Artykuł metodologiczny

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

DOI:

10.3791/55130

⸱

29 marca 2017

 ,  , 
1NeoGenomics Laboratories

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne wykrywanie i identyfikacja mutacji o niskiej częstotliwości może być problematyczne podczas oceny pozostałości choroby po terapii, badań przesiewowych pod kątem pojawiających się mutacji oporności podczas terapii lub gdy pacjenci mają niewiele krążących komórek nowotworowych. PCR blokujący typu dzikiego, po którym następuje analiza sekwencjonowania, oferuje wysoką czułość, elastyczność i prostotę jako metodologia wykrywania tych mutacji o niskiej częstotliwości. Dodając specjalnie zaprojektowany oligonukleotyd zablokowanego kwasu nukleinowego do nowego lub wcześniej ustalonego konwencjonalnego testu sekwencjonowania opartego na PCR, można osiągnąć czułość około 1 zmutowanego allelu na tle 1,000 alleli WT (1:1,000). Artefakty sekwencjonowania związane ze zdarzeniami deaminacji powszechnie występującymi w tkankach zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie można częściowo zaradzić poprzez zastosowanie glikozylazy DNA uracylu podczas etapów ekstrakcji. Zoptymalizowany protokół jest specyficzny dla wykrywania mutacji MYD88, ale może służyć jako szablon do projektowania dowolnego testu WTB-PCR. Zalety testu WTB-PCR w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi testami do wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości, w tym PCR specyficznego dla alleli i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, obejmują mniejszą liczbę przypadków wyników fałszywie dodatnich, większą elastyczność i łatwość wdrożenia oraz możliwość wykrywania zarówno znanych, jak i nieznanych mutacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie Sangera tradycyjnie było złotym standardem w testowaniu zarówno znanych, jak i nieznanych mutacji somatycznych. Jednym z ograniczeń sekwencjonowania Sangera jest jego granica wykrywalności (~ 10 - 20% zmutowanego allelu na tle WT)1. Ten poziom czułości jest nieodpowiedni do wykrywania mutacji somatycznych o niskim poziomie, które mogą być obecne w próbkach z tkanek przednowotworowych lub u pacjentów z niewielką liczbą krążących komórek nowotworowych lub gdy szpik kostny (BM) jest niejednolity. Sprawia to również, że ocena choroby resztkowej po terapii lub wykrywanie pojawiających się mutacji oporności podczas terapii jest trudne za pomocą samego konwencjonalnego sekwencjonowania2. Zastępując konwencjonalny PCR PCR blokowaniem typu dzikiego za pośrednictwem zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA) w sekwencjonowaniu Sangera, można osiągnąć czułość do 0,1% zmutowanego allelu w tle WT2,3,4. W WTB-PCR wzbogacenie o zmutowane allele uzyskuje się poprzez dodanie krótkiego (~ 10 - 14 NT) blokującego (LNA) oligonukleotydu, który wiąże się preferencyjnie z DNA WT, zapobiegając w ten sposób amplifikacji DNA WT. Zmutowany produkt WTB-PCR może być następnie sekwencjonowany. Blokując DNA WT, a nie selekcjonując pod kątem określonych mutacji, WTB-PCR pozwala na wzbogacenie zarówno znanych, jak i nieznanych mutacji obecnych w maleńkich frakcjach komórek.

Obecnie stosuje się wiele metod wykrywania mutacji we frakcjach małych komórek. Obejmuje to PCR specyficzny dla alleli, system mutacji opornych na amplifikację (ARMS), denaturującą wysokosprawną chromatografię cieczową (DHPLC), kulki, emulsje, amplifikację i magnetykę (BEAMing), uwalnianie i pomiar wywołany polem elektrycznym (EFIRM), temperaturę topnienia o wysokiej rozdzielczości i inne. Jednak większość z tych metod jest ograniczona przez wyniki fałszywie dodatnie i możliwość wykrycia tylko jednej mutacji, dla której test został zaprojektowany4. WTB-PCR pozwala jednak użytkownikowi na wizualizację śladów sekwencjonowania, co umożliwia wykrywanie wielu typów mutacji i może pomóc w wykluczeniu wyników fałszywie dodatnich spowodowanych artefaktami lub zdarzeniami deaminacji. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) może stanowić odpowiednią alternatywę dla konwencjonalnego sekwencjonowania, jednak znacznie większe koszty, złożoność i dłuższy czas oznaczania sprawiają, że jest to niepotrzebna opcja dla wielu typów chorób z kilkoma odrębnymi markerami molekularnymi lub do monitorowania pacjentów poddawanych terapii pod kątem pojawiających się mutacji oporności. Co więcej, wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich podczas wykrywania wariantów z częstością występowania zmutowanych alleli mniejszą niż 5% może stanowić problem dla NGS5,6.

