Method Article

Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

DOI:

10.3791/55127

⸱

February 9th, 2017

 ,  ,  , 
1The Danish Stem Cell Center (DanStem), University of Copenhagen, 2Division of Mathematics, University of Dundee, 3Division of Cell and Developmental Biology, College of Life Sciences, University of Dundee

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zegar segmentacyjny napędza oscylacyjną ekspresję genów w mezodermie presomitycznej (PSM). Dynamiczna aktywność Notch jest kluczem do tego procesu. Wykorzystujemy obrazowanie i analizy obliczeniowe, aby wyodrębnić dynamikę czasową z danych wyrażeń przestrzennych, aby wykazać, że ekspresja liganda Delta i receptora Notch oscyluje w PSM kręgowców.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas somitogenezy, pary somitów nabłonkowych tworzą się w sposób postępujący, pączkując z przedniego końca mezodermy przedsomitycznej (PSM) ze ścisłą specyficzną dla gatunku okresowością. Okresowość procesu jest regulowana przez oscylator molekularny, znany jako "zegar segmentacyjny", działający w komórkach PSM. Zegar ten napędza oscylacyjne wzorce ekspresji genów w całym PSM w kierunku tylno-przednim. Te tak zwane geny zegara są kluczowymi składnikami trzech szlaków sygnałowych: Wnt, Notch i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF). Ponadto sygnalizacja Notch jest niezbędna do synchronizacji oscylacji wewnątrzkomórkowych w sąsiednich komórkach. Niedawno dowiedzieliśmy się, w jaki sposób można to mechanicznie regulować. Po aktywacji liganda receptor Notch zostaje rozszczepiony, uwalniając domenę wewnątrzkomórkową (NICD), która przemieszcza się do jądra i reguluje ekspresję genów. NICD jest bardzo labilny, a jego obrót zależny od fosforylacji działa ograniczając sygnalizację Notch. Wiadomo, że profil produkcji (i degradacji) NICD w PSM jest oscylacyjny i przypomina profil genu zegara. Niedawno informowaliśmy, że zarówno receptor Notch, jak i ligand Delta, które pośredniczą w sprzężeniu międzykomórkowym, same wykazują dynamiczną ekspresję zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W tym artykule opisujemy czułe metody wykrywania i narzędzia do szczegółowej analizy obrazu, których użyliśmy, w połączeniu z zaprojektowanym przez nas modelowaniem obliczeniowym, do wyodrębnienia i nałożenia danych wyrażeń z różnych punktów w cyklu wyrażeń. Pozwoliło nam to na skonstruowanie czasoprzestrzennego obrazu dynamicznego profilu ekspresji dla genów receptora, liganda i zegara docelowego Notch w całym cyklu oscylacji. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowane do generowania i hodowli eksplantatów PSM, a także procedurę barwienia mRNA lub białka. Wyjaśniamy również, w jaki sposób obrazy konfokalne zostały następnie przeanalizowane i czasowo uporządkowane obliczeniowo w celu wygenerowania uporządkowanych sekwencji migawek wyrażeń zegara, zwanych dalej "kymogramami", w celu wizualizacji czasoprzestrzennej ekspresji podobnej do Delta1 (Dll1) i Notch1 w całym PSM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somity są pierwszymi segmentami powstałymi w wydłużającej się osi ciała u rozwijających się gatunków kręgowców i są prekursorami kręgosłupa, żeber i tkanki skóry właściwej, a także komórek mięśniowych i śródbłonka. Podczas somitogenezy somity nabłonkowe tworzą się z niesegmentowanej mezodermy presomitycznej (PSM) (przegląd w odnośniku 1). Proces ten jest regulowany przez "zegar segmentacyjny", który składa się z sieci oscylujących genów i białek, w większości należących do szlaku sygnałowego Notch. Zegar segmentacyjny składa się z różnych pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego, które umożliwiają pulsacyjną produkcję aktywności Notch w obrębie pojedynczej komórki2 (przejrzane w Bibliografia 3 - 6). Chociaż wewnątrzkomórkowa metoda oscylacji jest dobrze scharakteryzowana, nadal w dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób te oscylacje są koordynowane w tkance PSM. Niedawno wykazano, zarówno w badaniach eksperymentalnych, jak i teoretycznych, że oscylacje te są niezbędne w procesie somitogenezy i że szlak Notch odgrywa kluczową rolę w procesie zarówno segmentacji, jak i oscylacyjnej ekspresji genów7,8. Jednak powszechnie donoszono, że receptor Notch 1 (Notch1) i ligand podobny do delta (Dll)-1 mają gradienty statyczne w klasie PSM9,10,11.

Postawiliśmy hipotezę, że zależne od Notch oscylacje zegara segmentacji PSM zależą od okresowej aktywacji głównego receptora szlaku Notch i liganda, Notch1 i Dll1, odpowiednio, w poprzek mysiego PSM. Wnioski z poprzednich badań, które wykazały statyczny gradient rostralno-ogonowy tych białek, wynikały, jak przewidujemy, z braku czułości w technikach barwienia immunologicznego. W związku z tym nie byli w stanie wykryć niskich wahań poziomu Dll1 i Notch1 w ogonowym PSM.

