Artykuł metodologiczny

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

DOI:

10.3791/55128

⸱

1 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, Programs in Human and Molecular Genetics and Neuroscience, The Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Department of Natural Sciences, University of Houston - Downtown, 3Department of Neurobiology and Anatomy, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje rosnące zainteresowanie wykorzystaniem Drosophila do modelowania chorób zwyrodnieniowych ludzkiego mózgu, mapowania obwodów neuronalnych w mózgach dorosłych oraz badania molekularnych i komórkowych podstaw wyższych funkcji mózgu. Kompleksowe przygotowanie dorosłych mózgów z dobrze zachowaną morfologią ma kluczowe znaczenie dla takich całościowych badań opartych na mózgu, ale może być technicznie trudne i czasochłonne. Protokół ten opisuje łatwe do nauczenia, jednoetapowe podejście do preparacji dorosłej głowy muchy w czasie krótszym niż 10 sekund, przy jednoczesnym utrzymaniu nienaruszonego mózgu połączonego z resztą ciała, aby ułatwić kolejne etapy przetwarzania. Procedura pomaga usunąć większość tkanek oka i tchawicy normalnie związanych z mózgiem, które mogą zakłócać późniejszy etap obrazowania, a także stawia mniejsze wymagania co do jakości kleszczy preparacyjnych. Dodatkowo opisujemy prostą metodę, która umożliwia wygodne odwracanie zamontowanych próbek mózgu na szkiełku nakrywkowym, co jest ważne dla obrazowania obu stron mózgu o podobnej intensywności i jakości sygnału. Jako przykład protokołu przedstawiamy analizę neuronów dopaminergicznych (DA) w mózgach dorosłych much WT (w1118). Wysoka skuteczność metody preparacji sprawia, że jest ona szczególnie przydatna w badaniach na dużej skali mózgu dorosłych u Drosophila.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowy organizm Drosophila, powszechnie znany jako muszka owocowa, od dawna ceniony jest za swoje eleganckie narzędzia genetyczne, krótki czas reprodukcji oraz wysoce zachowane szlaki molekularne i komórkowe. Muszka owocowa została z powodzeniem wykorzystana do analizy podstawowych szlaków sygnałowych, mechanizmów wzorcowania organizmów wielokomórkowych, a także mechanizmów leżących u podstaw rozwoju, funkcji i chorób neuronów1,2. Dzięki niedawnym postępom w technologiach znakowania i obrazowania komórek, mózg muszki owocowej stał się szczególnie skuteczny w precyzyjnym mapowaniu obwodów neuronalnych oraz w analizowaniu molekularnych i komórkowych podstaw wyższych funkcji mózgu, takich jak uczenie się i pamięć oraz rytm okołodobowy1,3,4,5,6,7,8.

Jedną szczególną zaletą systemu Drosophila jest jego stosunkowo mały rozmiar, pozwalający na przygotowanie całego montażu i badanie mózgu za pomocą zwykłego mikroskopu złożonego lub konfokalnego. Funkcja ta umożliwia szczegółową analizę anatomiczną i funkcjonalną obwodów neuronalnych, a nawet pojedynczego neuronu, na poziomie komórkowym i subkomórkowym, w kontekście całej tkanki mózgowej, zapewniając w ten sposób zarówno holistyczne spojrzenie na badany obiekt, jak i jego dokładną geometrię w całym mózgu. Biorąc jednak pod uwagę raczej miniaturowy rozmiar mózgu, stanowi to również wyzwanie techniczne w skutecznym wypreparowaniu nienaruszonej tkanki mózgowej z ochronnej obudowy głowy egzoszkieletu u dorosłej muchy. Szczegółowo opisano różne skuteczne i stosunkowo proste metody preparacji, które zwykle polegają na starannym i stopniowym usuwaniu obudowy głowy i związanych z nią tkanek, w tym oczu, tchawicy i tłuszczu z właściwego mózgu9, 10. Te mikrochirurgiczne metody preparacji często stawiają dość rygorystyczne wymagania co do jakości kleszczy preparacyjnych, opierając się na kleszczach z cienkimi, dobrze ustawionymi końcówkami, które można łatwo uszkodzić. Co więcej, ponieważ wypreparowane mózgi są często oddzielone od reszty ciała, mózgi mogą zostać łatwo utracone podczas późniejszych procesów barwienia i mycia ze względu na ich małe rozmiary i przezroczystość w buforze przetwarzania. Tutaj opisujemy stosunkowo prosty i łatwy do nauczenia, jednoetapowy protokół preparacji dla dorosłych mózgów, który utrzymuje wypreparowane mózgi przyczepione do tułowia. Proces preparacji często z łatwością usuwa większość tkanek związanych z mózgiem, takich jak oko i tchawica, oraz zmniejsza zapotrzebowanie na dobrej jakości kleszcze preparacyjne.