Tutaj pokazujemy wzrost czułości osiągnięty przez WTB-PCR w badaniach przesiewowych pod kątem mutacji w genie czynnika różnicowania szpiku 88, jak opisali Albitar i wsp. 3 Mutacje MYD88 są ważnymi czynnikami diagnostycznymi i prognostycznymi w makroglobulinemii Waldenströma (WM), gammapatii monoklonalnej IgM o nieznanym znaczeniu (IgM-MGUS), chłoniaku strefy brzeżnej śledziony (SMZL) i chłoniaku rozlanym z dużych komórek B (DLBCL). Mutacje MYD88 występują w prawie wszystkich przypadkach WM i około 50% pacjentów z MGUS wydzielającym immunoglobulinę M (IgM). Natomiast mutacje MYD88 występują tylko u 0-6% pacjentów z SMZL i nie występują w szpiczaku mnogim7,8. Ponieważ nakładające się cechy morfologiczne, immunofenotypowe, cytogenetyczne i kliniczne między WM i SMZL lub IgM-szpiczakiem mnogim mogą często komplikować diagnostykę różnicową, obecność mutacji MYD88 może służyć jako użyteczny czynnik identyfikujący9. Mutacje MYD88 są również związane z większym obciążeniem chorobą u pacjentów z DLBCL i słabym całkowitym przeżyciem po terapii7,10. Dodatkowo, ponieważ mutacje MYD88 są częściej spotykane w aktywowanym DLBCL podobnym do komórek B (ABC) niż w DLBCL podobnym do komórek B w centrum zarodkowym (GCB) lub pierwotnym chłoniaku z komórek B śródpiersia (PMBL), status mutacji MYD88 może służyć jako marker zastępczy dla podtypu ABC11,12.

Szczegółowy protokół tutaj dostarczony służy jako szablon, na podstawie którego można opracować nowe testy, a większość istniejących testów sekwencjonowania można łatwo dostosować do dokładnego wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek. Podejście to może być również wykorzystywane do monitorowania i wykrywania opornych mutacji, które mogą rozwinąć się w nowotworach, a nawet bakterii, które mogą rozwinąć się podczas leczenia pacjentów terapią celowaną lub antybiotykami. Ponadto rozwiązuje i rozwiązuje wiele problemów związanych ze wzbogacaniem mutacji, szczególnie w tkance zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie testy próbek ludzkich zostały przeprowadzone po uzyskaniu zgody Institutional Review Board (IRB).

1. Ekstrakcja DNA z tkanki FFPE, krwi obwodowej i aspiratu szpiku kostnego

  1. Do tkanki FFPE szpiku kostnego z zestawem do ekstrakcji DNA FFPE
    1. Zacznij od tkanki FFPE z niebarwionych szkiełek (5 - 10 odcinków o grubości 5 - 10 μm).
      UWAGA: Jeśli zaczynasz od wiórów tkankowych, użyj 3 - 6 odcinków o grubości 5 - 10 μm i przejdź do kroku 1.1.6.
    2. Umieść szkiełka w koszu na szkiełka i przygotuj cztery zbiorniki do mycia (dwa na ksylen i dwa na 100% alkohol). Dodać minimalną objętość 600 ml roztworu do każdego koszyka.
    3. Odparafinować szkiełka, wykonując 5-minutowe mycie ksylenem w pierwszej tacy. Przenieś szkiełka do drugiego zbiornika do mycia ksylenem na dodatkowe 5 minut.
    4. Po odparafinowaniu myć szkiełka 100% alkoholem przez 5 min. Przenieść szkiełka do drugiego zbiornika do mycia alkoholem na dodatkowe 5 minut.
    5. Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia pod maską, a następnie zeskrob je żyletką do probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Jeśli dostępny jest szkiełko H&E ze wskazanym regionem guza, wyrównaj szkiełka i zeskrob tylko obszar guza.
    6. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w ulotce producenta dołączonej do zestawu.
  2. Do aspiratu BM i krwi obwodowej
    1. Wyodrębnij zgodnie z instrukcjami producenta, ulotką z tymi specyfikacjami.
      UWAGA: Istnieje wiele dostępnych na rynku zestawów i metod ekstrakcji DNA z tkanek i komórek FFPE. Praktycznie wszystkie mogą być używane. Użyj metody, która została ustalona w laboratorium.
      1. Użyj 200 μl krwi obwodowej (PB) lub 100 μl BM + 100 μL PBS.
      2. Użyj 4 μl RNazy A roztworu podstawowego.
      3. Eluować za pomocą 100 μl buforu elucyjnego.
  3. Kwantyfikacja DNA
    1. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru, zapewniając stosunek 260 nm do 280 nm wynoszący około 1,8 (dla czystego DNA). Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy, może to wskazywać na obecność białka, fenolu lub innych zanieczyszczeń, które mogą zakłócać dalsze zastosowania.
    2. Dostosuj stężenia DNA do około 50 - 100 ng/μl za pomocą odpowiedniego buforu elucyjnego.

