Artykuł metodologiczny

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55126

⸱

18 marca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Potencjał terapeutyczny mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) jest dobrze udokumentowany, jednak najlepsza metoda przygotowania komórek dla pacjentów pozostaje kontrowersyjna. W tym artykule przekazujemy protokoły umożliwiające efektywne generowanie i podawanie terapeutycznych agregatów sferycznych lub "sferoid" MSCs przygotowanych w warunkach wolnych od ksenotypów do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) są bardzo obiecujące w bioinżynierii i medycynie regeneracyjnej. MSCs mogą być izolowane z wielu dorosłych tkanek dzięki ich silnemu przyleganiu do plastiku hodowlanego tkankowego, a następnie dalej namnażane in vitro, najczęściej przy użyciu płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Ponieważ FBS może powodować, że MSCs stają się immunogenne, jego obecność w hodowlach MSC ogranicza zarówno kliniczne, jak i eksperymentalne zastosowania komórek. Dlatego niezwykle cenne są badania z wykorzystaniem chemicznie zdefiniowanych pożywek wolnych od kseno-wirusów (XF) w hodowlach MSC. Wiele korzystnych efektów MSCs przypisuje się ich zdolności do regulacji stanu zapalnego i odporności, głównie poprzez wydzielanie czynników immunomodulujących, takich jak gen 6 stymulowany czynnikiem martwicy nowotworu (TSG6) i prostaglandyna E2 (PGE2). Jednak MSCs wymagają aktywacji do wytworzenia tych czynników, a ponieważ efekt MSCs jest często przejściowy, pojawiło się duże zainteresowanie odkryciem sposobów wstępnej aktywacji komórek przed ich użyciem, eliminując w ten sposób czas opóźnienia aktywacji in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skutecznej aktywacji lub przygotowania MSCs w trójwymiarowych (3D) kulturach w chemicznie zdefiniowanych warunkach XF oraz podawania tych wstępnie aktywowanych MSCs in vivo. W szczególności najpierw opisujemy metody generowania sferycznych mikrotkanek MSC lub "sferoid" w wiszących kroplach przy użyciu pożywki XF i pokazujemy, w jaki sposób kulki i kondycjonowane podłoże (CM) mogą być zbierane do różnych zastosowań. Po drugie, opisujemy badania przesiewowe ekspresji genów i testy funkcjonalne in vitro, aby szybko ocenić poziom aktywacji MSC w sferoidach, podkreślając potencjał przeciwzapalny i przeciwnowotworowy komórek. Po trzecie, opisujemy nowatorską metodę wstrzykiwania nienaruszonych sferoid MSC do jamy otrzewnowej myszy w celu przeprowadzenia testów skuteczności in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, zawarte w niniejszym dokumencie protokoły przezwyciężają główne wyzwania związane z otrzymywaniem wstępnie aktywowanych MSC w chemicznie zdefiniowanych warunkach XF i zapewniają elastyczny system podawania sferoid MSC do terapii.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) wykazały duży potencjał dla różnych podejść medycyny regeneracyjnej. MSCs zostały początkowo wyizolowane jako składnik zrębowy szpiku kostnego, ale od tego czasu uzyskano je z wielu innych tkanek dorosłych, w tym tkanki tłuszczowej1,2,3. Co ciekawe, główna metoda izolacji wykorzystuje niezwykłą właściwość MSC, polegającą na ścisłym przyleganiu do plastiku hodowli tkankowej w obecności płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Chociaż ta tradycyjna technika izolacji pozwala na łatwą i szybką ekspansję MSCs w kulturze dwuwymiarowej (2D), jest ona również bardzo sztuczna i ignoruje znaczenie natywnego środowiska trójwymiarowego (3D), prowadząc do potencjalnej utraty ważnych cech komórkowych4,5,6. W związku z tym rozpoczęto badania nad MSCs w kulturach 3D, które są bardziej fizjologiczne niż tradycyjne kultury 2D, w poszukiwaniu "utraconych/osłabionych" cech MSC. Co więcej, wzrosło duże zainteresowanie identyfikacją chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli i aktywacji MSC, wolnych od ksenotypów (XF), a tym samym uczynieniem komórek bardziej podatnymi na zastosowania kliniczne.