Opracowaliśmy metodę dokładniejszego zbadania tych czynników, łącząc dane eksperymentalne z modelowaniem matematycznym, aby przewidzieć mechanizm, za pomocą którego oscylacje białek komponentów zegara są koordynowane w PSM12.

Ogólnym celem tej metody jest wykrycie i ilościowe określenie niskopoziomowej, dynamicznej ekspresji białek w PSM oraz mapowanie profili ekspresji interesujących białek zgodnie z ekspresją znanego genu zegarowego, Lunatic Fringe (Lfng). Ponieważ jeden cykl zegara segmentacyjnego w zarodku myszy trwa 2 godziny, do zbudowania pełnego profilu czasoprzestrzennego ekspresji białka Dll1 i Notch1 podczas jednej oscylacji Lfng w PSM potrzebne są różne próbki. W związku z tym opracowaliśmy ten protokół, aby umożliwić wysokoprzepustowe wykrywanie niskopoziomowej ekspresji białek w całych, przeciwstawnych eksplantatach PSM. Jednak technika ta może być również przydatna w badaniach, które mają na celu scharakteryzowanie dynamiki białek niskiego poziomu w dowolnej tkance embrionalnej, którą można podzielić na przeciwległe połówki.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na podstawie licencji projektu o numerze 6004219 przy ścisłym przestrzeganiu Ustawy o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. oraz Kodeksu postępowania brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych dotyczącego wykorzystywania zwierząt w procedurach naukowych.

1. Sekcja eksplantatów PSM

  1. Tkankę ogona należy uzyskać z zarodków powstałych w wyniku krzyżowania w określonym czasie myszy typu dzikiego (CD1) 13. Krótko mówiąc, w 10,5 dniu embrionalnym (E) należy poddać eutanazji ciężarną mysz-dawczynię w komorze na dwutlenek węgla. Zbierz róg macicy i umieść go w 1x sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) zgodnie z procedurami licencji Home Office lub równoważnymi przepisami lokalnymi. Przenieś róg macicy do naczynia do hodowli tkankowej zawierającej świeży, sterylny PBS. Wykonaj wszystkie kolejne kroki sekcji w tym roztworze.
  2. Pod mikroskopem stereoskopowym przetnij grubą błonę mięśniową rogu macicy za pomocą zakrzywionych nożyczek i ostrożnie usuń każdy zarodek za pomocą cienkich kleszczy. Uważaj, aby upewnić się, że tkanka ogona nie zostanie uszkodzona w tym procesie. Za pomocą zakrzywionych nożyczek i cienkich kleszczy wypreparuj worek owodniowy z każdego zarodka, uważając, aby nie uszkodzić zarodka.
  3. Użyj igły chirurgicznej lub zakrzywionych nożyczek, aby pobrać tkankę ogona każdego zarodka, przecinając zarodek z tyłu do zawiązków kończyn tylnych.
  4. Zrównoważ tkankę ogona brzusznie do dołu za pomocą kleszczy i igły. Wygeneruj pary eksplantatów PSM z każdego ogona embrionalnego, preparując tkankę ogona na dwie połówki wzdłuż linii środkowej; Wykonaj delikatny ruch kołyszący igłą. Upewnij się, że cewa nerwowa, struna grzbietowa i tkanka PSM są równo podzielone między dwa eksplantaty.
  5. Odpipetować każdy przeciwległy eksplant PSM na spodniej stronie plastikowej pokrywki naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm w małej objętości wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej (DMEM-F12 + 0,1% substytut L-glutaminy uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą, 10 nM ludzkim Bfgf i 1% penicyliną/streptomycyną).
  6. Umieść naczynie na górze pokrywki i szybko odwróć je tak, aby tkanka PSM była zawieszona na pokrywce w "wiszącej kropli" pożywki. Hodować eksplantaty PSM w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 - 2 godziny.
  7. Przenieś pary eksplantatów PSM do poszczególnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub 4 °C przez noc (O/N). UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i podczas pracy z tym roztworem należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa.
    UWAGA: Wszystkie kolejne etapy mycia i inkubacji należy wykonać na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
  8. Umyć studzienki na próbkę w PBS w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej, używając cienkiej plastikowej pipety Pasteura w celu wymiany roztworu PBS na próbkach na świeże PBS 3-4 razy. Przetwarzaj jeden eksplant PSM z każdej pary za pomocą immunohistochemii (krok 2), a drugi za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ dla znanego genu zegarowego (krok 3).