Dodatkowo, podczas obrazowania mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym, strona mózgu, która jest oddalona od źródła światła fluorescencyjnego, często wytwarza słabszy sygnał i mniej wyraźne obrazy ze względu na grubość całego mózgu. W tym miejscu opisujemy również prostą metodę montażu, która umożliwia łatwe odwracanie próbek mózgu, umożliwiając wygodne obrazowanie obu stron mózgu o podobnym natężeniu i jakości sygnału.

Jako dowód na słuszność koncepcji zastosowania tej metody do badania mózgu dorosłego człowieka, dalej badaliśmy obecność neuronów DA w mózgach much w1118; genotypu, który jest często używany jako linia rodzicielska do generowania muszek transgenicznych i kontroli typu dzikiego w wielu badaniach nad Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Roztwory używane do preparacji mózgu i barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Przeanalizuj mózgi dorosłych much w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2 i 10 mM glukozy. Przed użyciem zagazuj aCSF 5% CO2 / 95% O2 przez 10 - 15 minut i nabij 2,5 mM CaCl2. Wysterylizuj roztwór aCSF, filtrując przez filtr membranowy 0,22 μm.
    nuta: Przechowywać płyn CSF w temperaturze 4 °C, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Mózgi much można również preparować w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), chociaż nie przeprowadzono szczegółowych porównań wpływu dwóch roztworów preparacyjnych na końcową jakość obrazowania wypreparowanych mózgów.
  2. Użyć 4% paraformaldehydu (PFA) przygotowanego w 1x PBS jako roztworu utrwalającego, który jest zwykle porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C.
    ostrożność: PFA jest toksyczny i i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  3. Użyj 1x PBS do wypłukania PFA z mózgów i po ostatnim etapie mycia, podczas barwienia immunofluorescencyjnego wypreparowanych mózgów. Przygotuj 1x PBS z 10x PBS roztworu podstawowego (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4 i 18 mM KH2PO4).
  4. Użyj 0,3% Tween-20 w 1x PBS (1x PBT) do wszystkich kolejnych etapów mycia podczas barwienia immunofluorescencyjnego wypreparowanych mózgów.

2. Mikrochirurgiczne preparowanie dorosłych głów muchowych

Uwaga: Procedura preparacji jest zilustrowana na rysunku 1.

