Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55133

⸱

15 lutego 2017

 , 
1Physiology & Neurobiology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Streszczenie

Ten protokół przedstawia rekonstrukcje neuronów na dużą skalę w połączeniu z wykorzystaniem niezależnych i bezstronnych analiz grupowania w celu stworzenia kompleksowego przeglądu cech morfologicznych obserwowanych wśród selektywnej populacji neuronów. Połączenie tych technik stanowi nowatorskie podejście do gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych. Łącznie techniki te umożliwiają pobieranie próbek na dużą skalę, a tym samym są bardziej kompleksowe, selektywnych populacji neuronów i ustanawiają bezstronne metody ilościowe do opisywania morfologicznie unikalnych klas neuronów w populacji.

Protokół opisuje użycie zmodyfikowanego wirusa wścieklizny do selektywnego oznaczania neuronów. Wirus wścieklizny z delecją G działa jak znacznik wsteczny po stereotaktycznym wstrzyknięciu do docelowej struktury mózgu i służy jako nośnik dostarczania i ekspresji EGFP w neuronach. Duża liczba neuronów jest infekowana przy użyciu tej techniki i wyraża GFP w swoich dendrytach, wytwarzając "podobne do Golgiego" pełne wypełnienia poszczególnych neuronów. W związku z tym metoda śledzenia wstecznego za pośrednictwem wirusa ulepsza tradycyjne techniki śledzenia wstecznego oparte na barwniku, wytwarzając pełne wypełnienia wewnątrzkomórkowe.

Pojedyncze, dobrze izolowane neurony, obejmujące wszystkie obszary badanego obszaru mózgu, są wybierane do rekonstrukcji w celu uzyskania reprezentatywnej próbki neuronów. Protokół określa procedury rekonstrukcji ciał komórkowych i kompletnych wzorców arboryzacji dendrytycznej znakowanych neuronów obejmujących wiele sekcji tkanki. Dane morfologiczne, w tym pozycje każdego neuronu w strukturze mózgu, są wyodrębniane w celu dalszej analizy. Standardowe funkcje programowania wykorzystano do przeprowadzenia niezależnych analiz skupień i ocen skupień w oparciu o metryki morfologiczne. Aby zweryfikować przydatność tych analiz, dokonano oceny statystycznej analizy skupień przeprowadzonej na 160 neuronach zrekonstruowanych w siatkowatym jądrze wzgórza wzgórza (TRN) makaka. Zarówno oryginalna analiza skupień, jak i przeprowadzone tutaj oceny statystyczne wskazują, że neurony TRN są podzielone na trzy subpopulacje, z których każda ma unikalne cechy morfologiczne.

Wprowadzenie

Neuroanatomia jest jednym z fundamentów neuronauki1, a niedawne zainteresowanie "konektomiczną" odnowiło entuzjazm do zrozumienia morfologicznej różnorodności populacji neuronów i połączeń między określonymi neuronami2. Metody znakowania i rekonstrukcji neuronów znacznie się poprawiły dzięki najnowszym innowacjom, w tym genetycznym i wirusowym metodom śledzenia obwodów3,4, umożliwiając bardziej kompleksowe badania morfologiczne populacji neuronów5. Oprócz ulepszeń w oznaczaniu poszczególnych neuronów, pojawiły się również techniki ilościowej analizy danych, które umożliwiają niezależną i bezstronną klasyfikację neuronów do odrębnych subpopulacji na podstawie danych morfologicznych5,6. Te bezstronne techniki stanowią ulepszenie bardziej tradycyjnych metod klasyfikacji jakościowej, które są standardem w tej dziedzinie od ponad wieku. Celem tego badania jest nakreślenie, krok po kroku, kombinacji znakowania neuronów za pośrednictwem wirusa w selektywnej populacji, wielkoskalowych rekonstrukcji kompleksowej próbki tych neuronów oraz ilościowej analizy danych opartej na niezależnym grupowaniu z oceną statystyczną. Łącząc te metody, nakreślamy nowatorskie podejście do gromadzenia i analizy danych neuroanatomicznych, aby ułatwić kompleksowe pobieranie próbek i bezstronną klasyfikację morfologicznie unikalnych typów neuronów w selektywnej populacji neuronów.