2. Immunohistochemia eksplantatów PSM

  1. Przemyć jeden eksplant PSM z każdej pary zarodków wytworzonych w kroku 1 w 2% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na platformie bujanej, a następnie krótko przepłukać próbki w PBS. Zastąp PBS na próbkach roztworem blokującym (2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 10% normalnej surowicy koziej (NGS) w PBS + 0,1% Tween-20) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C na platformie bujanej.
    UWAGA: Wszystkie kolejne mycia i etapy inkubacji w tej sekcji muszą być wykonywane w temperaturze pokojowej na platformie bujanej, chyba że zaznaczono inaczej. Roztwory myjące można łatwo wymieniać za pomocą plastikowej lub szklanej pipety Pasteura z cienką końcówką.
  2. Rozcieńczyć pożądane pierwszorzędowe przeciwciało/przeciwciała w buforze roboczym (0,1% BSA, 0,3% NGS i 0,2% Triton X-100 w PBS). W tym przykładzie rozcieńczyć przeciwciała Dll1 i Notch1 w stosunku 1:25 w buforze roboczym.
    UWAGA: Optymalizacja będzie wymagana w celu określenia odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia wymaganego na tym etapie, jeśli stosowane są alternatywne przeciwciała.
  3. Inkubować eksplantaty w roztworze przeciwciała przez 3-5 dni w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. Należy pamiętać o dołączeniu niektórych próbek z buforem roboczym niezawierającym przeciwciał pierwszorzędowych, które działałyby jako kontrole przeciwciał drugorzędowych.
  4. Odzyskać roztwór przeciwciała pierwotnego w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Odzyskane przeciwciało pierwszorzędowe może być używane kilka razy, w zależności od użytego przeciwciała.
  5. Wykonać 2 przemycia próbek przez 5 - 10 minut każde w PBS, a następnie 3 płukania po 10 minut każde w 2% Triton X-100 w PBS w temperaturze pokojowej na platformie bujanej.
  6. Rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie drugorzędowe przeciwciało/przeciwciała (epitopowo dopasowane do użytego pierwszorzędowego przeciwciała/przeciwciał) w buforze roboczym. Opcjonalnie dodaj 20 μg/ml Hoechst 33342 do tego roztworu, aby przeciwdziałać barwieniu jąder.
    UWAGA: Optymalizacja może być wymagana w celu określenia odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia wymaganego na tym etapie. W tym przykładzie zwykle stosowano współczynnik rozcieńczenia 1:400.
  7. Odwirowywać roztwór przeciwciał drugorzędowych przez 10 minut przy 16 x g, aby zapobiec tworzeniu się agregatów przeciwciał. Dodać 250 - 500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej próbki, uważając, aby nie zużyć ostatnich kilku mikrolitrów roztworu, który może zawierać agregaty przeciwciał.
  8. Przykryj płytkę próbki folią aluminiową, aby zminimalizować ekspozycję na światło i inkubuj próbki w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 3-5 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.
  9. Przed zamontowaniem próbki należy je myć dwukrotnie przez 10 minut każda w 0,1% Tween-20 w PBS (PBST) i raz przez 5 minut w PBS w temperaturze pokojowej na platformie bujanej (patrz krok 4).