2. PCR blokujący typu dzikiego

  1. Projekt podkładu
    1. Zaprojektuj i uzyskaj startery dla interesujących genów zgodnie z wcześniej opisanymi ogólnymi wytycznymi projektowania starterów PCR13. Dołącz uniwersalne startery sekwencjonowania M13 do przodu i do tyłu we starterach PCR.
      UWAGA: Test MYD88 został opracowany w celu amplifikacji eksonu 5 MYD88 (G259 - N291) i 110 nukleotydów znajdujących się w regionie intronowym 5' w celu pokrycia miejsca splicingu i części intronu 4. Startery do przodu i do tyłu zostały zaprojektowane z sekwencją 5'-M13 (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc), aby umożliwić wyżarzanie komplementarnych starterów sekwencjonujących (patrz tabela materiałów).
  2. Konstrukcja z zablokowanym oligonukleotydem kwasu nukleinowego
    1. Zaprojektuj oligonukleotyd blokujący tak, aby miał około 10 - 15 zasad długości i był komplementarny z matrycą WT, w której pożądane jest wzbogacenie mutantów.
      UWAGA: Krótszy oligo poprawi dyskryminację niedopasowania. Aby osiągnąć wysoką swoistość docelową, ważne jest, aby nie używać zbyt dużej ilości nukleotydów blokujących, ponieważ może to spowodować bardzo "lepki" oligonukleotyd. Zawartość i długość oraz nukleotyd blokujący powinny być zoptymalizowane w zależności od konkretnego nukleotydu, który należy zablokować. Ważne jest, aby osiągnąć wysoką specyficzność wiązania bez naruszania struktury drugorzędowej i ryzyka samokomplementarności.
    2. Zaprojektuj oligo blokującego tak, aby jego temperatura wynosiła 10–15 °C powyżej temperatury rozciągania podczas termocyklingu. DostosujTM, dodając lub usuwając zasady blokujące lub zastępując zasady blokujące DNA, unikając długich odcinków (3 - 4 zasady) blokowania zasad G lub C.
      1. Przejdź do strony internetowej oligo tools (patrz Spis materiałów) i wybierz narzędzie "blocking Oligo Tm Prediction".
      2. Wklej sekwencję szablonu WT, która ma zostać zablokowana, w polu "Sekwencja oligo". Dodaj znak "+" przed podstawami, aby wskazać podstawy blokujące.
      3. Wybierz przycisk "Oblicz", aby określić przybliżoną Tm hybrydy DNA-Blocker.
    3. Zaprojektuj oligo blokującego, aby uniknąć tworzenia się struktur drugorzędowych lub samo-dimerów.
      1. Wejdź na stronę oligo tools (patrz Spis materiałów) i wybierz narzędzie "blokowanie Oligo Optimizer".
      2. Wklej sekwencję szablonu WT, która ma zostać zablokowana, do pola. Dodaj znak "+" przed podstawami, aby wskazać podstawy blokujące.
      3. Zaznacz dwa pola "Struktura drugorzędna" i "Tylko własna". Naciśnij przycisk Analizuj, aby przejrzeć oligo pod kątem potencjalnie kłopotliwych struktur drugorzędowych lub samo-dimerów.
        UWAGA: Wyniki reprezentują bardzo przybliżone szacunkiTM struktur drugorzędowych i samo-dimerów. Niższe wyniki są zatem optymalne i można je osiągnąć, ograniczając parowanie bloker-bloker. Oligonukleotyd blokujący dla MYD88 [MYD88blocker (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)] został zaprojektowany tak, aby pokrywać aminokwasy Q262-I266 i zawiera odwrócony przez 3' dT, który hamuje zarówno wydłużanie przez polimerazę DNA, jak i degradację przez 3'-egzonukleazę. Ten specyficzny oligo blokujący to 17mer z 10 zasadami blokującymi, które są oznaczone jako "+N". Pozostałe 7 zasad to zwykłe nukleotydy DNA.
  3. Konfiguracja WTB-PCR i termocykl
    1. Przygotuj główną mieszankę WTB-PCR (MMX) przy użyciu 2,5 μl buforu reakcyjnego PCR 10x z 20 mM MgCl2, 250 μM dNTP, 0,2 μM startera do przodu i do tyłu, 1,2 μM MYD88bloker i DNAzy, wolnego od RNAse, ultraczystegoH2O, aby uzyskać końcową objętość roztworu 21,75 μl na reakcję.