  1. Znieczulić dorosłe muchy CO2. Za pomocą kleszczy podnieś muchę i krótko odwoskuj jej naskórek, zanurzając go w 70% etanolu na 3 - 5 sekund. Gwarantuje to, że żadne pęcherzyki nie przylegają do naskórka muchy po zanurzeniu w roztworze preparacyjnym aCSF lub 1X PBS.
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła pod kątem, który nie będzie blokowany przez ręce, ustaw soczewkę obiektywu tak, aby uzyskać wyraźny widok muchy (powiększenie 1,2x). Użyj kleszczy ręką niedominującą, aby unieruchomić zwierzę i zanurz muchę w zimnym roztworze preparacyjnym z brzuchem skierowanym do góry, jak pokazano na rysunku 1A.
  3. Trzymaj kleszcze pod kątem 160 - 170° w stosunku do płytki preparcyjnej, wywierając niewielką siłę na brzuch muchy (zilustrowany strzałkami na rysunku 1A). Ten krok unieruchomi muchę i zmusi ją do przesunięcia głowy do tyłu o 15 - 25°, jednocześnie wysuwając trąbkę do góry. W tym procesie powinien stać się widoczny miękki i półprzezroczysty obszar naskórka, pod trąbką. Zwiększ powiększenie i dostosuj płaszczyznę ogniskowej do tego obszaru.
    nuta: Nie trzymaj kleszczy zbyt mocno, ale raczej wystarczająco mocno, aby ustabilizować muchę. Zbyt duża siła spowoduje, że narządy wewnętrzne pękną w roztworze.
  4. Użyj dominującej ręki, aby docisnąć kleszcze preparacyjne tak, aby ich końcówki były zamknięte, co wytworzy łagodną siłę oporu na końcówkach kleszczy, tak aby kleszcze otworzyły się po zwolnieniu nacisku z ręki trzymającej. Ustaw kleszcze prostopadle do kleszczy trzymających muchę, jak pokazano na rysunku 1B.
    1. Przebij zamknięte końcówki kleszczy preparacyjnych przez miękki i półprzezroczysty obszar naskórka pod trąbką, jak pokazano czerwoną strzałką na rysunku 1B. Ważne jest, aby nie penetrować kleszczy zbyt głęboko, aby dotknęły mózgu. Właściwy mózg powinien stać się widoczny. Utrzymuj stabilny chwyt rozporka ręką niedominującą.
  5. Szybko, ale stabilnie, zwolnij końcówki kleszczy preparacyjnych o własnej sile i polegaj na pędzie z tego uwolnienia, aby oderwać egzoszkielet otaczający głowę muchy. Nienaruszony mózg właściwy powinien stać się widoczny (biała tkanka bezpośrednio nad czubkiem dolnego kleszcza na rysunku 1C) Podążaj za wyimaginowaną linią, aby kierować pędem zwolnionych końcówek kleszczy (zilustrowanych jako zewnętrzne czerwone strzałki pokazane na rysunku 1C). To delikatnie usunie egzoszkielet i większość oka i tchawicy związanych z mózgiem z mózgu. Właściwy czas i siła zastosowana do otwarcia egzoszkieletu będą zależały od doświadczenia badacza.
    nuta: Jest to najbardziej krytyczny krok podczas sekcji. Ważne jest, aby polegać na naturalnej sile generowanej przez pęd kleszczy otwierających, aby usunąć egzoszkielet, pozostawiając odsłonięte szczątki mózgu przyczepione do reszty ciała.
  6. Użyj kleszczy w dominującej ręce, aby ostrożnie usunąć resztki tkanek dodatkowych, takich jak tchawica, która wygląda jak struktury białych włókien pozostające przyczepione do mózgu. Uważaj, aby nie ciągnąć ani nie uszkodzić właściwego mózgu.