Opublikowano wiele badań demonstrujących hodowlę 3D MSCs zarówno w biomateriałach, jak i jako sferyczne agregaty lub sferoidy. MSCs w biomateriałach zostały początkowo zaprojektowane z myślą o podejściach inżynierii tkankowej w celu zastąpienia uszkodzonych tkanek rusztowaniami wysiewanymi przez komórki, podczas gdy sferoidalne hodowle MSCs były postrzegane jako sposób na zrozumienie zachowania MSC in vivo po podaniu komórek do terapii w badaniach przedklinicznych lub klinicznych4,5,7. Co ciekawe, MSC tworzą sferoidy spontanicznie, gdy przyleganie do plastiku hodowli tkankowej jest niedozwolone8,9,10. Tradycyjnie, agregacja komórek była ułatwiona za pomocą metod kolb wirujących lub technik nakładania cieczy, metod stosowanych początkowo w biologii nowotworów w celu naśladowania mikrośrodowiska guza. Niedawno pojawiły się dodatkowe metody, które pokazują agregację komórek w szalkach hodowlanych wstępnie pokrytych określonymi substancjami chemicznymi, aby zapobiec przyleganiu komórek do plastiku4,5,6. Jedną z najprostszych i najbardziej ekonomicznych metod generowania sferoid MSC jest hodowla ich w wiszących kroplach, technika, która była często stosowana do produkcji ciał embrionalnych z embrionalnych komórek macierzystych. Dzięki technice hodowli wiszącej zapobiega się przyleganiu komórek do plastiku hodowli tkankowej poprzez zawieszenie komórek w kropli pożywki na spodniej stronie pokrywy naczynia do hodowli tkankowej i umożliwienie grawitacji ułatwienia agregacji komórek w wierzchołku kropli. Wielkością sferoidy można łatwo manipulować, zmieniając stężenie komórek lub objętość kropli, dzięki czemu wiszące kultury kropelkowe są szczególnie łatwe do kontrolowania.

Wczesne badania nad hodowlą 3D MSCs wykazały radykalne różnice w charakterystyce komórek w 3D w porównaniu do ich odpowiedników 2D6,8,9. Jednocześnie raporty wykazały, że korzystne działanie MSCs in vivo zależy od ich zdolności do aktywacji przez sygnały mikrośrodowiskowe i w odpowiedzi do wytwarzania czynników przeciwzapalnych i immunomodulujących11. Co ciekawe, wiele z tych czynników, takich jak prostaglandyna E2 (PGE2), gen 6 stymulowany czynnikiem martwicy nowotworów (TSG6) i czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) było wytwarzanych w znacznie większych ilościach przez sferoidy MSC niż tradycyjne MSC 2D, torując drogę do pomysłu wykorzystania kultur 3D do aktywacji komórek8,12,13. Co więcej, aktywacja genów w hodowlach 3D wydaje się podsumowywać mechanizmy, przynajmniej częściowe, aktywacji komórek po wstrzyknięciu myszom12. Poprzez aktywację MSCs przed ich użyciem w eksperymentach, efekty działania komórek mogą być przedłużone i bardziej widoczne, ponieważ tradycyjny efekt MSC in vivo jest często opóźniony i przemijający i można go opisać jako "uderzenie i ucieczka". W ciągu ostatnich kilku lat ważne badania funkcjonalne z wykorzystaniem sferoid MSC wykazały, że mogą one tłumić reakcje zapalne i modulować odporność in vivo poprzez wpływ na komórki efektorowe, takie jak makrofagi, komórki dendrytyczne, neutrofile i limfocyty T, dzięki czemu sferoidy są atrakcyjną formą zagruntowanych MSCs2,3. Ponadto produkcja cząsteczek przeciwnowotworowych, takich jak interleukina-24 (IL-24) i ligand indukujący apoptozę związaną z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL), jest zwiększona w hodowlach 3D MSC w porównaniu z jednowarstwowymi MSC, zjawisko, które można wykorzystać w celowanych terapiach przeciwnowotworowych8,10,14.

Ponieważ tradycyjna hodowla MSC wymagała nie tylko użycia plastiku do hodowli tkankowych, ale także FBS, trzeba było pokonać kolejną przeszkodę, aby sferoidy MSC stały się bardziej podatne na zastosowanie kliniczne. Aby poradzić sobie z tą przeszkodą, niedawno wykazaliśmy tworzenie się sferoid MSC w określonych, chemicznie zdefiniowanych warunkach XF i ustaliliśmy, że powstałe sferoidy MSC zostały aktywowane w celu wytworzenia tych samych cząsteczek przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych, co sferoidy generowane w warunkach z FBS14. W tym miejscu wyniki te zostały przedstawione w kilku szczegółowych protokołach, które demonstrują generowanie wstępnie aktywowanych MSC w kulturach 3D przy użyciu pożywek XF. Ponadto przedstawiono protokoły, które opisują skuteczne sposoby oceny poziomów aktywacji MSCs w odniesieniu do ich działania przeciwzapalnego, immunomodulującego i przeciwnowotworowego, wraz z praktyczną metodą dostarczania nienaruszonych sferoid myszom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja i rozbudowa MSC