Jako przykład tych metod opisujemy naszą analizę dużej populacji neuronów w obrębie jednego sektora jądra siatkowatego wzgórza (TRN) makaka. Te dane pochodzą z wcześniejszego badania7. Przedstawiono metody selektywnego znakowania neuronów TRN rzutujących do grzbietowego bocznego jądra kolankowatego wzgórza (dLGN) przy użyciu chirurgicznego wstrzykiwania zmodyfikowanego wirusa wścieklizny kodującego EGFP4,8 (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 2). Ten zmodyfikowany wirus wścieklizny nie ma genu kodującego niezbędne białko płaszcza, eliminując transsynaptyczny ruch wirusa. Gdy wirus dostanie się do końców aksonów w miejscu wstrzyknięcia, działa jak tradycyjny znacznik wsteczny, z ważną korzyścią polegającą na napędzaniu ekspresji EGFP podczas pełnej arboryzacji dendrytycznej zainfekowanych neuronów5,9,10. W związku z tym ten wirus wścieklizny z delecją G może być wykorzystany do selektywnego infekowania i znakowania dowolnej populacji neuronów po wstrzyknięciu i transporcie wstecznym.

Aby przeprowadzić kompleksową analizę określonej populacji neuronów, ważne jest pobranie próbki z szerokiego rozmieszczenia neuronów w populacji. Ponieważ technika znakowania za pośrednictwem wirusa wytwarza kompletne, wewnątrzkomórkowe, "podobne do Golgiego" wypełnienia wielu neuronów aksonami w miejscu wstrzyknięcia wirusa, możliwe jest zrekonstruowanie bardzo dużej próbki neuronów w pełnym zakresie struktury mózgu. Dodatkowo, ponieważ zmodyfikowany wirus wścieklizny jest tak skuteczny w infekowaniu i znakowaniu dużej liczby neuronów, możliwe jest zrekonstruowanie setek neuronów na zwierzę. Przedstawiono procedury pobierania próbek od 160 neuronów w całym sektorze wzrokowym TRN11 w celu wygenerowania kompleksowej próbki neuronów TRN projekcyjnych z dLGN. Opisano proces rekonstrukcji poszczególnych neuronów za pomocą systemu rekonstrukcji neuronów obejmującego mikroskop, kamerę i oprogramowanie do rekonstrukcji. Opisano również metody określania położenia poszczególnych neuronów w strukturze mózgu (w tym przypadku w obrębie TRN) oraz weryfikacji objętości i lokalizacji miejsca iniekcji wirusa w strukturze (w tym przypadku w obrębie dLGN) za pomocą wolumetrycznych rekonstrukcji konturu. Przedstawiono kroki, które należy wykonać, aby wyeksportować dane morfologiczne i przeprowadzić niezależne analizy skupień na podstawie wskaźników morfologicznych zmierzonych dla każdego neuronu. Istnieją ograniczenia dotyczące metod grupowania, a także dostępnych jest wiele różnych algorytmów grupowania. W związku z tym opisano te opcje i korzyści płynące z niektórych z częściej używanych algorytmów. Analiza skupień nie zapewnia statystycznej weryfikacji unikalności klastrów. W związku z tym przedstawiono dodatkowe kroki w celu zweryfikowania optymalnego grupowania, a także relacji między danymi morfologicznymi w obrębie klastrów i między nimi. Opisano statystyczne metody oceny klastrów dla zestawu danych TRN w celu potwierdzenia, że neurony TRN są pogrupowane w trzy unikalne klastry na podstawie 10 niezależnych wskaźników morfologicznych.