      UWAGA: Stężenia robocze dotyczą końcowej objętości reakcji wynoszącej 25 μl (po dodaniu matrycy DNA i polimerazy). Konwencjonalny PCR MMX przygotowuje się po prostu pomijając dodanie blokera. Wszystkie kroki protokołu pozostają identyczne zarówno dla WTB, jak i konwencjonalnego PCR. Można to wykorzystać do walidacji i określenia wzbogacenia osiągniętego przez dodanie blokera.
      1. Obliczając ilość MMX do przygotowania, należy wziąć pod uwagę 3 dodatkowe reakcje (kontrole dodatnie i ujemne oraz kontrolę bez matrycy w celu sprawdzenia zanieczyszczenia) i co najmniej 1 dodatkową reakcję w przypadku błędu pipetowania.
    2. Dokładnie przekręć MMX. MMX może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do roku.
    3. Dodać 0,25 μl polimerazy DNA Taq na reakcję do MMX i odwrócić do mieszania. Po dodaniu polimerazy do MMX trzymaj ją na lodzie.
    4. Umieść nową 96-dołkową płytkę do PCR na zimnej płytce i odpipetuj 22 μl MMX z polimerazą do każdej studzienki reakcyjnej.
    5. Dodać 3 μl genomowego DNA (50 - 100 ng/μl do każdej z studzienek zawierających MMX z polimerazą.
    6. Uszczelnij płytkę i odwiruj na krótko, aby upewnić się, że roztwór dotrze do dna każdej studzienki.
    7. Załaduj płytkę PCR do termocyklera.
      1. Ustawić warunki termocyklingu dla reakcji WTB-PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 6 minut; 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie startera w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 min 20 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
        UWAGA: Najlepsza praktyka polega na wykonaniu pozostałej części protokołu w fizycznie oddzielonym obszarze, aby uniknąć zanieczyszczenia amplikonem w przyszłych konfiguracjach.
  4. Wykonaj elektroforezę żelową zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami14 w celu ustalenia, czy WTB-PCR się powiódł i potwierdzenia braku amplifikacji w kontroli bez matrycy.
  5. Oczyszczanie produktu PCR za pomocą kulek magnetycznych
    1. Usunąć kulki magnetyczne z 4 °C i doprowadzić do temperatury pokojowej.
    2. Przenieś 10 μl produktu PCR na nową płytkę PCR.
    3. Energicznie wiruj kulki magnetyczne, aby w pełni zawiesić cząstki magnetyczne.
    4. Dodaj 18 μl kulek magnetycznych do każdego dołka na nowej płytce. Odpipetować 10 razy.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Umieść płytkę PCR na bocznej płytce magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od roztworu.
    7. Odessać supernatant za pomocą pipety wielokanałowej, unikając osadu kulkowego.
    8. Dozować 150 μl 70% etanolu do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 sekund. Odessać etanol za pomocą pipety wielokanałowej i wyrzucić końcówki. Powtórz tę procedurę prania jeszcze raz.
    9. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 20 μl odessać pozostały etanol z każdej studzienki i wyrzucić końcówki.
    10. Po wyschnięciu studzienek (~ 10 min) zdejmij z płytki magnetycznej i dodaj 40 μl wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki i pipetuj 15 razy lub delikatnie przemieszaj.
    11. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    12. Umieść płytkę PCR na płytce magnetycznej na 1 minutę, aby oddzielić kulki od roztworu.
    13. Przenieść 35 μl oczyszczonego produktu na nową płytkę PCR. Jest to oczyszczony produkt PCR, który jest teraz gotowy do przeprowadzenia sekwencjonowania dwukierunkowego lub może być przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
      UWAGA: Podczas opracowywania nowego testu może być wymagane określenie ilościowe oczyszczonego produktu PCR. Amplikon DNA o stężeniu 1 - 3 ng/μl jest optymalny do sekwencjonowania dwukierunkowego. Jeśli stężenie jest stale niskie, proporcjonalnie zwiększ produkt PCR i kulki magnetyczne (1:1,8). Jeśli stężenie jest stale wysokie, eluuj większą ilością wody.