3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) eksplantatów PSM

  1. W przypadku przechowywania w alternatywnym naczyniu, pozostałe kontralateralne eksplantaty PSM należy przenieść do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
  2. Myj próbki przez 10 minut w 50% etanolu w PBST, a następnie wykonaj 2 płukania przez 10 minut każde w 100% etanolu na platformie bujanej w temperaturze pokojowej w celu odwodnienia tkanki.
    UWAGA: Wszystkie kolejne mycia i etapy inkubacji w tej sekcji muszą być wykonywane w temperaturze pokojowej na platformie bujanej, chyba że zaznaczono inaczej.
  3. Ponownie nawodnić tkankę, myjąc przez 10 minut w 50% etanolu w PBST, a następnie myjąc dwukrotnie po 5 minut w PBST.
    UWAGA: Kroki 3.2 i 3.3 są niezbędnymi krokami utrwalania wymaganymi dla tego protokołu i nie można ich pominąć.
  4. Próbki inkubować z 10 μg/ml proteinazy K w 0,1% Tween-20 w PBS (PBST) przez 5 minut bez mieszania. Szybko usuń proteinazę K i krótko przepłucz próbki PBST przed utrwaleniem tkanki przez 30 minut w 4% formaldehydzie + 0,1% aldehydzie glutarowym w PBST. ostrożność: Zarówno formaldehyd, jak i aldehyd glutarowy są toksyczne i podczas pracy z tymi roztworami należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa.
    UWAGA: Następujące etapy mycia i inkubacji obejmujące 50% i 100% mieszanki hybrydyzacyjne (kroki 3.6 - 3.9) należy przeprowadzić bez mieszania.
  5. Po dwukrotnym przemyciu próbek przez 10 minut każda w PBST, przemyj próbki raz w 50% mieszance hybrydyzacyjnej (odpowiedniej dla sond intronowych: 50% formamidu, 5x cytrynian soli fizjologicznej (SSC), 5 mM EDTA, 50 μg/ml tRNA, 0,2% Tween-20, 0,1% SDS i 100 μg/ml heparyny) w PBST przygotowanym w temperaturze pokojowej. Próbki inkubować w tym roztworze przez 10 minut w temperaturze 65 °C bez mieszania.
  6. Przepłukać próbki dwukrotnie wstępnie ogrzaną (65 °C) mieszanką do hybrydyzacji przed inkubacją próbek w mieszance hybrydyzacyjnej przez ≥ 2 godziny (do 48 godzin) w temperaturze 65 °C (dłuższe czasy inkubacji poprawiają uzyskany kontrast sygnału do szumu). Usuń mieszaninę hybrydyzacyjną z poprzedniego kroku i zastąp ją 0,25 - 0,5 ml wstępnie podgrzanej (65 °C) mieszanki hybrydyzacyjnej zawierającej antysensowną sondę RNA znakowaną digoksygeniną (DIG) przeciwko znanemu składnikowi zegara segmentacji.
    UWAGA: Na przykład sonda introniczna Lunatic Fringe (Lfng(i)) została użyta w stężeniu 20 μL/ml do wykrycia powstającego mRNA Lfng. Rozcieńczenie użyte w tym kroku jest zależne od sondy i będzie wymagało optymalizacji.
  7. Uszczelnić płytkę za pomocą taśmy klejącej, aby zapobiec parowaniu, i inkubować próbki w roztworze sondy przez dwie noce w temperaturze 65 °C.
  8. Używając plastikowej pipety Pasteura z cienką końcówką, odzyskaj sondę do ponownego użycia i przechowuj ją w temperaturze 20 °C. Przepłucz próbki dwukrotnie wstępnie podgrzaną (65 °C) mieszanką po hybrydyzacji (50% formamidu, 0,2% Tween-20 i 1x SSC) przed umyciem próbek jeszcze dwa razy przez 20 minut każda w temperaturze 65 °C we wstępnie podgrzanej mieszance po hybrydyzacji.
  9. Myć próbki przez 15 minut w temperaturze 65 °C we wstępnie podgrzanej 50% mieszance hybrydyzacyjnej w 0,1% Tween-20 w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej (TBST). Próbki należy dwukrotnie przepłukać TBST przed myciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej w TBST na platformie bujanej.
  10. Wstępnie inkubować eksplantaty w roztworze blokującym (TBST + 2% odczynnik buforowy blokujący (BBR) + 20% surowicy koziej poddanej obróbce cieplnej) przez co najmniej 2 godziny. Zastąp ten roztwór świeżym roztworem blokującym zawierającym przeciwciało anty-digoksygeninowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:200. Inkubować próbki O/N w temperaturze 4 °C.
  11. Po inkubacji przeciwciał przepłukać próbki 3 razy TBST w temperaturze pokojowej i przenieść je do indywidualnych dołków nowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umyj eksplantaty TBST 3 razy po 1 godzinie.
  12. W tym momencie przenieś próbki do probówek magazynowych o pojemności 0,5 ml lub do pojedynczych dołków 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby zmniejszyć wymaganą objętość odczynników do wykrywania wzmocnienia sygnału tyramidu (TSA) w kolejnych krokach.
  13. Próbki inkubować w buforze do amplifikacji TSA (patrz wykaz odczynników) w temperaturze pokojowej przez 1 minutę bez mieszania, używając jak najmniejszej objętości, upewniając się, że próbki są całkowicie zanurzone w roztworze.
  14. Dodać odczynnik TSA (patrz wykaz odczynników) do buforu do amplifikacji próbki w rozcieńczeniu 1:50. Szybko wymieszaj roztwór, aż odczynnik TSA zostanie równomiernie rozprowadzony, przykryj płytkę lub probówki folią aluminiową i inkubuj próbki przez 60 - 90 minut w ciemności.
  15. Usunąć roztwór wzmacniający TSA i umyć próbki w TBST 3 razy przez 5 minut każda. Przenieść eksplantaty z powrotem na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, aby zwiększyć objętość płukania i inkubować próbki w 1% nadtlenku wodoru w TBST przez 1 godzinę. Przemyć próbki TBST 3 razy przez 5 minut każda, a następnie dwa razy po 5 minut za pomocą PBST przed montażem próbki (patrz krok 4).