3. Immunofluorescencyjne barwienie mózgów

  1. Wypreparowane próbki mózgu wraz z powiązanymi z nimi tułowiami należy umieścić w około 1 ml 4% PFA przez 40 - 60 min.
    nuta: W tym i kolejnych krokach należy przechowywać probówki lub płytki z próbkami na nutatorze, aby prawidłowo wymieszać próbki w roztworze.
  2. Spłukać 1 ml 1x PBS, pipetując roztwór w górę i w dół 3 razy. Uważaj, aby nie zassać mózgu.
  3. Umyj 5 razy 1x PBT przez 5 minut każdy. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.
  4. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi we właściwym rozcieńczeniu O/N w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia usuń przeciwciała pierwszorzędowe i umyj próbki 5 razy 1x PBT. Pozostawić próbki na 5 - 10 minut w 1x roztworze PBT pomiędzy każdym myciem. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.
  6. Umyte próbki inkubować w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych z sugerowanym rozcieńczeniem i czasem inkubacji.
  7. Przemyć próbki sześciokrotnie 1x PBT z 10-minutową inkubacją między każdym myciem.
    Ten etap ma kluczowe znaczenie dla usunięcia nieswoistych przeciwciał drugorzędowych z próbki.
  8. Inkubować w rozcieńczeniu 1:10 000 1 mg / ml 4',6'-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x roztworze PBT przez 30 minut. DAPI jest barwnikiem DNA, który wiąże się z regionami AT DNA i może być wykorzystany do ujawnienia ogólnej morfologii mózgu.
  9. Spłucz trzy razy 1x PBS.
  10. Przenieś próbki do naczynia preparacyjnego i oddziel mózgi od ciał w naczyniu sekcyjnym za pomocą kleszczy.
  11. Po etapach barwienia i mycia zamontuj mózgi pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi i umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełku montażowym. W ten sposób próbki mózgu można łatwo odwrócić, tak aby obie strony mózgu mogły być zobrazowane z podobną intensywnością sygnału.
    nuta: Zamontowanie mózgu na szkiełku nakrywkowym zamiast bezpośrednio na szkiełku montażowym umożliwia swobodne obracanie orientacji próbki. Proces montażu został wyjaśniony bardziej szczegółowo poniżej.
    1. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na szkiełku montażowym. Poszerzyć otwór końcówki pipety za pomocą ostrza i użyć go do przeniesienia mózgów w 1 roztworze PBS na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm.
    2. Umieść mózgi na środku szkiełka nakrywkowego, usuń płyn wokół mózgów za pomocą cienkiej końcówki pipety, a następnie dodaj kolejne 20 - 40 μl podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu (0,2% (w/v) galusanu n-propylu w 99,5% glicerolu klasy ACS) na mózgi.
      nuta: Ilość dodanego podłoża montażowego zależy od liczby badanych mózgów.
    3. Delikatnie rozłóż mózgi, jednocześnie wypierając lepkie podłoże montażowe na zewnątrz. Umieść drugie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na wierzchu mózgu, najpierw opuszczając szkiełko z jednej strony, aż zetknie się z powierzchnią szkiełka montażowego, a następnie powoli opuszczając drugą stronę, aby zminimalizować kontakt mózgu z pęcherzykami powietrza.
      nuta: Nie ma potrzeby stosowania przekładki pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi, ponieważ objętość podłoża montażowego i mózgów powinna zapewniać przestrzeń wystarczającą do oddzielenia dwóch szkiełek nakrywkowych.
    4. Pozwól szkiełkom się uspokoić. Nadmiar płynu, który wydostaje się z boków szkiełek, usunąć chusteczką laboratoryjną.
    5. Aby zapobiec wypadnięciu szkiełek nakrywkowych z zamontowanymi mózgami z prowadnicy montażowej podczas transportu, użyj małego kawałka taśmy do przymocowania szkiełek nakrywkowych do prowadnicy montażowej.
      nuta: Mózgi zamontowane pomiędzy szkiełkami mogą być natychmiast zobrazowane lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia bez znacznej utraty sygnału fluorescencyjnego, bez konieczności stosowania jakiegokolwiek uszczelniacza do uszczelniania szkiełek. W celu długotrwałego zachowania zabarwionych mózgów, bok dwóch zwojów można uszczelnić lakierem do paznokci i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C, chociaż poplamione mózgi mogą z czasem stracić swoje sygnały. Nie jest to zalecane.