  1. Zdobądź MSCs wczesnego pasażu z Centrum Przygotowania i Dystrybucji Dorosłych Komórek Macierzystych (http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html)15 w postaci zamrożonych fiolek. Alternatywnie, należy wyizolować MSCs z aspiratów szpiku kostnego zgodnie z rutynowym protokołem14 i przechowywać w postaci zamrożonych fiolek.
  2. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną (CCM), która jest minimalną niezbędną pożywką alfa (αMEM) uzupełnioną 15-20% premium select FBS, 2 mM L-glutaminy i 1x penicyliną-streptomycyną. Wysterylizuj pożywkę przez filtrację.
  3. Umieścić 30 ml CCM w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm i inkubować szalkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
  4. Zamrożoną fiolkę zawierającą około 10-6 MSCs inkubować przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. Przenieść zawartość fiolki do naczynia hodowlanego za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i kilkakrotnie przemyć fiolkę 1-2 ml CCM z naczynia w celu wychwycenia pozostałych komórek. Umieść naczynie na noc w odpowiednim inkubatorze.
  6. Ostrożnie umyj kulturę dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami w temperaturze pokojowej (PBS) i odłącz MSCs za pomocą 3 ml wstępnie podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Odklejanie trwa zwykle około 3-4 minut w inkubatorze.
  7. Zneutralizować trypsynę w naczyniu za pomocą 6 ml CCM podgrzanego do temperatury 37 °C i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Połącz z płukaniem PBS, aby zmaksymalizować wydajność komórek.
  8. Odwirować komórki (450 x g) przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
  9. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości CCM i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego.
  10. Wysiewać odpowiednią liczbę szalek o średnicy 150 mm w ilości 100 komórek/cm2 w 30 ml ciepłego CCM i inkubować kultury do około 70-80% zlewania się, zwykle 7 dni ze zmianami podłoża co 2-3 dni i 24-48 godzin przed zbiorem.
  11. Zbierz komórki, jak powyżej, za pomocą trypsyny/EDTA i połącz wszystkie komórki w jedną stożkową probówkę z odpowiednią pożywką. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w małej objętości tego samego podłoża w celu zliczenia komórek. Należy stosować standardowe CCM (zawierające FBS) lub różne dostępne na rynku preparaty pożywek XF, tutaj określane jako XF medium-1 (XFM-1) i XF medium-2 (XFM-2), zarówno z suplementacją albuminy surowicy ludzkiej (HSA, 13 mg/ml), jak i bez niej.

2. Przygotowanie aktywowanych sferoid MSC w 3-D Wiszących Kulturach Kroplowych w warunkach XF

  1. Aby wytworzyć sferoidy składające się z około 25 000 komórek, należy rozcieńczyć zebrane MSC do CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg/ml), XFM-2 lub XFM-2 + HSA (13 mg/ml) w stężeniu 714 komórek/μl.
  2. Odpipetować 35 μl/krople komórek na spodnią stronę odwróconego naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm. Za pomocą pipety wielokanałowej można łatwo pipetować wiele kropli.
    UWAGA: Jeśli pożądane są większe lub mniejsze sferoidy, należy odpowiednio zmienić stężenie komórek lub objętość kropli (25-45 μl).
  3. Przenieś 20 ml PBS o temperaturze pokojowej na dno naczynia i jednym ciągłym i stałym ruchem odchyl pokrywkę zawierającą krople, tak aby krople były skierowane w dół. Ostrożnie umieść pokrywkę na dnie naczynia hodowlanego.
  4. Przenieś szalkę do inkubatora na 3 dni, nie naruszając jej, aby umożliwić odpowiednie złożenie kuli.
  5. Po 72 godzinach rozpocznij zbiór sferoidów, ostrożnie zdejmując pokrywę i odwracając ją tak, aby krople ponownie były skierowane do góry.
  6. Ustaw pokrywkę pod kątem około 10-20° i wepchnij krople zawierające sferoidy do krawędzi płytki za pomocą podnośnika komórek.
  7. Przenieść kulki i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 1 000 μl. Użyj PBS o temperaturze pokojowej i pipety z tą samą końcówką, aby umyć płytkę i zapewnić maksymalny odzysk sferoidów.
  8. W przypadku testów PCR w czasie rzeczywistym (protokół 3) należy odwirować zawiesinę kulki o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Przemyć sferoidy PBS i powtórzyć zarówno etap wirowania, jak i aspiracji. W celu podania zwierzętom (protokół 8) pozwól, aby kulki osiadły na dnie probówki (~3-4 min) bez wirowania.

3. PCR markerów przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych w czasie rzeczywistym

  1. Użyj zestawu do ekstrakcji RNA z kolumnami homogenizatora i zestawem DNazy bez RNaz, aby wyizolować całkowite RNA wolne od DNA z jednowarstwowych MSC (Protokół 1) i sferoidów MSC (Protokół 2), które przemyto PBS i odwirowano.
  2. Poddać lizie co najmniej 100 000 jednowarstwowych MSCs i 20 sferoidów z każdego stanu w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z buforem RLT zawierającym β-merkaptoetanol (1:100).
  3. Dokładnie wymieszane lizaty przenieść do 1,5 ml probówek wolnych od RNaz i umieścić w zamrażarce (-80 °C) na co najmniej 3 godziny, aby wspomóc lizę sferoidalną.
  4. Rozmrozić lizaty komórkowe na lodzie, krótko odwirować i postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji całkowitego RNA ssaków.
  5. Określ ilościowo i oceń jakość wyizolowanego RNA za pomocą spektrofotometru.
  6. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności lub jego odpowiednika zgodnie z instrukcjami producenta, aby wygenerować cDNA do PCR w czasie rzeczywistym.
  7. Umieść próbki cDNA, komercyjnie zaprojektowane startery/sondy PCR w czasie rzeczywistym (testy ekspresji genów) i PCR Master Mix na lodzie. Użyj starterów/sond do GAPDH (kontrola), PTGS2 (COX-2, przeciwzapalne), TNFAIP6 (TSG6, przeciwzapalne), TRAIL (przeciwnowotworowe) i IL-24 (przeciwnowotworowe).
  8. Przygotuj reakcje PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi testów ekspresji genów i szybkiej uniwersalnej mieszanki wzorcowej.
  9. Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym, aby wygenerować dokumenty eksperymentu i przeprowadzić przebieg.
  10. Przeanalizuj dane przy użyciu metody ΔΔCT, obliczając względne zmiany (ilość względna, RQ) w ekspresji genów przy użyciu GAPDH jako kontroli endogennej i jednowarstwowych MSCs jako linii bazowej8,14.

