u poszczególnych myszy.
    1. Uspokoić mysz za pomocą wziewnych środków znieczulających (izofluran/O2) w komorze anestezjologicznej (patrz krok 2.6).
    2. Umieść zwierzę na platformie o kontrolowanej temperaturze, zamontowanej na stoliku mikroskopu, co zapobiega wychłodzeniu zwierzęcia podczas znieczulenia. Upewnij się, że pysk myszy znajduje się w stożku anestezjologicznym i nałóż maść do oczu, jeśli ocena potrwa dłużej niż 5 minut.
      UWAGA: W przypadku oceny dłuższej niż 1 godzina należy zmniejszyć przepływ izofluranu do 2%.
    3. Użyj komory, aby zamocować (Rysunek 1C-b, pełna strzałka) komorę na specjalnie wykonanym uchwycie komory (Rysunek 1C-a). Przykręć ten uchwyt (Rysunek 1C-d, przerywana strzałka) do podgrzewanej platformy (Rysunek 1C-c).
      UWAGA: Ta kombinacja zapobiega artefaktom ruchu w obszarze widoku okna, jednocześnie umożliwiając zwierzęciu swobodne oddychanie.
    4. Upewnij się, że czyścisz szybę w obszarze widoku okna bawełnianą końcówką zamoczoną w wodzie, aby zapobiec rozmytemu obrazowi i zakłóceniom pochodzącym z zanieczyszczeń na zewnątrz szkła. Umieść platformę i mysz na stoliku mikroskopu (Rysunek 1D).
      UWAGA: Uważaj, aby ogon nie utknął między platformą a stolikiem mikroskopu.
    5. Sprawdź wzrokowo etap rozwoju naczynia nowotworowego za pomocą soczewki obiektywowej 10X, jasnego pola i światła fluorescencyjnego.
      UWAGA: Naczynia fluorescencyjne powinny być skupione, a przepływ krwi powinien być widoczny za pomocą jasnego pola. Gdy unaczynienie jest wyraźnie widoczne, oceń etap rozwoju naczynia nowotworowego. Na przykład określ, czy występuje angiogeneza o wczesnym początku ze wzrostem komórek wierzchołkowych, czy już ustalone unaczynienie do dostarczania leków. To samo zwierzę można ponownie ocenić, a ponieważ rozwój guza jest procesem ciągłym. W jednym guzie można zaobserwować kilka etapów w tym samym czasie.
      1. Gdy nie jest możliwe skupienie się na unaczynieniu, usuń zwierzę ze sceny, pozwól myszy dojść do siebie i umieść zwierzę z powrotem w pomieszczeniu o kontrolowanym klimacie. Sprawdź to ponownie później. Gdy mysz będzie gotowa do oceny, kontynuuj proces opisany poniżej.
  6. Włącz lasery konfokalne i panel sterowania, klikając "Laser" i "Ctrl panel" w zakładce Konfiguracja
    UWAGA: Zaleca się ustawienie niskiej mocy lasera, szczególnie w przypadku lasera argonowego, aby zapobiec wybielaniu, nagrzewaniu się tkanki i fotouszkodzeniom. Panel sterowania można ustawić zgodnie z osobistymi preferencjami. W przypadku obrazowania przyżyciowego przy użyciu wielu fluoroforów zaleca się zastosowanie następujących ustawień: "inteligentne wzmocnienie, 100 V na obrót", "inteligentne przesunięcie, 10% na obrót", "zoom, średnie", "Pozycja X, średnie", "Pozycja Y, średnie" i "Pozycja Z, 100 μm na obrót". Przed obrazowaniem Dostosuj przesunięcie, aby zminimalizować szumy i zoptymalizować stosunek sygnału do szumu. Funkcja zoomu konfokalnego pozwala na uzyskanie większego powiększenia bez zmiany soczewek obiektywu. Kontrolka X, Y i Z jest niezbędna do zlokalizowania pól zainteresowania. W przypadku mikroskopii przyżyciowej ustawienie Z powinno wynosić około 100 μm na obrót podczas oceny tkanki kleszcza.
  7. Kliknij "Akwizycja" w zakładce Pobieranie i zmień ustawienie na: "Tryb akwizycji XYZ lub XYZT", "Format (512x512 lub 1024x1024)" i "Prędkość (400 Hz lub 200 Hz)". Kliknij "Otworek" i ustaw go na 1 przewiewną jednostkę. Kliknij "Dwukierunkowy X".
    UWAGA: Aby zoptymalizować obrazy, należy zachować równowagę między mocą lasera, wzmocnieniem i otworkiem, o czym wspomniano w dyskusji.
  8. Oceniając wiele fluoroforów, wybierz "Skanowanie sekwencyjne" i "Między klatkami", aby zapobiec przebijaniu, o którym wspomniano w Dyskusji. Wybierz "Średnia linii 4", aby uzyskać dobrą redukcję szumów.
    UWAGA: W zależności od wewnętrznej fluorescencji obecnej u zwierzęcia transgenicznego, inne markery fluorescencyjne, takie jak dextrans, Hoechst, FITC-BSA, chemioterapeutyki fluorescencyjne i/lub nanocząstki rozcieńczone do pożądanego stężenia w 0,9% NaCl mogą być podawane i oceniane w guzie. Są one wstrzykiwane przez ogon lub żyłę prącia.
  9. Kliknij "Eksperymentuj" w zakładce Acquire i wybierz "Nowa", aby utworzyć nową bazę danych.
  10. Oceń zwierzę za pomocą, w zależności od pytania badawczego, soczewek obiektywowych 10X, 20X lub 40X. Przez okular znajdź pozycję do oceny.
    UWAGA: Najlepiej jest używać suchych soczewek z jak najwyższą NA, ponieważ suche soczewki mają stosunkowo dużą odległość roboczą i nie wymagają płynu zanurzeniowego. W Dyskusji wspomniano o zastosowaniu soczewek obiektywowych zanurzonych w wodzie.
  11. Użyj szybkiego skanowania na żywo, aby znaleźć odpowiednie wzmocnienie i przesunięcie, aby zapobiec prześwietleniu i zoptymalizować stosunek sygnału do szumu. Zachowaj te same ustawienia obrazowania podczas eksperymentów i między nimi, jeśli potrzebne jest porównanie ilościowe.
    UWAGA: Dalsze rozważania dotyczące optymalnego obrazowania są wymienione w dyskusji. Pozycję i powiększenie XYZ można sfinalizować podczas skanowania na żywo za pomocą panelu sterowania.
  12. Aby utworzyć stos Z, wybierz "Stos Z" w zakładce Pobierz. Wykonaj szybki skan Z, używając pozycji Z w panelu sterowania i ustaw początek i koniec skanowania, klikając "Początek μm" i "Koniec μm". Ustaw rozmiar kroku Z w odniesieniu do rozmiaru otworka.
  13. Zrób zdjęcia, klikając "start."
    UWAGA: Ponieważ mikroskopia przyżyciowa opiera się na kinetyce, a zatem obserwuje się procesy dynamiczne, należy dokonać kompromisu między czasem potrzebnym do uzyskania obrazu a szybkością procesów biologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, im wyższa rozdzielczość, tym więcej skanowanych kanałów fluorescencyjnych i im większe pole skanowania, tym więcej pikseli na obraz. Grubsze stosy Z przekładają się na dłuższy czas obrazowania. Dłuższy czas obrazowania zwiększa ryzyko wystąpienia artefaktów ruchowych i może spowodować uszkodzenie obrazowanej tkanki. Należy również pamiętać, że skanowanie niektórych etykiet fluorescencyjnych powoduje wybielanie i toksyczność, na co wpływa moc lasera i stężenie nagromadzonego barwnika.
  14. Po zeskanowaniu stos Z można szybko ocenić, klikając "projekcja maksymalna". Stos Z jest automatycznie zapisywany w bazie danych i można zmienić jego nazwę.