  12. Użyj odpowiedniego złożonego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować mózgi.
    1. Najpierw uzyskaj obraz od strony mózgu bliżej obiektywu, a następnie ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe, aby próbki znalazły się pośrodku. Ten krok ułatwia uzyskanie obrazu drugiej strony tego samego mózgu.
    2. Użyj pionowego złożonego mikroskopu fluorescencyjnego i soczewki obiektywowej 20X, aby zobrazować cały mózg (przykłady na rycinie 2) oraz obiektywu 40X, aby zobrazować mniejsze obszary mózgu, takie jak neurony DA w regionie klastra Paired Anterior Medial (PAM) (przykłady na rycinie 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje główne procedury sekcji mózgu dorosłego, jak opisano powyżej. Ryciny 2 i 3 są reprezentatywnymi obrazami 3-dniowych mózgów dorosłych much WT (genotyp: w1118), które zostały wybarwione przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozyny (TH, zabarwionej na czerwono na rysunku 2 i białej na rycinie 3), markera powszechnie używanego do oznaczania neuronów DA11, o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z rosnącym zainteresowaniem wykorzystaniem dorosłego mózgu Drosophila do badania chorób ludzkiego mózgu, obwodów neuronalnych i wyższych funkcji mózgu, konieczne jest opracowanie prostych i szybkich metod uzyskiwania nienaruszonych mózgów much do analiz całościowych, co jest szczególnie ważne w przypadku badań przesiewowych mózgu na dużą skalę. Nasza metoda zapewnia proste i łatwe do nauczenia podejście do wypreparowania głowy muchy (często w mniej niż 10 s z doświadczeniem) z dobrze zachowaną morfologią, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Panu/Pani Enes Mehmet, Pani Kiarze Andrade, Pani Pilar Rodriguez, Chrisowi Kwokowi i Pani Dannie Ghafir za ich ogromne wsparcie dla projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
w*;   parkΔ 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  Sb1Bloomington Drosophila Stock Center51652Balancer został przełączony na TM6B
PBac{WH}parkf01950Exelixis at Harvard Medical Schoolf01950Balancer został przełączony na TM6C
NaClFisher ScientificS640-500
Wodorowęglan sodu (NaHCO3) Fisher Scientific02-003-990
Chlorek potasu (KCl)Fisher ScientificBP366-500
Fosforan sodu, monohydrat monozasadowy (NaHCO3)Fisher Scientific02-004-198
Chlorek magnezu (MgCl2)Fisher Scientific02-003-265
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500GZastępuje glukozę
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
EMD Millipore  Filtry membranowe Durapore PVDF: Hydrofilowe: 0,22 i mikro; m Wielkość porówFisher ScientificGVWP14250
Roztwór formaliny, 10% (histologiczny)Fisher ScientificSF98-20
Fosforan potasu, dwuzasadowy, proszek, ultraczysty bioodczynnikFisher Scientific02-003-823
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Excelta z bardzo drobnymi końcówkamiFisher Scientific17-456-055Protokół nie wymaga bardzo drobnych punktów. 
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynyPel-Freez BiologicalsP40101
Rat-Elav-7E8A10 anty-elavBadania rozwojowe Hybridoma BankClone 7E8A10
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21247
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) wtórne, koniugat Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11037
Roztwór DAPI (1 mg / ml)ThermoFisher Scientific62248
Galusan propylu w proszkuSigma-AldrichP3130-100G
Odczynnik ACS do glicerolu, ≥ 99.5%Sigma-AldrichG7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1ZeissCytat
Zeiss Apotome.2ZeissCytat
OprogramowanieCytat
Precyzyjna pęseta Zen lite

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577(2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5(2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205(2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drosophila Brain DissectionWhole Mount PreparationAdult Fly BrainDissection ProtocolBrain Morphology PreservationImmunohistochemistry StainingDopaminergic Neuron AnalysisConfocal Microscopy ImagingParaformaldehyde FixationAnti fade Mounting Medium

Powiązane artykuły