4. Zbiór CM do testów potencjału immunomodulacyjnego i przeciwnowotworowego

  1. Zbierz sferoidy i CM, jak opisano powyżej, do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, używając podnośnika do komórek i pipety, jednak nie myj pokrywek naczyń PBS, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie CM.
  2. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie zebrać bezkomórkowy supernatant za pomocą pipety i przenieść supernatant do probówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Wirować przy 10 000 x g przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie zebrać oczyszczony CM za pomocą pipety i przenieść CM do nowych probówek o pojemności 1,5 ml do przechowywania w zamrażarce (-80 °C). Przygotować podwielokrotności CM przed zamrożeniem, jeśli używa się go do wielu testów.
    UWAGA: Przed wykonaniem dalszych testów stężenie PGE2, dobry wskaźnik potencjału przeciwzapalnego CM, można określić za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie TSG6 można określić za pomocą opublikowanego protokołu14.

5. Test makrofagów do oceny potencjału przeciwzapalnego MSC-CM

  1. Przygotuj pożywkę makrofagową, która składa się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej L-alanylo-L-glutaminę i uzupełnionej 10% premium select FBS i 1x penicylina-streptomycyna. Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę.
  2. Otrzymać zamrożoną fiolkę zawierającą około 106 mysich makrofagów J774 i inkubować fiolkę przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodać 9 ml pożywki makrofagowej i wirować przez 5 minut w temperaturze 200-300 x g i w temperaturze pokojowej.
  4. Odessać supernatant, zawiesić makrofagi w 1 ml pożywki makrofagowej i przenieść makrofagi na 150-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 30 ml pożywki makrofagowej.
  5. Zmieniaj pożywkę co 2 dni i inkubuj komórki w inkubatorze do około 70-80% zlewania się.
    UWAGA: Makrofagi nie przylegają ściśle do szalki Petriego, dlatego należy uważać, aby nie stracić komórek przy zmianie pożywki.
  6. Zbierz makrofagi, rozpylając pożywkę makrofagową na komórki za pomocą pipety. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 200-300 x g i temperaturze pokojowej.
  7. Odessać supernatant i zawiesić komórki w małej objętości pożywki makrofagowej w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru. Dostosuj stężenie do 200 000 komórek/ml za pomocą pożywki makrofagowej.
  8. Aby rozpocząć przygotowanie do testu makrofagów, dodaj 480 μl pożywki makrofagowej do studzienek 12-dołkowej płytki.
  9. Dodać 20 μl pożywki makrofagowej do niestymulowanych studzienek kontrolnych i 20 μl pożywki niekondycjonowanej lub kondycjonowanej przez MSC, przygotowanej powyżej, w studzienkach doświadczalnych. Wymieszaj pożywkę w studzienkach, stukając w płytkę.
  10. Przenieść 500 μl zawiesiny komórek makrofagów do niestymulowanych dołków kontrolnych makrofagów.
  11. Stymulować pozostałe makrofagi dodatkiem 1:500-1:1,000 0,1 mg/ml lipopolisacharydu (LPS) i inkubować 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Przenieść 500 μl stymulowanych makrofagów do studzienek za pomocą pożywki niekondycjonowanej lub kondycjonowanej przez MSC. Wymieszaj dołki, kilkakrotnie równomiernie kołysząc talerzem.
  13. Przenieś płytkę do inkubatora na 16-18 godzin.
  14. Zebrać pożywkę kondycjonowaną makrofagami i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Przenieś supernatant do nowych probówek i oznacz zawartość czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i interleukiny-10 (IL-10) za pomocą komercyjnych zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Test splenocytów do oceny potencjału immunomodulacyjnego Spheroid-CM