4. Przygotowanie próbki do obrazowania

  1. Przygotować jedno szkiełko z naładowaną adhezją dla każdej pary eksplantatów, dodając przekładki obrazowe o grubości 0,12 mm, które zapobiegają zgnieceniu próbek przez dodanie szkiełka nakrywkowego. Usuń wkładkę samoprzylepną z jednej powierzchni przekładki i umieść ją klejem do dołu na szkiełku podstawowym, mocno dociskając, aby uszczelnić przekładkę do szkiełka.
    UWAGA: W przypadku pozostałych kroków staraj się przechowywać próbki w słabym świetle lub w ciemności, aby uniknąć fotowybielania. Eksplant pipet paruje się na przygotowanym szkiełku za pomocą szklanej pipety Pasteura umieszczonej pośrodku przekładki, upewniając się, że wypreparowana strona eksplantatu jest skierowana w stronę szkiełka. Ułóż przeciwstawne pary eksplantatów obok siebie.
  2. Usunąć jak najwięcej płynu ze szkiełka za pomocą szklanej pipety Pasteura i odchować resztki wilgoci otaczające próbki za pomocą kawałka złożonej, niestrzępiącej się bibułki.
  3. Pozwól próbkom przylegać do szkiełka przez 45 - 60 s, aż tkanka zacznie wydawać się lepka i przezroczysta. W tym czasie usuń pozostałą warstwę samoprzylepną z przekładki za pomocą kleszczyków. Nie dopuścić do wyschnięcia próbek.
  4. Dodaj dużą kroplę dwufunkcyjnego roztworu mocującego i czyszczącego (0,5% p-fenylenodiaminy i 20 mM Tris, pH 8,8, w 90% glicerolu) do próbek w środku przekładki. UWAGA: Ten roztwór zmienia kolor na brązowo-, gdy pozwoli mu się utlenić.
  5. Ostrożnie umieścić okrągłe szkiełko nakrywkowe (nr 1.5) w poprzek próbek, upewniając się, że mocowanie jest równomiernie rozłożone i że wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego stykają się z przekładką. Umieść slajd z okładką do góry nogami na niestrzępiącej się bibułce.
  6. Dociśnij mocno, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe całkowicie przylega do przekładki i że nadmiar mocowania został usunięty. Powtarzaj, aż papier nie będzie już plamiony przez mocowanie.
  7. Odpowiednio oczyścić i oznaczyć szkiełko (szkiełka) i przechowywać je w ciemności do czasu obrazowania, krótkotrwałego w temperaturze -20 °C lub długotrwałego w temperaturze -80 °C. Po wyjęciu szkiełek z magazynu, pozwól im całkowicie się rozmrozić przed obrazowaniem.
  8. Zobrazuj zamontowane próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego z akwizycją kafelkową i obiektywem o dużym powiększeniu. Zobrazuj pary eksplantatów za pomocą 40-krotnego obiektywu immersyjnego w oleju w odstępach 4 μm z, używając linii laserowych 488 nm, 568 nm i 647 nm do wzbudzenia odpowiednio zielonych, czerwonych i dalekich czerwonych fluoroforów, stosowanych do wykrywania białek i mRNA w tym badaniu12.
    UWAGA: Obrazy kafelkowe zostały zszyte po akwizycji w celu utworzenia jednego obrazu do analizy.

5. Analiza obrazu po akwizycji

  1. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zdefiniować obszar zainteresowania w PSM każdej próbki eksperymentalnej.
    1. Aby określić ilościowo poziomy ekspresji, odejmij obrazy tła i progu do poziomu próbki kontrolnej bez pierwotnej próbki przed późniejszą kwantyfikacją. Zdefiniuj początek, oś i jednostkę długości dla każdej próbki.
  2. Obliczyć intensywność fluorescencji w funkcji położenia wzdłuż znormalizowanej osi rostro-ogonowej dla każdej z próbek M 12. Po znormalizowaniu wykresów intensywności należy umieścić profile intensywności obok siebie i uzyskać macierz intensywności f(i,j), która opisuje natężenie w i-tym położeniu przestrzennym w jtej próbce.

6. Czasowa kolejność próbek

  1. Aby wywnioskować uporządkowanie czasowe znanego składnika zegara, zdefiniuj jego macierz intensywności. Następnie przestaw kolumny macierzy intensywności tak, aby uzyskać wzorzec czasowo okresowy. W tym celu należy zdefiniować funkcję
    figure-protocol-1
    gdzie A(fj; k) reprezentuje funkcję autokorelacji jtej kolumny f i AT jest docelową funkcją autokorelacji, wybraną do wymuszenia czasowej okresowości wzorca, daną wzorem
    figure-protocol-2
  2. Użyj Metropolis-Hastings (lub innego algorytmu minimalizacji)12, aby zidentyfikować kolejność próbek, które minimalizują funkcję g. W ten sposób określ kolejność próbek M, która maksymalizuje okresowość znanego składnika zegara.
  3. Korzystając z wywnioskowanej kolejności czasowej próbek M, skonstruuj uporządkowany kimograf dla wzorca wyrażenia w kanale partnerskim12.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pozwala na wizualizację czasoprzestrzennego profilu białka będącego przedmiotem zainteresowania wraz z transkrypcją genu zegara u myszy PSM12. Na przykład wykazano, że ekspresja białka Dll1 (Figura 1A-C) i Notch1 (Figura 1D-F) oscyluje poza synchronizacją z powstającą transkrypcją genu zegara segmentacyjnego Lfng regulowanego przez Notch. Kwantyfikacja intensywności sygnału Dll1, Notch1 i Lfng(i) w odniesieniu do osi przednio-tylnej (AP) PSM (ryc. 1G) ujawnia wyraźną dynamikę wyrażeń oscylacyjnych dla tych celów (ryc. 1H-J). Czasoprzestrzenny profil ekspresji białek Dll1 i Notch1 w całym cyklu zegarowym jest wyraźnie wizualizowany i określany ilościowo przy użyciu tego protokołu poprzez analizę obrazu po akwizycji danych obrazu tkanek o wysokiej rozdzielczości.