Tak więc, opisując kroki selektywnego oznaczania, rekonstrukcji i analizy danych morfologicznych z określonej populacji neuronów, opisujemy metody ilościowego określania różnic morfologicznych między neuronami w populacji. Wcześniejsze odkrycia dotyczące różnych typów neuronów w sektorze wzrokowym makaka TRN zostały potwierdzone za pomocą oddzielnych metod oceny statystycznej. Mamy nadzieję, że techniki te będą miały szerokie zastosowanie w zestawach danych neuroanatomicznych i pomogą w ustaleniu ilościowej klasyfikacji różnorodności populacji neuronów w mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Tkanka badana w tym badaniu została przygotowana jako część oddzielnego badania5. W związku z tym wszystkie metody eksperymentalne z wykorzystaniem zwierząt zostały szczegółowo opisane w sekcji Metody eksperymentalne Briggs i in. (2016). Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w ramach wcześniejszego badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania. Etapy wstrzykiwania wirusa do dLGN i przetwarzania histologicznego tkanki mózgowej opisano pokrótce poniżej w punktach 1 - 2.

1. Stereotaktyczny wtrysk

  1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać w sterylnym środowisku przy użyciu technik aseptycznych. Sterylizuj parą wodną wszystkie metalowe narzędzia chirurgiczne, gazę i materiał do serwowania w autoklawie. Sterylizuj wszystkie materiały, które mogłyby zostać uszkodzone przez parę, za pomocą sterylizacji chemicznej (np. tlenek etylenu).
  2. Indukuj i utrzymuj znieczulenie zgodnie z wymaganiami specyficznymi dla zwierząt i protokołu.
    1. W przypadku wstrzyknięcia wirusa u małp należy wywołać znieczulenie ketaminą (10 mg / kg) i utrzymywać zwierzęta w pełnym znieczuleniu chirurgicznym za pomocą izofluranu (1 - 3% wdychany w tlenie), monitorując wygasłe CO2, EKG, częstość oddechów i temperaturę, stale i okresowo sprawdzając odcień szczęki, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
  3. Umieść zwierzę w ramce stereotaktycznej, aby ustabilizować pozycję głowy i umożliwić użycie współrzędnych stereotaktycznych do zlokalizowania interesującej nas struktury iniekcji (np. dLGN). W przypadku pomiaru reakcji wzrokowych umieść krople do oczu (1% krople do oczu z atropiną, jeśli pożądane jest rozszerzenie źrenicy, w przeciwnym razie krople do oczu z solą fizjologiczną), a następnie soczewki kontaktowe w obu oczach, aby zapobiec wysuszeniu. Jeśli nie mierzysz reakcji wzrokowych, umieść maść okulistyczną w oczach.
  4. Wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej i cofnij skórę i mięśnie.
  5. Zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi dla struktury zainteresowania (dLGN) w jednej półkuli wykonaj małą kraniotomię.
  6. Stopniowo opuszczaj elektrodę rejestrującą (np. elektrodę wolframową lub platynowo-irydową (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 3) zaciśniętą na mikromanipulatorze, który jest ręcznie ustawiany) przez kraniotomię do mózgu. W razie potrzeby do penetracji opony twardej można zastosować elektrody o niższej impedancji (< 1 MΩ) i nieco grubsze (średnica ~ 250 μm).
  7. Zapisz pozycję manipulatora na powierzchni kory mózgowej i w punkcie, w którym mierzone są reakcje wzrokowe. Reakcje wzrokowe są słyszalne, zablokowane w czasie reakcje neuronalne na światło błyskające w oczach za pomocą oftalmoskopu lub małej diody LED/latarki.
  8. Określ położenie i grubość dLGN, odnotowując pozycje manipulatora na początku, w środku i na końcu odpowiedzi wzrokowych i odejmując od tych wartości położenie powierzchni korowej. Zapisać głębokość dla każdego zaprojektowanego miejsca wstrzyknięcia w obrębie dLGN.
    UWAGA: Podobne procedury można zastosować do lokalizowania struktur niewzrokowych za pomocą odpowiednich bodźców sensorycznych. Dodatkowo, sprzężone systemy nagrywania/wstrzykiwania mogą być również wykorzystywane do celowania w małe struktury mózgu.
  9. Po odnotowaniu optymalnych miejsc wstrzyknięcia należy wyjąć elektrodę rejestrującą i umieścić pipetę do wstrzykiwań (szklaną pipetę lub strzykawkę do wstrzykiwań) w tej samej pozycji stereotaktycznej i obniżyć do odpowiedniej głębokości dla każdego wstrzyknięcia, zaczynając od najgłębszego miejsca wstrzyknięcia i przechodząc do najpłytszego, odczekując co najmniej 1 minutę po wstrzyknięciu przed zmianą pozycji elektrody. Pipety szklane o średnicy zewnętrznej ~ 50 μm mogą zmniejszać przepływ wsteczny wirusa w porównaniu do końcówek strzykawek (średnica ~ 200 μm).
  10. Za pomocą systemu iniekcyjnego (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Wyposażenia, wiersz 4), pikospritzera lub pompy strzykawkowej, wstrzyknąć małe objętości (1 - 5 μL; patrz instrukcje producenta dotyczące procedur wstrzykiwania) zmodyfikowanego wirusa wścieklizny na wielu (3 - 10) głębokości z szybkością ~ 100 nL/min w strukturze docelowej (dLGN). Uwaga: W większych strukturach docelowych (np. małpi dLGN) można wykonać oddzielne penetracje iniekcyjne. Dostosuj całkowitą objętość wtrysku do docelowego rozmiaru struktury.
  11. Należy zrobić przerwę na co najmniej 5 minut przed wyjęciem pipety iniekcyjnej. Po wyjęciu pipety iniekcyjnej należy wypełnić kraniotomię materiałem ochronnym (przykleić kawałek kości, nałożyć wosk kostny lub piankę żelową), a następnie zszyć mięsień i skórę z powrotem razem.
  12. Podać leki przeciwbólowe (np. ketoprofen) i antybiotyki przed zakończeniem operacji i stale monitorować zwierzę, aż zwierzę zacznie chodzić.
  13. Przez co najmniej 3 dni i do 10 dni po operacji należy codziennie monitorować zwierzę, aby upewnić się, że szwy są czyste, suche i nienaruszone, a zwierzę nie wykazuje oznak bólu ani dyskomfortu. W razie potrzeby należy codziennie podawać leki przeciwbólowe i antybiotyki. Rozpoczęcie trzymania zwierząt po operacji w pełni wyzdrowiało po operacji.