  1. Przygotuj kompletną pożywkę splenocytową, która składa się z pożywki Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, 1x penicyliną-streptomycyną i 2-merkaptoetanolem. Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę.
  2. Pobieraj śledziony od poddanych eutanazji samców myszy BALB/c przez nacięcie przygotowane po lewej stronie brzucha nad śledzioną, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami14. Przenieś śledzionę do sitka komórkowego o wielkości 70 μm, aby wyizolować splenocyty14.
  3. Wyizolować splenocyty/limfocyty, przepychając śledziony przez sitko o średnicy 70 μm na sterylną szalkę Petriego za pomocą miękkiej gumowej/plastikowej końcówki tłoka ze strzykawki o pojemności 2-3 ml14. Użyj zgrzytliwych ruchów okrężnych, aby oddzielić śledziony.
  4. Umyć sitko do komórek kilkakrotnie zimnym PBS i przenieść komórki z płytki Petriego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Napełnić probówkę zimnym PBS i odwirować (500 x g) w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  5. Odessać supernatant i usunąć komórki z erytrocytów przez inkubację z 5-10 ml roztworu do lizy czerwonych krwinek (na śledzionę) przez 5-10 minut.
  6. Zatrzymaj lizę, dodając zimny PBS do probówki i wiruj przez 5-10 minut w temperaturze 500 x g i w temperaturze 4°C.
  7. Zawiesić izolowane komórki w kompletnym pożywce splenocytowej, przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Dodać pożywkę splenocytów do zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 106 komórek/ml
    UWAGA: Ta technika zwykle daje około 3 x 107 splenocytów na śledzionę myszy.
  8. Stymulować odpowiednią liczbę splenocytów za pomocą przeciwciała anty-CD3e 2 μg/ml przez 5 min.
    UWAGA: Wymagana ilość splenocytów zależy od liczby warunków eksperymentalnych określonych przez badacza (patrz krok 6.9). Na każdą próbkę eksperymentalną/studzienkę potrzeba10-6 splenocytów.
  9. Przenieść 106 splenocytów (stymulowanych lub niestymulowanych) do studzienek na 12-dołkowej płytce i dodać niekondycjonowane (kontrole) lub MSC-CM do studzienek po końcowym rozcieńczeniu 1:10-1:20.
  10. Zebrać splenocyte CM po 24 godzinach i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Przenieść supernatant do nowych probówek i oznaczyć zawartość interferonu gamma (IFN-γ) za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Test raka prostaty w celu oceny potencjału przeciwnowotworowego Spheroid-CM

  1. Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową RPMI, czyli pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% FBS, 1x penicyliną-streptomycyną.
  2. Zaopatrzyć się w zamrożoną fiolkę z komórkami raka prostaty LNCaP i inkubować fiolkę przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Przenieść zawartość fiolki do naczynia hodowlanego zawierającego 30 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI za pomocą zmotoryzowanego pipetora i pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Umyć fiolkę kilka razy pożywką z naczynia i umieścić naczynie w inkubatorze.
  4. Tuż przed osiągnięciem zbiegu komórek należy dwukrotnie przemyć hodowlę PBS o temperaturze pokojowej i odłączyć komórki LNCaP za pomocą 3 ml wstępnie podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny/EDTA.
  5. Zneutralizuj trypsynę w naczyniu za pomocą kompletnej pożywki wzrostowej RPMI i przenieś komórki wraz z popłuczynami do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Odwirować komórki przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
  7. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości kompletnej pożywki wzrostowej RPMI i policzyć komórki rakowe za pomocą hemocytometru.
  8. Przenieś komórki LNCaP do 96-dołkowej płytki przy 5,000 komórek / dołku w 120 μl kompletnej pożywki wzrostowej RPMI zawierającej 25% niekondycjonowanego lub sferoidalnego CM. Inkubować w inkubatorze przez 72 godziny.
  9. Aby przeprowadzić test wzrostu komórek przy użyciu zestawu do oznaczania proliferacji komórek, należy odessać pożywkę z dołków i przenieść płytkę do zamrażarki (-80 °C) na co najmniej 3 godziny.
    1. Rozmrozić płytkę i poddać lizie komórki w każdym dołku, dodając 100 μl odczynnika do lizy komórek zawierającego 180 mM NaCl, 1 mM EDTA i 0,2 mg/ml RNazy A.
    2. W przypadku krzywej standardowej należy lizować znane ilości komórek LNCaP, jak opisano powyżej.
    3. Po 1 godzinie dodaj 100 μl 1x buforu do lizy komórek zawierającego odczynnik do testu proliferacji komórek w rozcieńczeniu 1:100 i zmierz fluorescencję w każdym dołku, aby określić ilość komórek.