figure-results-1
Rysunek 1: Przestrzenno-czasowa wizualizacja i kwantyfikacja dynamiki ekspresji białek Dll1 i Notch1. (A-F) Pary eksplantatów z sześciu zarodków E10.5 (A-F) pokazujące przestrzenny rozkład białka Dll1 (A-C) lub białka Notch1 (D-F) w jednej połowie wraz z wykryciem Lfng pre-mRNA (Lfng (i)) w odpowiedniej przeciwległej połowie każdej pary. Panele są rozmieszczone zgodnie z fazą 1 (A i D), fazą 2 (B i E) oraz fazą 3 (C i F) cyklu zegara segmentacji, zgodnie z profilem przestrzennym wyrażenia Lfng(i). Zakres domen wyrażeń dla Dll1 (zielony), Notch1 (czerwony) i Lfng(i) (szary) wzdłuż przednio-tylnej osi PSM został wyznaczony za pomocą kolorowych pasków. Linie przerywane wyznaczają pozycje ostatnio utworzonych somitów (somitów), zewnętrzne krawędzie PSM i przyległą tkankę nerwową (C i E). Paski skali (w lewym dolnym rogu każdego panelu, A-F) reprezentują 100 μm. (G) Przykładowy wykres intensywności przedstawiający osiową zmienność intensywności sygnału w całym PSM. Dane są wykreślane z dwóch par eksplantów pokazujących Lfng pre-mRNA (linia haszowana) w jednym eksplantie w porównaniu z białkiem Notch1 (czerwonym) w kontralateralnym eksplantacie (zarodek 1), a także Lfng pre-mRNA (linia ciągła) w innym eksplantacie w porównaniu z białkiem Dll1 (zielony) w przeciwległym eksplantacie (zarodek 2). Zmierzona intensywność sygnału (oś y) jest wykreślana w zależności od położenia osiowego (oś x; przednia PSM [A] po prawej i tylna PSM [P] po lewej). (H) Kymograf przedstawiający przestrzenny rozkład Dll1, Notch1 i Lfng(i) w licznych PSM. Każdy wiersz kimografu reprezentuje intensywność sygnału pojedynczego eksplantatu PSM. Rzędy są ułożone w kolejności czasowej zgodnie z czasoprzestrzennym rozkładem Lfng pre-mRNA (I) Czasoprzestrzenny rozkład Dll1, Notch1 i Lfng (i) poprzez wiele oscylacji zegara jest symulowany przez okresowe rozszerzanie danych pokazanych w (H), podkreślając oscylacyjny charakter dynamiki wyrażeń Dll1 i Notch1. (J) Pulsacyjna ekspresja białka Notch1 w ogonowym PSM jest podkreślona przez powiększenie obszaru wyznaczonego na wirtualnym kimografie pokazanym w (I). Zmodyfikowano z Odniesienia 12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Kwantyfikacja czasoprzestrzennej dynamiki ekspresji białek Dll1 i Notch1. (A) Przykładowy wykres intensywności przedstawia osiową zmienność intensywności sygnału w całym PSM. Dane wykreślone z dwóch par eksplantów pokazujące pre-mRNA Lfng (linia haszowana) w jednym eksplantie w porównaniu z białkiem Notch1 (czerwonym) w przeciwległej połowie eksplantatu, a także Lfng pre-mRNA (linia ciągła) w połowie eksplantu z drugiego ogona w porównaniu z białkiem Dll1 (zielonym) w przeciwległej połowie eksplantatu drugiego ogona. Zmierzone intensywności (oś y) są wykreślane w stosunku do położenia osiowego (oś x; rostralna [A] po prawej i ogonowa [P] po lewej). (B-H) Kymografy pokazują przestrzenny rozkład Notch1, Dll1, NICD i Lfng(i) w wielu PSM. (B i C) NICD (B) i Dll1 (C) ekspresja w sekcjach PSM; (D i E) Lfng(i) (D) i Dll1 (E) w przeciwległych połówkach eksplantatów; (F i G) Lfng(i) (F) i Notch1 (G) w przeciwległych połówkach eksplantatów. Z odnośnika 12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Niniejszy protokół opisuje czułą metodę przeprowadzania analizy ilościowej niskopoziomowej ekspresji białek i dynamiki oscylacyjnej w eksplantatach PSM myszy E10.5. Po solidnym protokole zarówno immunohistochemii, jak i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) następuje obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości, a następnie analiza obrazu i segmentacja czasowa kymografów w celu wygenerowania czasoprzestrzennej mapy ekspresji białek w całym PSM. Wysoki stosunek sygnału do szumu w wykrywaniu białek i mRNA jest niezbędny do zapewnienia powodzenia tej techniki. Należy dołożyć starań, aby dokładnie wymienić wszystkie roztwory podczas etapów mycia i utrzymać temperaturę prania w temperaturze 65 °C na odpowiednich etapach kroku 3. Najkorzystniej jest poświęcić trochę czasu na pozyskanie skutecznych przeciwciał i sond RNA przeciwko interesującym celom oraz dokładne przetestowanie tych odczynników na całych próbkach przed rozpoczęciem tego protokołu.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Główne problemy, które można napotkać podczas wykonywania tego protokołu, wynikają ze słabej siły i jakości wykrywania sygnału. Jest to w dużej mierze zależne od skuteczności przeciwciał lub sond RNA stosowanych odpowiednio w etapach immunohistochemii lub FISH w protokole. Wiele różnych kroków może wymagać optymalizacji, zanim zostanie osiągnięte odpowiednie wykrywanie sygnału. Jedną z częstych przyczyn słabego wykrywania sygnału jest niewłaściwa fiksacja; konieczne jest użycie świeżego PFA lub PFA przechowywanego w temperaturze 4 °C przez okres nie dłuższy niż jeden tydzień do utrwalenia próbek. Długość utrwalenia może również wymagać optymalizacji, w zależności od zastosowanego przeciwciała lub sondy RNA. W przypadku przeciwciał zaleca się w miarę możliwości postępowanie zgodnie z instrukcjami producenta, natomiast w przypadku sond RNA zalecamy zapoznanie się z opublikowaną literaturą.