6. Analiza danych

  1. W zależności od pierwotnego pytania badawczego, użyj jednego z kilku programów, takich jak ImageJ5, Matlab11 lub Amira, do analizy danych. Kluczowa jest prawidłowa analiza.

Wyniki

Główną cechą obrazowania przyżyciowego (intravital imaging) jest podłużna wizualizacja procesów komórkowych bez inwazyjnej interwencji. W tym celu wykorzystuje się zwierzęta transgeniczne wykazujące konstytutywną lub indukowalną ekspresję markera fluorescencyjnego w interesujących badacza komórkach. Rysunek 2 ilustruje ekspresję znaczników fluorescencyjnych w liniach myszy eNOStag-green fluorescent protein (GFP)9 oraz Rosa-mTmG10. eNOStag-GFP to linia myszy wytworzona wewnętrznie z wykorzystaniem skróconego genu eNOS jako znacznika dla GFP. Co istotne, eNOS jest silnie eksponowany w komórkach śródbłonka, a sygnał GFP jest wyraźnie widoczny w aparacie Golgiego oraz w błonie komórkowej (Rysunek 2A). Myszy Rosa-mTmG posiadają allel reporterowy Cre o dwóch kolorach fluorescencji skierowany do błony. Linia ta wykazuje fluorescencję mTomato w szerokim zakresie komórek oraz mGFP w komórkach wykazujących ekspresję rekombinazy Cre i jest powszechnie stosowana do śledzenia linii komórkowych (lineage tracing). Ponieważ fragment guza zostaje przeszczepiony od dawcy nietransgenicznego, fluorescencja czerwona jest wyrażana głównie przez części zrębowe w obrębie guza (np. w błonach komórek naczyniowych, komórek krążących, naciekających komórek krwi oraz fibroblastów związanych z guzem (Rysunek 2B)).