8. Dootrzewnowe dostarczanie nienaruszonych sferoidów

  1. Przygotować sferoidalne MSC zgodnie z powyższym opisem (protokół 2) i ponownie zawiesić kulki w sterylnym zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) uzupełnionym 0,2-0,5% HSA, aby utrzymać warunki XF. HSA w roztworze pomaga zapobiegać przywieraniu kulek do tworzywa sztucznego podczas wtryskiwania.
  2. Przenieś 40-120 sferoid do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i umyj komórki, dodając do nich 6 ml HBSS/HSA. Odczekaj 3-4 minuty, aż kule opadną. Przygotuj niezależną stożkową rurkę sferoid dla każdego zwierzęcia. W razie potrzeby należy również przygotować dodatkowe probówki ze sferoidami do testów określających retencję sferoidów (patrz 8.18 poniżej) i wytwarzanie czynników terapeutycznych po przeniesieniu (patrz 8.19 poniżej).
  3. Odessać supernatant, nałożyć na sferoidy 100-200 μl sterylnego HBSS uzupełnionego 0,2-0,5% HSA i umieścić probówki na lodzie.
  4. Krótko znieczulić zwierzęta 2% izofluranem w 100% tlenie, aż do ustąpienia odruchu szczypania na około 2 minuty w komorze indukcyjnej.
  5. Umieść zwierzę w szafie BSL-2, grzbietem do dołu (stroną brzuszną skierowaną do góry), z ciągłym przepływem 1,5% mieszaniny izofluranu i tlenu przez stożek nosowy.
  6. Oczyść dolną część brzucha myszy środkiem antyseptycznym, takim jak 70% alkohol.
  7. Zdjąć nasadkę cewnika dożylnego 20 G (iv) i wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą zestawu cewnik-szpilka. Jedną ręką przytrzymaj skórę myszy, a drugą wykonaj wstrzyknięcie. Umieścić punkt wstrzyknięcia mniej więcej w środku sztucznej linii łączącej zgięty staw kolanowy i okolicę narządów płciowych, z końcówką igły skierowaną w stronę linii środkowej.
    UWAGA: Zespół cewnik-szpilka ma większy opór niż zwykła igła, dlatego należy uważać, aby nie wstrzyknąć igły zbyt głęboko w jamę brzuszną, co mogłoby spowodować uszkodzenie narządów wewnętrznych. Podczas zakładania cewnika można wyczuć penetrację skóry, a następnie mięśni/błony otrzewnej.
  8. Delikatnie wyjmij metalową szpilkę/igłę z zespołu cewnik-szpilka. Sprawdź, czy na szpilce nie ma krwi, moczu i kału i wyrzuć ją. Krew na igle wskazuje na nakłucie narządu (narządów wewnętrznych).
  9. Podczas wstrzyknięć należy trzymać plastikowy cewnik w pozycji pionowej, aby umożliwić przepływ płynu.
  10. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika z tworzywa sztucznego, wstrzykując przez cewnik około 100 μl sterylnego HBSS/HSA za pomocą pipety z końcówką o pojemności 100-200 μl. Umieść koniec końcówki pipety w łączniku strzykawki cewnika, tworząc szczelne uszczelnienie. Powoli wstrzyknąć płyn do jamy otrzewnej.
    UWAGA: Płyn w prawidłowo umieszczonym cewniku będzie swobodnie przepływał do jamy otrzewnej przy niewielkiej regulacji cewnika. Niewłaściwe umieszczenie cewnika (podskórnie lub śródjelitowo, lub jeśli końcówka igły uszkodzi narządy otrzewnej, takie jak nerki) zwiększy opór i zmniejszy przepływ. Umieszczenie podskórne spowoduje powstanie oczywistej "bańki" pod skórą.
  11. Zebrać sferoidy MSC, przygotowane w 100-200 μl HBSS/HSA (krok 8.3), za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl i przenieść całą objętość kulek (40-120 kulek) do jamy otrzewnej przez cewnik, jak opisano powyżej.
  12. Przemyć probówkę zawierającą kulki 100 μl HBSS/HSA, używając tej samej końcówki co powyżej, aby zebrać wszelkie resztki sferoid i wstrzyknąć je do jamy otrzewnej.
  13. (Opcjonalnie) Wstrzyknąć dodatkowe 100 μl HBSS/HSA do jamy otrzewnej w celu umycia cewnika.
  14. Umieść gazik nasączony środkiem antyseptycznym na cewniku i powoli wyjmij cewnik z jamy otrzewnej i wyrzuć go.
  15. Delikatnie masuj palcami jamę otrzewnej, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie sferoid.
  16. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie pod ścisłym nadzorem i obserwuj, czy nie ma krwawienia z miejsca wstrzyknięcia.
  17. Sprawdzić, czy w cewniku i probówce o pojemności 15 ml nie pozostały sferoidy. Normalne jest obserwowanie kilku kulek w cewniku/rurce.
    UWAGA: Technika opisana dla dostarczania sferoidów MSC może być zastosowana do stosowania u normalnych zwierząt lub w różnych modelach urazów. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do wstrzykiwania sferoidów w modelach uszkodzenia rogówki myszy i endotoksemii, a także w modelu zapalenia otrzewnej wywołanego zymosanem8.
  18. Aby określić ilościowo liczbę zatrzymanych sferoid (opcjonalnie), użyj zestawu/odczynnika do oznaczania liczby komórek na podstawie DNA. Przytrzymaj zużyty cewnik nad probówką o pojemności 15 ml i energicznie dozuj HBSS/HSA przez cewnik, aby wepchnąć pozostałe kulki z powrotem do probówki 15 ml.
    1. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Przenieść probówkę zawierającą osad sferoidalny do zamrażarki (-80 °C) na co najmniej 3 godziny.