W tym badaniu użyliśmy sondy RNA, która specyficznie wykrywa pre-mRNA genu zegara Lfng. Ze względu na względny brak obfitości, wykrywanie pre-mRNA Lfng wymaga długiego okresu inkubacji z sondą w mieszaninie hybrydyzacyjnej zawierającej 5x cytrynian soli fizjologicznej (SSC) w celu dobrego wykrywania sygnału. Te same warunki mogą dotyczyć innych sond, które wykrywają mRNA o słabej ekspresji, ale z naszego doświadczenia wynika, że wykrywanie bardziej stabilnych celów mRNA może wymagać krótszego etapu hybrydyzacji sondy i niższych stężeń SSC w mieszance hybrydyzacyjnej (np . 1,3x SSC). Zarówno w przypadku immunohistochemii, jak i FISH, protokół musi być najpierw zoptymalizowany na całych zarodkach, a optymalne stężenie przeciwciała lub sondy musi zostać określone empirycznie.

Ograniczenia techniki

Jak wspomniano powyżej, sukces tej techniki w dużym stopniu zależy od jakości wykrywania białka i mRNA. Przedstawiliśmy kilka sugestii, w jaki sposób można poprawić wykrywanie białek i mRNA, ale przy braku wysokiej jakości detekcji sygnału fluorescencyjnego nie ma możliwości, aby eksperyment mógł być kontynuowany. Liczba docelowych białek, które można analizować w każdej próbce tkanki, jest ograniczona rozdzielczością spektralną mikroskopu konfokalnego oraz epitopami zastosowanych przeciwciał. W tym badaniu byliśmy w stanie użyć do trzech epitopów do wykrywania białek wraz z barwieniem DNA na każdej próbce12. Protokół ten pozwala na wykrycie tylko jednego celu mRNA, chociaż obecne alternatywne metody mogą być zastosowane w celu zwiększenia tego do trzech celów14.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod

Opisana tutaj metoda zapewnia czułą technikę wykrywania wahań niskiego poziomu białka w pełnoziarnistych eksplantatach PSM. Kwantyfikacja tej dynamiki jest możliwa poprzez wykonanie FISH dla znanego genu zegara w odpowiednich przeciwległych eksplantatach. Generowana jest biblioteka kymogramów, które można organizować w jednym cyklu zegara segmentacji, podkreślając dynamikę ekspresji czasoprzestrzennej celu zainteresowania w tym przedziale czasowym. Kluczową różnicą między tą techniką a innymi jest zastosowanie automatyzacji obliczeniowej do czasowego porządkowania dużych zbiorów danych, co pozwala na bezstronną analizę dynamiki ekspresji czasoprzestrzennej nowych komponentów zegara. Na przykład technika ta dostarczyła informacji na temat tego, w jaki sposób białka Dll1 i Notch1 oraz ich oscylacje są współregulowane w całym PSM. Alternatywne metody w tym kontekście również opierały się na barwieniu immunologicznym, ale nie wykryły niewielkich wahań poziomów białka Dll1 i Notch1 w ogonowym PSM, które były widoczne przy użyciu tej metody. Zamiast tego stwierdzili stały gradient ekspresji, który jest najsilniejszy w regionie rostralnym 9,10,11. Może to wynikać z faktu, że protokół ten ma dłuższy okres inkubacji przeciwciał pierwotnych (3-5 dni, w przeciwieństwie do nocy), który może być wymagany do wykrycia niższych poziomów białka. Ponieważ poziomy ekspresji Dll1 i Notch1 są stosunkowo wysokie w rostralnym PSM, mogło to wpłynąć na autorów do zobrazowania próbek przy niższym ustawieniu ekspozycji, niż byłoby to konieczne do wykrycia ekspresji białka ogonowego. Kolejna potencjalna rozbieżność wynika z zastosowania nieutrwalonej tkanki w badaniu Chapmana i wsp., w którym przejściowa ekspresja Dll1 i Notch1 w ogonowym PSM mogła byćgorzej zachowana9.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu techniki