2. Zbieranie, cięcie i barwienie tkanek

  1. Odczekaj 7 - 14 dni na wsteczny transport wirusa, a następnie poddaj zwierzę eutanazji przez przedawkowanie roztworu do eutanazji (np. Euthasol) i perfuzję zwierzęcia przezsercowo 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, 4% paraformaldehydu, a następnie 4% paraformaldehydu z 10% sacharozy.
  2. Usuń mózg (patrz12 dla analogicznych kroków w modelu gryzonia) i umieść w 20 - 30% sacharozie z 4% paraformaldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym i wstaw do lodówki na 1 - 2 dni.
  3. Gdy mózg opadnie na dno pojemnika, usuń go i pokrój tkankę na bloki zawierające obszar mózgu z wstecznie oznakowanymi neuronami (np. kora wzrokowa) i strukturę docelową wstrzyknięcia (np. dLGN). Wytnij te same bloki tkanki z półkuli bez wstrzyknięcia - będą one służyć jako sekcje kontrolne. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy natychmiast rozpocząć zabiegi histologiczne na świeżo wyciętej tkance.
  4. Przeciąć tkankę wieńcowo o grubości 50 μm na odcinek za pomocą mikrotomu do zamrażania (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 5).
  5. Zabarwić wszystkie sekcje pod kątem aktywności oksydazy cytochromowej (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersze 5 - 8), aby uwidocznić warstwy korowe i struktury podkorowe13. Uwaga: Skrawki można przechowywać przez noc w lodówce w ostatnim płukaniu po barwieniu oksydazą cytochromową.
  6. Oznacz wszystkie sekcje pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko GFP (rozcieńczenie 1:1,000, ~ 12 godzin inkubacji; patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 9), a następnie drugorzędowym przeciwciałem pasującym do pierwotnego gospodarza i oznaczone biotyną5 (rozcieńczenie 1:500, 2 - 4 godziny inkubacji; patrz Tabela specyficznych materiałów/sprzętu, wiersz 10). Zaleca się inkubację skrawków w przeciwciałie drugorzędowym przez noc.
  7. Oznacz skrawki kompleksem awidyny/biotyny, a następnie reaguj z DAB i nadtlenkiem, aby trwale zabarwić wszystkie znakowane neurony5.
  8. Zamontuj sekcje na szkiełkach z podkładem i pozostaw do wyschnięcia na noc.
  9. Usuń skrawki za pomocą serii płukanek alkoholowych i ksylenowych, a następnie zakryj poślizg14.