    2. Rozmrozić probówkę i poddać kulki lizie, dodając 500 μl odczynnika do lizy komórek zawierającego 180 mM NaCl, 1 mM EDTA i 0,2 mg/ml RNazy A.
    3. W celu kontroli należy zamrozić i poddać lizie znaną ilość sferoid (najlepiej równoważną liczbie sferoid przygotowanych do pojedynczego wstrzyknięcia), jak opisano powyżej.
    4. Po 1 godzinie przenieś 100 μl lizatu komórkowego, w dwóch egzemplarzach, do 96-dołkowej mikropłytki i dodaj do każdej studzienki 100 μl 1x buforu do lizy komórek zawierającego rozcieńczenie 1:50 odczynnika do oznaczania proliferacji komórek z zestawu. Po 10 minutach zmierz fluorescencję w każdym dołku, aby określić liczbę kulek, które nie zostały wstrzyknięte, porównując próbkę eksperymentalną (próbki) z próbką kontrolną.
  19. Ocenić poziom aktywacji sferoid przygotowanych do wstrzykiwania (opcjonalnie) poprzez pomiar stężenia PGE2 i TSG6 wytwarzanych przez przenoszone kule. Przenieś 40-120 kulek przez cewnik, jak opisano powyżej, do 12-dołkowej lub 6-dołkowej płytki zawierającej 1 lub 2 ml αMEM uzupełnionej 2% FBS i 1x penicylina/streptomycyna. Umieść płytki w inkubatorze na 6 godzin.
    1. Po 6 godzinach przenieść pożywkę z dołków do probówek o pojemności 1,5 lub 15 ml i odwirować probówki o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieść bezkomórkowy supernatant do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i odwirować przy 10 000 x g przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przenieść oczyszczony CM (supernatant) do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i oznaczyć stężenie PGE2 (dobry wskaźnik potencjału przeciwzapalnego CM) za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie TSG6 można określić za pomocą opublikowanego protokołu14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano hodowle w kroplach wiszących do generowania zwartych, sferycznych mikro-tkanek lub „sferoidów” aktywowanych MSC w warunkach XF. Plan badawczy przedstawiony na Rysunku 1 obrazuje, że MSC ulegają samoorganizacji w sferoidy podczas zawieszenia w kroplach wiszących przez 72 hr, po czym sferoidy lub CM wzbogacona o pochodzące ze sferoidów czynniki terapeutyczne mogą zostać zebrane i potencjalnie wykorzystane zarówno w badaniach, jak i w zastosow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Optymalny MSC do stosowania w niektórych zastosowaniach badawczych i klinicznych powinien być wysoce aktywowany, aby zmaksymalizować ich korzyści, i preferencyjnie przygotowany w chemicznie zdefiniowanych warunkach XF, aby zminimalizować dostarczanie potencjalnych antygenów ze składników pożywki ksenogenicznej, takich jak FBS. W opisanych tutaj protokołach pokazaliśmy metody 1) aktywacji MSCs w hodowli 3D poprzez tworzenie sferoidów, 2) osiągnięcia aktywacji 3D MSCs w warunkach XF, 3) oceny poziomów aktywacji sferoidalny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana z grantu P40RR17447 z National Institute of Health oraz RP150637 z Cancer Prevention and Research Institute of Texas. Chcielibyśmy podziękować dr Darwinowi J. Prockopowi za wsparcie w projekcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MEM-α (minimalny niezbędny średni alfa)ThermoFisher/Gibco12561049; 12561056; 12561072minimalna niezbędna pożywka do przygotowania pożywki wzrostowej MSC (CCM)
FBS (płodowej surowicy bydlęcej), premium selectAtlanta BiologicalsS11595; S11510; S11550; S11595-24składnik kompletnych pożywek hodowlanych dla wszystkich typów komórek
L-glutaminaThermoFisher/Gibco25030081; 25030149; 25030164składnik kompletnych pożywek hodowlanych dla wszystkich typów komórek
Penicylina/StreptomycynaThermoFisher/Gibco15070063składnik kompletnych pożywek hodowlanych dla wszystkich typów komórek
Jednostki filtrujące do sterylizacji, 0,22 i mikro; m Membrana PESMilliporeSigmaSCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; Naczynie doz pożywką
NuncD8554  Hodowlakomórkowa
Termo Forma z płaszczem wodnym Inkubator nawilżany CO2Thermo FisherModel 3110inkubacja hodowanych komórek
Wczesne pasażMCS Centrum Przygotowania i Dystrybucji Dorosłych Komórek Macierzystych w Texas A& M Health Science Center College of Medicine Instytut Medycyny Regeneracyjnej w Scott & BiałyNAprzygotowanie kultur 2D i 3D w kąpieli
wodnejVWR89501-468podłoże podgrzewające do 37 ° C
PipetyEppendorf492000904ręczna obsługa cieczy
Pipete-AidDrummond Scientific Company4-000-300obsługa pipet sereologicznych
Sterylna pipeta serologiczna Costar (5, 10, 25 i 50 ml)Corning4487; 4101; 4251; 4490obsługa cieczy
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,4ThermoFisher/Gibco10010023; 10010072; 10010031; 10010049przetwarzanie kultur komórkowych
0,25% roztwór trypsyny/EDTAThermoFisher/Gibco25200056; 25200072; 25200114podnoszenie przylegających komórek i dyspergowanie agregatów komórkowych Rurka
stożkowa 15 ml WirowanieCorning/BD Falcon35209750
ml Rurka stożkowaCorning/BD Falcon352098Wirówka
chłodzeniem Eppendorwirowania komórekEppendorf/Fisher ScientificModel 5810R
Fisher Scientific26716