3. Sekwencjonowanie produktu WTB-PCR

  1. Sekwencjonowanie dwukierunkowe
    UWAGA: Poniższy protokół jest zmodyfikowaną formą instrukcji producenta, która została zoptymalizowana pod kątem użycia mniejszej liczby odczynników.
    1. Przygotuj mieszaniny reakcyjne do sekwencjonowania do przodu i do tyłu z 0,25 μl gotowej mieszanki reakcyjnej, 1,88 μl buforu do sekwencjonowania, 1,78 μM starterów sekwencjonowania M13-F lub M13-R i dodaj i DNAzę, bezlitosną RNAse, ultraczysty H2O, aby uzyskać końcową objętość roztworu 9 μl na reakcję. Ta mieszanina reakcji sekwencjonowania może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez okres do roku.
    2. Odpipetować 9 μl reakcji sekwencjonowania do przodu, wymieszać do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki PCR w celu przeprowadzenia reakcji sekwencjonowania do przodu. Powtórzyć na oddzielnej płytce dla reakcji odwrotnego sekwencjonowania.
    3. Dodaj 1 μl oczyszczonego produktu WTB-PCR do każdego dołka zarówno na płytce przedniej, jak i odwrotnej.
    4. Uszczelnij płytkę i odwiruj na krótko, aby upewnić się, że roztwór dotrze do dna każdej studzienki.
    5. Załaduj płytkę PCR do termocyklera.
      1. Ustawić warunki termocyklingu dla reakcji sekwencjonowania w następujący sposób: 96 °C przez 1 minutę; 30 cykli po 96 °C przez 10 s, 50 °C przez 5 s, 60 °C przez 4 minuty; Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania gotowości do oczyszczania.
  2. Oczyszczanie produktów do sekwencjonowania
    1. Przygotować świeży roztwór 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 100% etanolu w stosunku 1:25.
    2. Przygotuj świeży 70% roztwór etanolu.
    3. Dodać 30 μl octanu sodu/100% roztworu etanolu do każdej studzienki zarówno na płytce sekwencjonowania do przodu, jak i do tyłu, a następnie wymieszać pipetami 5 razy.
    4. Ponownie zamknąć płytkę i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    5. Odwirować płytkę o masie 2 250 x g przez 15 minut.
    6. Wyjmij uszczelniacz do płyt i odwróć pojemnik na odpady.
      UWAGA: Odwróć tylko raz, w przeciwnym razie pelety mogą poluzować się z dna studzienki.
    7. Umieść odwróconą płytkę na czystym ręczniku papierowym i odwiruj przy 150 x g przez 1 min.
    8. Do każdej studzienki dodać 150 μl 70% etanolu.
    9. Ponownie zamknąć płytkę i wirować z prędkością 2 250 x g przez 5 minut.
    10. Powtórz kroki 3.2.6 i 3.2.7.
    11. Jeśli studzienki nie są całkowicie suche, pozwól im wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że próbki są chronione przed światłem podczas suszenia.
    12. Dodać 10 μl formamidu do każdego dołka i wymieszać pipetą 10 razy. Ponownie uszczelnij płytkę.
    13. Denaturacja na termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 4 °C przez 5 minut.
    14. Po denaturacji należy wymienić uszczelniacz płytek na przegrodę i ułożyć na platformie sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta15.