Tworzenie naczyń jest ściśle regulowane, a doskonałym modelem do badania tego procesu jest rozwijająca się siatkówka12,13. Ponadto wzrost naczyń nowotworowych jest procesem kinetycznym, który zasadniczo przypomina rozwój naczyń siatkówki. Jednakże naczynia nowotworowe charakteryzują się brakiem organizacji i, ponieważ guz ulega ciągłemu przebudowywaniu, tak samo dzieje się z naczyniami z nim związanymi. Może to być zaletą podczas wykorzystywania guza jako modelu angiogenezy, gdyż w tym samym guzie i w tym samym czasie często można znaleźć wszystkie stadia rozwoju naczyń. Obejmują one endotelialny front pączkowania wrastający w nieunaczynioną część guza (Rysunek 2C); naczynia uszkodzone (Rysunek 2D) oraz ukształtowane łożysko naczyniowe (Rysunek 2E-I) z dojrzałymi, rozgałęzionymi naczyniami (Rysunek 2E-II). W obszarach tych można jednak znaleźć również angiogenne komórki śródbłonka. Pod wpływem bodźców angiogennych komórka śródbłonka wysuwa filopodia (Rysunek 2E-III) i może przekształcić się w komórkę wierzchołkową (tip cell), wykorzystując te filopodia do skanowania i migracji kierunkowej (Rysunek 2E-IV). Komórka wierzchołkowa migruje do śródmiąższu guza, a za nią podążają dzielące się komórki łodyżkowe (stalk cells). Pojedyncza endotelialna komórka wierzchołkowa posiada w dowolnym momencie kilka filopodiów, które rozszerzają się, cofają i odnawiają, a ich ruch można śledzić za pomocą mikroskopii intravitalnej (Rysunek 2F).

Po drugie, mikroskopia intravitalna może być wykorzystana do oceny formowania się światła naczyniowego na froncie angiogennym, przepływu krwi w obrębie guza oraz ekstrawazacji. W zależności od istniejących w organizmie zwierzęcia endogennych sygnałów fluorescencyjnych można podawać różne związki fluorescencyjne. Przepływ krwi i ekstrawazację można wizualizować przy użyciu Hoechst, fluorescencyjnych dekstranów lub FITC-BSA. Do rozszerzonych badań nad przepływem krwi i ekstrawazacją cząstek można zastosować długo krążące, znakowane fluorescencyjnie pegylowane nanocząstki o rozmiarze 100 nm. Szczegóły dotyczące przygotowania tych nanocząstek znajdują się w poprzedniej publikacji5. Zastosowanie tych związków przedstawiono na Rysunku 3. Wyraźnie widać komórki wierzchołkowe śródbłonka u myszy Rosa-mTmG naciekające tkankę guza. Funkcjonalny przepływ krwi jest wykazany przez purpurową fluorescencję systemicznie wstrzykniętych nanocząstek w świetle naczyń krwionośnych (Rysunek 3A-I). Nanocząstki docierają w pobliże komórek wierzchołkowych śródbłonka, co obrazuje formowanie się światła w obszarze komórek łodyżkowych (Rysunek 3A-II). Dostarczanie systemicznie podawanych leków chemioterapeutycznych zależy od funkcjonalnego układu naczyniowego, aby mogły one dotrzeć do śródmiąższu guza, a jak pokazano na Rysunku 3B, wstrzykiwane substancje, niezależnie od ich wielkości, nie przenikają do obszarów z zniszczonymi naczyniami, naczyniami uciśniętymi lub naczyniami z zastojem krwi.

W większości narządów wyściółka śródbłonka tworzy funkcjonalną barierę między krwią a leżącą pod nią tkanką, a transport cząsteczek jest ściśle regulowany. Wiadomo jednak, że naczynia krwionośne związane z nowotworem są nieszczelne, a próg wielkości porów zależy w znacznym stopniu od typu nowotworu14. W celu oceny przepływu krwi, przepuszczalności i ekstrawazacji można wstrzyknąć dekstrany sprzężone z fluoroforami o różnych rozmiarach. Hoechst (615 Da) szybko dyfunduje do tkanki nowotworowej i jest pobierany przez otaczające komórki (Rycina 3C-I). Krótko po wstrzyknięciu w krwi stwierdza się obecność dekstranu 10 KDa (Rycina 3CII) oraz 2 MDa (Rycina 3C-III). Jednak dekstran 10 KDa jest widoczny również w śródmiąższu nowotworu, co wskazuje na przepuszczalność wyściółki śródbłonka dla mniejszych cząsteczek, co jest cechą przypisywaną naczyniom nowotworowym. 40 min po wstrzyknięciu (Rycina 3C-IV) dekstran 10 KDa zostaje usunięty z krwiobiegu (Rycina 3C-V), a intensywność fluorescencji dekstranu 2 MDa również ulega zmniejszeniu (Rycina 3C-VI). Jednak duże dekstrany nie są obecne w śródmiąższu nowotworu, co wykazuje brak przepuszczalności dla dużych cząsteczek w tym przedziale czasowym. 