trypan niebieskiSigma-AldrichT8154Wykluczenie martwych komórek SIGMA podczas zliczania komórek w hemacytometrze
Zdefiniowany ksenowolny MSC medium-1 (XFM-1)ThermoFisher/GibcoA1067501Pożywka wolna od kseno-ksenozy opracowana specjalnie do wzrostu i ekspansji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
Zdefiniowano ksenowolne MSC pożywka-2 (XFM-2)Technologie komórek macierzystych5420Zdefiniowana, wolna od ksenozy pożywka dla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
HSA (albumina surowicy ludzkiej)Gemini800-120Składnik pożywki MSC wolnej od ksenozy
rHSA (rekombinowana albumina surowicy ludzkiej)Sigma-AldrichA9731  SIGMASkładnik pożywek MSC wolnych od ksenoza
Całkowita izolacja RNA Mini KitQiagen74104Ekstrakcja całkowitego RNA
QiashredderQiagen79654Homogenizacja próbki przed ekstrakcją całkowitego
RNA Zestaw DNaz wolnych od RNAz Qiagen79254Eliminacja DNA na kolumnie podczas całkowitej ekstrakcji RNA
β-merkaptoetanol Sigma-AldrichM6250  Hamowanie ALDRICHRNAZ w buforze RLT
VortexVWR97043-562mieszanie próbki
SpektrofotometrBioradNAStężenie i jakość RNA
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermoFisher/Applied Biosystems4368814transkrypcji całkowitego RNA do cDNA
Testy ekspresji genówThermoFisher/Applied BiosystemsZmienna kombinacja startera/sondy do PCR w czasie rzeczywistym
Szybka uniwersalna mieszanka wzorcowa do PCRThermoFisher/Applied Biosystems4352042; 4364103; 4366073; 4367846do reakcji PCR w czasie rzeczywistym
System PCR w czasie rzeczywistym (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)ABI PrizmNAreal-time PCR
1,5 ml probówka wirówkowaEppendorf22364111Wirowanie komórek, pobieranie i przechowywanie próbek
(-80 & deg; C) zamrażarkaThermo FisherModel Thermo Forma 8695do przechowywania próbek
PGE2 (prostaglandyna E2) Zestaw ELISA R& Systemy DKGE004Bszacowanie stężenia cytokin w próbce
DMEM (Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle średni)ThermoFisher/Gibco10566-016; 10566-024; 10566-032pożywka do hodowli makrofagów
J774 makrofagi myszyATCCTIB-67mysia linia komórkowa makrofagów
12-dołkowa płytkaCorning3513in vitro stymulacja makrofagów
LPS (lipopolisacharyd)Sigma-aldrichL4130in vitro stymulacja makrofagów
Mysz TNF-a zestaw ELISAR& D SystemsMTA00Boszacowanie stężenia cytokin w próbce
Mysz IL-10 (interleukina 10) zestaw ELISAR& D SystemsM1000Boszacowanie stężenia cytokin w próbce
Pożywka RPMI-1640 Pożywkahodowli splenocytówThermoFisher/Gibco11875-085
Myszy BALB/cLaboratorium Jacksona651in vivo dostarczanie sferoidów; preparat splenocytu
Anti-Mouse CD3e Klasa funkcjonalna OczyszczonaeBioscience145-2C11in vitro stymulacja splenocytów
70 μ m sitko Corning352350Preparat splenocytów
Roztwór do lizy czerwonych krwinek (1x)Affymetrix eBioscience00-4333usuwanie czerwonych krwinek podczas izolacji splenocytów
Mysz IFN-γ (interferon gamma) Zestaw ELISAR& D SystemsMIF 00ocena stężenia cytokin w próbce
LNCaP komórek raka prostaty ATCCCRL-1740badanie wpływu MSCs 3D na linie komórek nowotworowych in vitro< / em>
DNA Zestaw do oznaczania proliferacji komórek na podstawieThermoFisherC7026liczby komórek na podstawie zawartości DNA
NaClSigma-AldrichS5150składnik odczynnika do lizy
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)ThermoFisherFERR1021chelator wapnia, składnik odczynnika do lizy
Rnaza AQiagen19101Degradacja RNA do pomiaru DNA
Wielomodowy czytnik mikropłytek oparty na filtrzeTechnologia BMGNATesty mikropłytek (ELISA, kwantyfikacja komórek, etc.)
HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejThermoFisher/Gibco14175079Resuspekcja sferoid MSC przed wstrzyknięciami in vivo
IsofluraneMWI Vet Supply502017znieczulenia do wstrzyknięć in vivo
Tlen, sprężony gazPraxairNADo stosowania z izofluranem
Thermo Forma BSL-2szafka Thermo FisherModel 1385Sterylna hodowla komórek
Bezpieczeństwo Cewnik dożylny/szpilka igłowa, 20 G, 1 calTerumoSR*FNP2025Dostarczanie shperoidów do jamy otrzewnej
Sterylne końcówki do mikropipetEppendorfzmieniasposób obchodzenia się z cieczami/komórkami
hodowli komórkowych 150 mm SCGPU11RESIGMA MSC komórek z Hemocytometr do DNA pomiar

Bibliografia

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357(2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
  16. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  17. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  20. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  21. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  22. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  23. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  24. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  25. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  26. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzystetechnika wisz cej kroplipobieranie medium warunkuj cegowstrzykni cie doszpikoweprzesiewowa analiza ekspresji gen wczynniki przeciwzapalneanaliza PGE2ekspresja TSG6

Powiązane artykuły