3. Rekonstrukcja neuronów

UWAGA: Wszystkie rekonstrukcje dla oryginalnych eksperymentów zostały wykonane przy użyciu systemu rekonstrukcji neuronów składającego się z mikroskopu (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 14), dołączonej kamery (zobacz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 13) i pakietu oprogramowania do rekonstrukcji (zobacz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, rzędy 11–12). Rekonstrukcja neuronów wspomagana oprogramowaniem umożliwia wizualizację slajdów tkankowych pokrytych komputerowymi rysunkami procesów neuronalnych. Co ważne, oprogramowanie digitalizuje dane rekonstrukcji morfologicznej w trzech wymiarach, umożliwiając ekstrakcję informacji morfologicznych specyficznych dla pozycji. Powiązany program do ekstrakcji danych (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Urządzeń, wiersz 12) umożliwia ekstrakcję bogatego zestawu danych morfologicznych z każdej zapisanej rekonstrukcji.

  1. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka mikroskopowego i ustaw ostrość na pojedynczym interesującym nas fragmencie za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (np. 2X lub 10X). Upewnij się, że obraz z kamery jest widoczny w widoku oprogramowania, prawidłowo ustawiając migawkę aparatu.
  2. Wybierz znakowane neurony w strukturze mózgu będącej przedmiotem zainteresowania (np. TRN), które są rozsądnie izolowane, aby jednoznacznie zrekonstruować jak największą część arboryzacji dendrytycznej. Preferencyjnie wybieraj neurony, jeśli ciało komórki znajduje się w całości w jednej sekcji, aby uchwycić jak największy obszar każdego ciała komórki i dokładnie oszacować jego obszar i okrągłość. Użyj obiektywu mikroskopu 10X, aby zidentyfikować ciało komórki w sekcji domowej.
  3. Po zidentyfikowaniu dobrze wybarwionego, dobrze wyizolowanego neuronu, dodaj sekcję "home" zawierającą ciało komórki do Menedżera sekcji, klikając przycisk "Nowa sekcja". Wprowadź liczbę sekcji do uwzględnienia (na początek zaleca się 2-3 sekcje). Po wyświetleniu monitu przypisz grubość przekroju 50 μm (patrz krok 2.3).
  4. Prześledź kontury odpowiednich struktur mózgu w sekcji domowej zawierającej ciało komórki. Użyj obiektywu/powiększenia 2X do śledzenia konturów.
    1. Najpierw wybierz "Kontur" z menu rozwijanego na górnym pasku narzędzi, a następnie wybierz typ konturu z menu rozwijanego (np. "LGN" lub "TRN").
    2. W razie potrzeby obrysuj kontury konstrukcji docelowej (np. TRN), a także sąsiednich konstrukcji, klikając punkty wzdłuż konturu za pomocą myszy jako narzędzia do rysowania.
    3. Wybierz opcję "Zamknij kontur", klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając tę opcję z menu, aby zakończyć i objąć każdy obrysowany kontur.
  5. Umieść znacznik na środku docelowej struktury, klikając żądany symbol znacznika na prawym pasku narzędzi, a następnie klikając żądane miejsce w rekonstrukcji, aby umieścić znacznik w tym miejscu. Użyj tego samego typu znacznika, aby zaznaczyć środek struktury docelowej we wszystkich rekonstrukcjach.