Patofizjologia guza, z jego obszarami o wysokiej proliferacji, martwicą i brakiem unaczynienia, może dostarczyć cennych informacji podczas wykorzystywania go jako modelu angiogennego. Stanowi to jednak problem w kontekście skutecznej terapii i badań. Heterogeniczność unaczynienia związanego z nowotworem powoduje niejednorodne rozprzestrzenianie się podawanych leków, co sprawia, że całe obszary pozostają wolne od preparatu15. Aby poprawić dostarczanie leków, można zastosować kilka strategii15,16,17, a postępy terapeutyczne można badać przy użyciu tego modelu intravitalnego. Unaczynienie związane z nowotworem można modyfikować za pomocą czynników wazoaktywnych, aby usprawnić dostarczanie leków17. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki manipulacji naczyniami guza z wykorzystaniem czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF) jako czynnika wazoaktywnego w połączeniu z Doxil, liposomalną formą doksorubicyny, jako środka chemioterapeutycznego5,18,19. W przeciwieństwie do dekstranów, nanocząsteczki pegylowane są zaprojektowane tak, aby krążyć w układzie krwionośnym przez kilka godzin, a nawet dni20.

Jak wspomniano wcześniej, obszar guza można wstępnie przeskanować, aby zidentyfikować odpowiednie miejsca w zależności od pytania badawczego. Losy leku można oceniać w obszarach z funkcjonalnym układem naczyniowym w porównaniu z obszarami z już uszkodzonym łożem naczyniowym (dane niepokazane). Aby zbadać losy środków chemoterapeutycznych bez interferencji cytotoksycznej, jako model leku można zastosować nanocząsteczki o takim samym składzie jak środek terapeutyczny. Zwierzę eNOStag-GFP poddano dożylnemu podaniu tych nanocząsteczek i obrazowano 24 h później. Nanocząsteczki wciąż znajdowały się w naczyniach krwionośnych, z minimalną ekstrawasacją do śródmiąższu guza (Rysunek 4A-I). Jednakże, gdy nanocząsteczki podano w połączeniu z TNF, zaobserwowano ekstrawasację z krwiobiegu do śródmiąższu guza (Rysunek 4A-II), co zwiększyło dostarczanie leku do wnętrza guza. Dzięki zastosowaniu obiektywów o wysokiej rozdzielczości można rozpoznać wewnątrzkomórkową lokalizację związku, co pokazano tutaj poprzez lokalizację jądrową Hoechst w zielonych komórkach śródbłonka i komórkach śródmiąższu guza (Rysunek 4B). Co więcej, ponieważ wiele środków chemoterapeutycznych, takich jak doksorubicyna, interpoluje się z DNA, można ocenić lokalizację tych związków. Doksorubicyna posiada właściwości czerwonej fluorescencji, a nanonośnik może zostać oznakowany np. nadchloranem tetrametyloindotricarbocyaniny (DiD). Zwierzę eNOStag-GFP otrzymało dożylnie Doxil-DiD w połączeniu z TNF, a obrazy wykonano 24 h po leczeniu. Doxil-DiD przesączył się z naczyń krwionośnych i został wchłonięty przez otaczającą tkankę guza (Rysunek 4C-I). Bardziej szczegółowa ocena poszczególnych komórek (Rysunek 4C-II) wykazała, że nośnik znajduje się w cytoplazmie, podczas gdy uwolnioną doksorubicynę zaobserwowano w jądrze komórkowym.