Po opanowaniu tego protokołu można przeprowadzić wysokoprzepustową analizę ekspresji dla dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w PSM. Eksplantaty PSM wygenerowane z kilku miotów myszy mogą być przetwarzane jednocześnie w celu wygenerowania wysokiej liczby próbek niezbędnych do analizy. Chociaż w tych badaniach wykorzystaliśmy tylko zarodki typu dzikiego, możliwe jest przeprowadzenie tej analizy przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych zarodków w celu oceny znaczenia jednego lub więcej czynników na dynamikę ekspresji białek. Poza PSM, protokół ten może być dostosowany do innych systemów, które składają się z dwóch przeciwbieżnych połówek i może być używany do czułego wykrywania ekspresji białek niskiego poziomu i dynamiki oscylacyjnej. Jednym z przykładów, do których można dostosować ten protokół, jest badanie dynamicznej ekspresji białek w cewie nerwowej myszy, ponieważ przeciwległe połówki mogą być generowane i hodowane, a wykazano, że aktywność Notch jest zarówno obecna, jak i ważna dla wzorca15. Zachęcamy inne grupy do dostosowania tego protokołu do innych systemów i do przekazywania informacji zwrotnych w celu przyszłych ulepszeń.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez stypendium MRC dla RAB, stypendium MRC dla CSLB oraz grant projektu WT dla JKD (WT089357MA). Prace zostały również wsparte nagrodą Welcome Trust Strategic (097945/Z/11/Z). Dziękujemy dr E. Kremmerowi za miły dar w postaci przeciwciała Dll1 oraz dr O. Pourquie za sondę Lfng RNA.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM-F12Gibco (ThermoFisher Scientific)11320033
GlutaMAX™-1 (100x)Gibco (ThermoFisher Scientific)35050
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, zatwierdzona przez UE, pochodząca z Ameryki PołudniowejGibco (ThermoFisher Scientific)10270106
Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 a.a.)Peprotech100-18B
Penicylina/StreptomycynaGibco (ThermoFisher Scientific)15140122
anty-mysie przeciwciało monoklonalne Notch1^BD Pharmingen552466
antyszczurze przeciwciało poliklonalne Dll1^*N/AN/A
Lfng introniczna sonda antysensownego RNA^*N/AN/A
16% paraformaldehydPierce (ThermoFischer Scientific)PI28908
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR Roche (Sigma-Aldrich)31158
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Wyprodukowano w domuNie dotyczy
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich5470
Normalna surowica kozia (NGS) (poddana obróbce cieplnej)Gibco (ThermoFisher Scientific)16210072 
Hoechst 33342ThermoFischer ScientificH3570
Tween-20Sigma-AldrichP9416
EtanolSigma-Aldrich46139
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich340855
FormamidSigma-AldrichF9037
Cytrynian soli fizjologicznej (SSC)Sigma-Aldrich93017
EDTASigma-Aldrich798681 
tRNARoche (Sigma-Aldrich)101095
HeparynaSigma-AldrichH3149 
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)Wyprodukowany w domu/A
Blokujący odczynnik buforowy Roche (Sigma-Aldrich)11096176001
przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) anty-DIG(Sigma-Aldrich)11207733910
zestaw do wzmacniania sygnału tyramidu (TSA)Perkin ElmerNEL744001KT
*Przeciwciało Dll1 i sonda RNA użyte w tym badaniu nie są dostępne na rynku. Proszę zapoznać się z podziękowaniami dla źródeł.
^Przeciwciała/sondy RNA powinny być uźródłowione, które mają zastosowanie do zainteresowań badawczych czytelnika.
N Roche

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).">Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), Cambridge, England. 625-639 (2012).
  2. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).">Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), Cambridge, England. 2783-2792 (2011).
  3. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856(2008).">Dequéant, M. -L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856(2008).
  4. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).">Bailey, C., Dale, K. Somitogenesis in Vertebrate Development. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-15 (2015).
  5. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).">Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), Cambridge, England. 2453-2456 (2012).
  6. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).">Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
  7. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662(2009).">Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662(2009).
  8. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842(2015).">Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842(2015).
  9. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).">Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
  10. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).">Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
  11. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141(2012).">Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141(2012).
  12. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).">Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), Cambridge, England. 4806-4816 (2014).
  13. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160(2007).">Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160(2007).
  14. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).">Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
  15. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).">Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), Cambridge, England. 2291-2303 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Segmentation ClockPresomitic MesodermPSM ExplantsConfocal ImagingImmunohistochemistryIn Situ HybridizationKymograph AnalysisGene Expression DynamicsNotch SignalingDelta like1

Related Articles