4. Analiza wyników sekwencjonowania

  1. Wizualizuj ślady sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do analizy danych sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta16 i wyrównaj do odpowiednich sekwencji referencyjnych. Dopasuj MYD88 do sekwencji referencyjnej NCBI "NM_002468".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koncepcyjny przegląd WTB-PCR podczas rozbudowy jest przedstawiony na rysunku 1. Ponieważ niedopasowanie pojedynczego nukleotydu w hybrydzie bloker-DNA znacznie obniża jego temperaturę topnienia (ΔTm = 20 - 30 °C), amplifikacja allelu WT jest zablokowana, podczas gdy zmutowany matrycowy DNA może zakończyć rozszerzenie17. W ten sposób zmutowane DNA jest amplifikowane wykładniczo, podczas gdy DNA WT jest amplifikowane liniowo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test WTB-PCR wykorzystuje ogólny zestaw starterów z oligo blokującym zaprojektowanym do blokowania amplifikacji DNA WT podczas wydłużania (Figura 1). Produkt WTB-PCR jest następnie sekwencjonowany do analizy mutacyjnej. Użyteczność WTB-PCR/Sanger polega na jego prostocie, wysokiej czułości i wysokiej przepustowości. Korzystając z opisanych tutaj wytycznych, większość istniejących testów opartych na metodzie Sangera można po prostu zmodyfikować poprzez dodanie oligonukleotydu blokującego, ab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe Safe-Lock o pojemności 1,5 lub 2 mlEppendorf05-402-25
100% alkoholuVWR89370-084Klasa histologiczna; 91,5% etanol, 5% alkohol izopropylowy, 4,5% alkohol metylowy
3730XL sekwencerABIlub równoważny
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Do oczyszczania PCR z kulkami magnetycznymi
Aluminium folie uszczelniająceGeneMateT-2451-1Do PCR i przechowywania w chłodni
BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cykluLife Technologies4337455Do sekwencjonowania dwukierunkowego. Z 5x wirówką buforową do sekwencjonowania
5804Rotor EppendorfA-2-DWP (do płytki PCR)
Zimna płytka do płytek 96-dołkowychEppendorfZ606634
DNAse, wolne od RNAse, ultra-czystej wody
dNTP (100 mM)Invitrogen10297-117
DynaMag-96 Magnes bocznyThermo Fisher Scientific12027Do stosowania w oczyszczaniu PCR.
Absolutny poziom etanolu SigmaE7023200 proof, dla biologii molekularnej
Strona internetowa Exiqon Oligo Toolswww.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Polimeraza DNA Taq (5 U/µ L)Roche12032937001Z10x skoncentrowany bufor reakcyjny PCR, z 20 mM MgCl2
Aparat do elektroforezy2% żel agarozowy
Zestaw do ekstrakcji GeneRead DNA FFPE Qiagen180134Zawiera glikozylazę DNA uracylu niezbędną do redukcji artefaktów sekwencjonowania
Hi-Di FormamidABI4311320Do sekwencjonowania.
Oligonukleotyd LNAExiqon5001005'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = zasady LNA)
M13-F Starter sekwencjonowaniaABI5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT
M13-R Podkład sekwencjonującyABI5'-cag gaa aca gct atg
acc Mastercycler Pro S TermocyklerEppendorfE950030020
Mikrowirówka model 5430EppendorfFA-45-30-11 rotor (do probówek mikrowirówek 1,5/2 ml)
Spektrofotometr NanoDrop 2000Thermo Fisher Scientific
PCR starter forward IDT5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primerIDT5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGG TGT AGT AGT CGC AGA CA
PCR płytkiGeneMateT-3107-1
Pipety20, 200, 1 000 i mikro; L
Przegroda płytkowa, 96 dołkówABI4315933
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304Do aspiratu BM i krwi obwodowej
SeqScape Sortware v3.0ABI4474978Do analizy sekwencjonowania
Kosz
Octan sodu (3 M, pH 5,2) SigmaS7899
Sterylne końcówki20, 200, 1,000 i mikro; L
Termomikser C Eppendorf5382000023
Vortex genieScientific IndustriesSI-0236
Zbiornik~ 1,000 ml
KsylenVWR89370-088Klasa histologiczna
serii żelowej na suwak do pipet z filtrem do mycia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420(2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie mutacji somatycznychmutacje o niskiej cz stotliwo cimutacja MYD88zablokowany kwas nukleinowyuracylowa glikozylaza DNAoczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychsekwencjonowanie dwukierunkoweprojektowanie starter w

Powiązane artykuły