figure-results-1
Rysunek 1: Instrumenty, komora fałdu skóry grzbietowej oraz konfiguracja sprzętu niezbędna do przeprowadzenia procedury. (A) Fragmenty guza (a) i instrumenty chirurgiczne potrzebne do implantacji. Instrumenty niestandardowe to dziurkacz do uszu (b), mikrośrubokręt (c) i zgięta igła (d). (B) Okno komory fałdu skóry grzbietowej. Okno przednie (a) i tylne (b) (strzałka: otwory na szwy; grot strzałki: otwory na śruby), 2 śruby (c), 2 nakrętki (d), 1 szkło wypełniające (e), 2 szkiełka nakrywki (f) i 2 pierścienie mocujące (g). W razie potrzeby można również stosować pierścienie mocujące bez haczyków (biały grot strzałki). (C) Specjalnie wykonany uchwyt komory (a), śruby do mocowania komory do uchwytu (b), platforma z kontrolą temperatury (c), śruby do mocowania uchwytu komory do platformy (d) oraz uchwyt z rurką do znieczulenia (e). (D) Zwierzę zamocowane w uchwycie komory na platformie. W obszarze widoku okna widoczny jest guz B16BL6 (strzałka). (E) Sprzęt niezbędny do oceny intravitalnej. Komputer z oprogramowaniem do obrazowania i sterowania mikroskopem (a), standardowe światło fluorescencyjne (b) oraz mikroskop. Zastosowano konfokalny mikroskop wielofotonowy (c) z urządzeniem do znieczulenia (d). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Autofluorescencja zwierząt transgenicznych. Wszystkie przedstawione obrazy są projekcjami stosu Z o grubości od 50 do 70 µm. (A) W linii eNOSGFP-tag GFP jest eksprymowane w aparacie Golgiego (gwiazdka) i błonie komórkowej (strzałka) komórek śródbłonka. Pasek skali = 100 µm. (B) Wewnątrznowotworowa ekspresja mTomato w linii Rosa-mTmG występuje głównie w błonie komórkowej komórek naczyniowych (strzałka) i komórek krwi (gwiazdka). Pasek skali = 100 µm. (C) Projekcja rosnącego frontu angiogennego w nieunaczyniony nowotwór. Pasek skali = 100 µm. (D) Projekcja fragmentu guza z naczyniami uformowanymi i uszkodzonymi (gwiazdka). (E) Projekcja uformowanego unaczynienia guza (EI) pokazująca dojrzałe naczynia (EII); angiogenne komórki wierzchołkowe śródbłonka z filopodiami (EIII, grot strzałki); oraz dojrzałe naczynie, z którego pojedyncza komórka śródbłonka wysuwa filopodium (EIV, grot strzałki) do przestrzeni śródmiąższowej. Pasek skali = 100 µm. (F) Ruch filopodiów obserwowany przez 1 h. Co 15 min wykonywano stos Z; tutaj przedstawiono projekcję maksymalną. Filopodia wydłużają się (biała strzałka), pozostają w bezruchu (=), cofają się (czerwona strzałka) lub całkowicie zanikają (-). Pasek skali = 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Podawanie znaczników wstrzykiwalnych w celu zobrazowania ekstrawazacji i przepływu krwi. (A) Myszy Rosa mTmG wstrzyknięto fioletowe nanocząsteczki fluorescencyjne, a po 10 min wykonano obrazowanie Z-stack frontu naciekającej komórki wierzchołkowej (AI). Projekcja wykazująca, że większość pąków śródbłonkowych posiada funkcjonalne światło (AII, strzałka). Jedynie rzadko można zaobserwować pąki śródbłonkowe bez przepływu (AII, grot strzałki). Pasek skali = 250 µm. (B) Ta projekcja Z-stack przedstawia obszar zniszczonego naczynia nowotworowego u zwierzęcia eNOStag-GFP przed leczeniem (BI). Zwierzęciu wstrzyknięto nanocząsteczki (fioletowe, BII) oraz Hoechst (niebieski, BIII). Nanocząsteczki i Hoechst nie docierają do obszarów zniszczonych, co jest wskazane przez ziarniste szczątki komórkowe wciąż wykazujące ekspresję GFP. Pasek skali = 250 µm. (C) Myszy eNOStag-GFP wstrzyknięto dwa dekstrany o różnych rozmiarach (czerwony = Dekstran 2 MDa; fioletowy = dekstran 10 KDa) oraz Hoechst (niebieski = 615 Da); tutaj przedstawiono obrazy z pojedynczej płaszczyzny. 10 min po wstrzyknięciu na tym samym obrazie widoczna jest obecność w krwi oraz ekstrawazacja. Hoechst ulega ekstrawazacji niemal natychmiast z naczyń krwionośnych i jest pobierany przez komórki otaczające (CI). Dekstran 10 KDa (CII) jest widoczny w naczyniach i w śródmiąższu guza. Dekstran 2 MDa (CIII) znajduje się w naczyniach. 40 min po wstrzyknięciu (CIV) Dekstran 10 KDa znika z krwi (CV), a intensywność fluorescencji Dekstranu 2 MDa również uległa zmniejszeniu (CVI). Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Badanie losów środków chemioterapeutycznych. (A) Zwierzę eNOStag-GFP zostało poddane dożylnemu leczeniu nanocząsteczkami, a obrazowanie wykonano 24 h później. Nanocząsteczki wciąż znajdują się w naczyniach, przy minimalnej ekstrawasacji do śródmiąższu guza (AI). Po połączeniu nanocząsteczek z TNF obserwuje się ekstrawasację z krwiobiegu do śródmiąższu guza (AII). Pasek skali = 250 µm. (B) Przy użyciu soczewek o wysokiej rozdzielczości można rozpoznać cytoplazmę śródbłonka (zielony) i jądro (niebieski) pojedynczej komórki. Pasek skali = 50 µm. (C) Zwierzę eNOStag-GFP otrzymało dożylnie Doxil-DiD w połączeniu z TNF, a obrazy wykonano 24 h później. Tutaj wyraźna jest ekstrawasacja Doxil-DiD z naczyń do śródmiąższu guza (CI). Bardziej szczegółowa ocena pojedynczych komórek (CII) wykazuje, że fioletowy nośnik znajduje się w cytoplazmie (strzałka), podczas gdy uwolniona doksorubycyna (czerwony) jest widoczna w jądrze komórkowym (grot strzałki). Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ponieważ rozwój guza i naczyń nowotworowych, a także efekty terapeutyczne nowotworu, są procesami wysoce dynamicznymi, ocena przyżyteczna jest eleganckim narzędziem do prawidłowej oceny tych procesów w sposób zależny od czasu i przestrzeni. Wraz z rosnącą dostępnością markerów żywych komórek, tworzeniem transgenicznych zwierząt i postępem w metodach obrazowania, obrazowanie przyżyciowe staje się coraz bardziej popularne. Chociaż histologia jest nadal rutynowo stosowana, a wiele markerów może być używanych do identyfikacji komórek i struktur, sekcjonowanie tkanek ma wady podczas badania procesów dynamicznych. Wymagana jest sekcja tkanki, dostarczająca tylko informacji statycznych; utrwalenie wpływa na jakość tkanki; a krojenie uszkadza interakcje komórkowe. Ponadto, podczas badania procesów dynamicznych, rozbiór tkanek w różnych, często przypuszczalnych, punktach czasowych wymaga dużej liczby zwierząt. Dzięki obrazowaniu przyżyciowemu wymiary przestrzenne XYZ i dodatkowy wymiar czasu mogą być oceniane u tego samego zwierzęcia, co umożliwia prawidłowe umiejscowienie różnych graczy w przestrzeni i czasie. Dzięki temu nie brakuje optymalnych punktów czasowych, a liczba zwierząt użytych w jednym eksperymencie jest znacznie zmniejszona. Po drugie, okno czasowe ustalone dla oceny przyżyciowej można ekstrapolować w celu optymalizacji ekstrakcji tkanek. Po trzecie, pożądany etap wzrostu naczynia można zidentyfikować dożylnie i wybarwić jako całą tkankę.

Wspomniany w tym manuskrypcie projekt przyżyciowy wykorzystuje kombinację transgenicznych zwierząt wyrażających znacznik fluorescencyjny w komórkach śródbłonka, zmodyfikowany model komory grzbietowego fałdu skórnego oraz dedykowany mikroskop wielofotonowo-konfokalny.

Komórki śródbłonka przechodzą przez szereg etapów21,22 podczas angiogenezy, a etapy te często można zaobserwować jednocześnie w guzie. Za pomocą mysiej linii eNOSTag-GFP można śledzić poszczególne komórki śródbłonka, a nawet śledzić dynamikę filopodiów. Jest to zatem dobry model do badania rozwoju naczyń krwionośnych w trybie dożylnym. W zależności od już obecnych wewnętrznych etykiet, wstrzykiwane środki fluorescencyjne mogą być używane do oceny tworzenia światła, przepływu krwi, wynaczynienia i klirensu krwi. Mysz jest obrazowana w sposób ciągły przez maksymalnie 5 godzin. Długoterminowa ocena zwierzęcia jest możliwa, gdy podjętych zostanie kilka środków ostrożności dotyczących znieczulenia zwierzęcia, co zostało opisane wcześniej23. Ponieważ badania te koncentrują się na raku, wszczepiono tkanki lub komórki nowotworowe. Eksperymentowaliśmy jednak również z kośćmi śródstopia i płucami embrionalnymi. Jednak tempo wzrostu badanej tkanki jest ograniczone, ponieważ po kilku tygodniach skóra zaczyna odrastać, co może stanowić problem w przypadku wolno rosnących guzów lub tkanek.

W fazie walidacji komora okienna grzbietowego fałdu skórnego została znacznie zmodyfikowana w porównaniu z klasycznym modelem4. Ramki są zbudowane z materiału syntetycznego, który można sterylizować w autoklawie, są lekkie i małe, z dużą powierzchnią okienną. Hak pierścienia ustalającego (rysunek 1Bg, biały grot strzałki) służy wyłącznie do łatwego zdejmowania pierścienia. Pierścienie ustalające bez haczyków mogą być używane, gdy zakłócają one obrazowanie. Skóra nie jest zbytnio rozciągnięta, w tym modelu nie dochodzi do obluzowania, a infekcje są rzadko spotykane. Modyfikacje te zmniejszają dyskomfort zwierząt i znacznie udoskonalają procedurę na zwierzętach. Ponadto metalowe części można łatwo usunąć podczas obrazowania guza za pomocą MRI24.

Każdy mikroskop może być przystosowany do dożylnego obrazowania grzbietowych komór fałdów skórnych. Głównym wymaganiem jest dostępna przestrzeń między stolikiem mikroskopu a soczewką obiektywu. Ważnym aspektem, który wpływa na obrazowanie, jest ruch. Aby zapobiec artefaktom ruchu, należy użyć platformy, która mieści się w stole mikroskopu (po wyjęciu wszystkich wkładek) i podtrzymuje mysz. Nie ma potrzeby powstrzymywania myszy, gdy jest pod narkozą, i lepiej pozwolić myszy swobodnie oddychać. Jednak okno jest przykręcone do platformy, co zapewnia optymalne utrwalenie pola widzenia (tj. guz jest widoczny przez komorę okienną). Platforma jest podgrzewana za pomocą elektronicznej poduszki grzewczej, która służy do ogrzewania zwierząt. Platforma ta została wykonana we własnym zakresie, a szczegóły można uzyskać na życzenie. Soczewka obiektywowa o wysokiej rozdzielczości jest niezbędna przy ocenie procesów wewnątrzkomórkowych i umożliwia rozróżnienie cytoplazmy od jądra. Zaleca się stosowanie soczewki stożkowej o dobrej rozdzielczości optycznej (wysoka NA), ale stosunkowo dużej odległości roboczej (najlepiej 2 mm lub więcej). Ograniczeniem w obrazowaniu jest głębokość penetracji i intensywność fluorescencji etykiet. Ponadto podczas obrazowania należy unikać fotowybielania, fototoksyczności i nasycenia.

W tym przypadku wykorzystano zintegrowany konfokalno-wielofotonowy mikroskop oraz mikroskop konfokalny. Wielofoton jest pionowy, podczas gdy konfokalny jest mikroskopem odwróconym. Zaletą mikroskopu pionowego jest łatwe korzystanie z soczewek zanurzonych w wodzie. Obiektywy te charakteryzują się dużą NA, a także dużą odległością roboczą, nawet przy dużym (np . 20 lub 40x) powiększeniu. W szczególności zaleca się zaopatrzenie się w soczewkę zanurzeniową 20X NA 1.0, która jest sprzedawana przez kilka firm. Należy pamiętać, że w przypadku stosowania soczewek zanurzeniowych soczewkę obiektywu i płyn zanurzeniowy należy podgrzać do temperatury 37 °C. Aby uzyskać najlepsze obrazy, zaleca się stosowanie optymalnych ustawień konfokalnych (tj. otworek na 1 jednostce przewiewnej, moc lasera tak niska, jak to możliwe, niezbyt wysokie wzmocnienie (zwłaszcza jeśli wzmocnienie wprowadza szum), maksymalna prędkość linii i brak uśredniania skanów). Prześwietlenie, nasycenie i różnica w intensywności między obrazami pogarszają jakość danych. Zaleca się, aby zapobiec nasyceniu i nadmiernej ekspozycji. Można to obejść, pozyskując obrazy przy różnych ustawieniach wzmocnienia. Zmiana wzmocnienia to najprostszy sposób na zmianę jasności obrazu. W razie potrzeby moc lasera można regulować. Aby ujednolicić jakość obrazu, można stosować preparaty o stałej intensywności fluorescencji. Należy pamiętać, że nawet jeśli mikroskop jest ustawiony optymalnie, jakość obrazu zależy w dużej mierze od jakości komory okiennej i tkanki

Podczas jednoczesnego skanowania wielu markerów fluorescencyjnych należy unikać przebijania, w którym jeden fluorofor jest wykrywany w kanale drugiego. Unikaj przebijania, stosując kombinację fluoroforów z minimalnymi nakładającymi się widmami i sekwencyjnym skanowaniem między ramkami. Prezentowane tu obrazy zostały zeskanowane za pomocą 3 skanów sekwencyjnych (ścieżka 1: GFP, DID lub fluor647 z laserem 488 i 633; ścieżka 2: rodamina, Doxil lub mTomato z laserem 543; oraz ścieżka 3: Hoechst z laserem 405).

Pokazano tutaj możliwość oceny kilku etapów rozwoju naczynia nowotworowego, dynamiki komórek wierzchołkowych, tworzenia światła, wynaczynienia i uszkodzenia naczyń. Korzystając z linii eNOStag-GFP, obszary guza ze zniszczonym łożyskiem naczyniowym są łatwo wykrywane przez granulowane resztki komórkowe nadal wykazujące ekspresję GFP. W tych obszarach nie wykryto żadnego środka do wstrzykiwań, co wskazuje na brak przepływu. Oznacza to, że podawane chemioterapeutyki również nie dotrą do tych obszarów. Jednak zniszczenie naczyń może być również skutkiem terapeutycznym. Wstępna ocena guza, mająca na celu sprawdzenie zniszczenia naczynia przed leczeniem, jest warunkiem wstępnym dokładnej oceny terapeutycznej i może być łatwo przeprowadzona przy użyciu tego eksperymentalnego projektu.

Istnieje mnóstwo możliwości, dla których można zastosować mikroskopię przyżyciową, a szczegółowe omówienie wykracza poza zakres tej publikacji. Aby dać krótki wgląd, możliwe zastosowania obejmują badania nad akumulacją chemioterapeutyków w tkance nowotworowej, rozwojem naczyń (np . liczbą naczyń, rozgałęzień i skrzyżowań) oraz przepływem krwi, interakcjami komórka-komórka, celowaniem w komórki i przetwarzaniem wewnątrzkomórkowym, a także przykłady wymienione powyżej i pokazane tutaj. Ponieważ analiza opiera się na fluorescencji, należy pamiętać o wahaniach intensywności spowodowanych jakością okienka lub tkanki. Ponadto, ponieważ tkanka nowotworowa jest stosunkowo gruba, fluorescencja z góry lub z dołu płaszczyzny widzenia ma wpływ na sygnał na obrazie. Ilościową analizę obrazu najlepiej połączyć z obiektywnymi pomiarami. Na przykład, jeśli interesują Cię stężenia leku, usuń tkankę nowotworową z okna po mikroskopii przyżyciowej i określ zawartość leku za pomocą HPLC w celu porównania z obrazami konfokalnymi.

Ocenę odpowiedzi guza można również przeprowadzić przy użyciu tego modelu, ale z pewnymi środkami ostrożności. Trzeba zdać sobie sprawę, że guzy rosną również do wewnątrz, do skóry. Pomiary 3D można wykonać, jeśli penetracja jest wystarczająco głęboka, aby pokryć cały guz. W takim przypadku należy użyć barwników dalekiej czerwieni. Opisana tutaj komora okienna zajmuje się nowotworami w środowisku skóry i ważne jest, aby podkreślić, że okno utrzymuje temperaturę nieco niższą niż normalna temperatura ciała myszy. Dlatego najlepiej jest badać guzy w odpowiednich warunkach mikrośrodowiska, aby potwierdzić badania przyżyciowe z komorą okienną grzbietowego fałdu skórnego. Co ważne, komora grzbietowego fałdu skórnego daje wgląd w kinetykę procesów i mechanizmów, stanowiąc instrumentalną podstawę do doskonalenia terapii. Można również uzyskać dodatkowe informacje na temat biodystrybucji i farmakokinetyki. Klasycznie te badania biodystrybucji są wykonywane poprzez leczenie zwierząt z nowotworami i preparowanie guzów/narządów w celu zmierzenia wchłaniania leku. Korzystając z tego modelu przyżyciowego, można określić lokalizację leku w obrębie guza (tj. wewnątrznaczyniową, wewnątrznowotworową, wewnątrzkomórkową lub jądrową) 5,25,26. Ujawniana jest nie tylko lokalizacja leku, ale także okno czasowe możliwości najbardziej optymalnego wchłaniania .

Korzystając z projektu eksperymentalnego opisanego w tym artykule, można ocenić szeroki zakres parametrów w warunkach czasowych i przestrzennych. W szczególności pokazujemy, że mikroskopia przyżyciowa dostarcza ważnych informacji na temat dynamiki rozwoju naczyń nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Rien van Haperen i Rini de Crom za ich rozwój i darowiznę linii eNOSTag-GFP, Joostowi A.P. Rensowi za pomoc techniczną w pracy ze zwierzętami oraz opiekunom zwierząt za ich pomoc. Wykorzystywane aparaty mikroskopowe są częścią Centrum Obrazowania Optycznego Erasmus i chcielibyśmy podziękować pracownikom OIC za ich służbę. Badanie to było wspierane przez grant DDHK 2000-2224 z Holenderskiego Towarzystwa Onkologicznego, "Vereniging Trustfonds" Uniwersytetu Erazma w Rotterdamie oraz "Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek" i dziękujemy członkom komitetów za ich hojną darowiznę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMSigmaD1145Uzupełniony o 10% FCS
Trypsyna-versene (EDTA)LonzaBE17-161EPrzygotować 0,1% roztwór w PBS, sterylny
PBS
Ramy okienneKostium wykonany
Szkło wypełniające 10 mm, 0,55 mmTechnologie
Szkło nakrywkowe 12mm, grubość#1Thermo Scientific/VWR631-0713
Żel do usuwania słuchu (veet)do skóry wrażliwej
Maść do oczu Zastosowanie
chlorowodorku0,05 mg/kg
AparatO2/Izofluran z komorą i rurką + stożek
strzykawka insulinowa 0,5ml x 12,7mm 29g, zielonaBD
324824 Igły 23G 1 1/4"Braun4657640
Igły 25G 5/8"Braun4657853
Nici Silkan 0,7Nakrętki Braun1134019
Jeveka934 A2 1
Jeveka84 A2 1 10
0,9% NaCl
Mikroskop + oprogramowaniePrzestrzeń między stołem a obiektywem musi być wystarczająco szeroka, aby pomieścić zwierzę
Podgrzewana platforma z kontrolowaną temperaturąWykonany kostium
Uchwyt okiennyKostium wykonany
tetrametylorodamina 2 000 000 MW dekstranInvitrogenD7139100 µ g/mysz
Alexa-fluor 647 10 000 MW dekstranInvitrogenD22914100 µ g/mysz
Hoechst 33342InvitrogenH139925 µ g/mouse
Pegulowane nanocząstkiref 5
LEICA TCS SP5 Mikroskop wielofotonowyLeica
LAS AF SoftwareLeica
Abrisia buprenorfiny anestezjologiczny

Bibliografia

  1. Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
  2. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
  3. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
  4. Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
  5. Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
  6. Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
  7. Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
  8. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  9. van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  11. Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
  12. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
  13. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546(2013).
  14. Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
  15. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  16. Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
  17. Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
  18. Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
  19. Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
  20. Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
  21. Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
  22. Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
  23. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088(2013).
  24. van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
  25. Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
  26. Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komora sk rna na grzbiecieunaczynienie guzamikroskopia konfokalnamyszy transgeniczneznakowanie fluorescencyjnerozw j naczyanaliza przep ywu krwiocena ekstrawazacjiodpowied terapeutyczna

Powiązane artykuły