  6. Po zakończeniu konturów obrysuj kontur ciała komórki za pomocą 40-60-krotnych obiektywów/powiększenia. Aby to zrobić, najpierw wybierz "Neuron" z menu rozwijanego na górnym pasku narzędzi, a następnie wybierz strukturę neuronu do śledzenia, w tym przypadku "Ciało komórki". Następnie prześledzić ciało komórki jak w ppkt 3.4.
  7. Umieść inny znacznik stylu na środku treści komórki, postępując zgodnie z krokami opisanymi w punkcie 3.5.
  8. Śledź wszystkie dendryty, zaczynając od ciała komórki.
    1. Najpierw wybierz "Dendrite" z menu rozwijanego. Następnie śledź każdy dendryt, zaczynając od korpusu komórki i używając myszy jako narzędzia do rysowania. Pamiętaj, aby dostosować głębokość z w całym śledzeniu, aby dokładnie uchwycić kąt i kierunek dendrytu.
    2. Umieść węzeł w każdym punkcie rozgałęzienia wzdłuż dendrytu, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając z menu rozwijanego "Węzeł rozwidlający" lub "Węzeł trifurkacyjny". Używaj obiektywu/powiększenia 40 - 60x do wszystkich rekonstrukcji dendrytów.
    3. Na końcu każdego dendrytu kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zakończenie" z menu rozwijanego.
  9. Zidentyfikuj zakończenia dendrytyczne, które prawdopodobnie będą kontynuowane w sąsiedniej sekcji, i ustaw je na odpowiedniej głębokości z na obrazie mikroskopowym. Uwzględnij główne punkty orientacyjne w pobliżu, takie jak naczynia krwionośne lub łatwo rozpoznawalne wzory lub wiązki dendrytów na obrazie mikroskopowym.
    1. Zmniejsz powiększenie do 20X lub 10X na mikroskopie (wybierz powiększenie, które pozwala na największą wizualizację punktów orientacyjnych) i zrób zdjęcie obrazu mikroskopowego za pomocą aparatu cyfrowego (np. telefonu komórkowego, tabletu) przyłożonego do ekranu komputera.
  10. Przejdź do sąsiedniej sekcji na slajdzie i wyrównaj kontury poprzednio obrysowanego odcinka z granicami dLGN i TRN w nowej sekcji.
  11. Przywróć pole widzenia do ogólnego obszaru korpusu komórki (w oparciu o kontury i główne punkty orientacyjne) i zwiększ powiększenie z powrotem do 10 - 20X.
  12. Użyj zdjęcia zakończeń dendrytów z poprzednio narysowanej sekcji, aby pomóc w wyrównaniu zakończeń z początkami dendrytów w nowej sekcji.
    1. Aby obrócić ślad i przesunąć go w celu wyrównania dendrytów, użyj narzędzia strzałki, aby wybrać rekonstrukcję, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przenieś" z menu rozwijanego.
    2. Alternatywnie użyj narzędzia "Dopasuj", aby dopasować dendrytyczne zakończenia do początków. Wybierz narzędzie Dopasuj z górnego paska narzędzi, a po wyświetleniu monitu kliknij zakończenie w rekonstrukcji i odpowiadający mu punkt kontynuacji na obrazie. Powtórz dla 3 lub więcej zakończeń.
  13. Gdy śledzenie z poprzedniej sekcji zostanie wyrównane z dendrytami w nowej sekcji, upewnij się, że odpowiednia nowa sekcja jest wybrana w menedżerze sekcji, klikając bieżącą sekcję. Można też dodać nowy przekrój do Menedżera przekrojów, jak opisano powyżej w 3.3, dostosowując odpowiednio głębokość z i położenie każdej nowej sekcji względem sekcji głównej i ustawiając grubość każdej sekcji na 50 mm (patrz krok 2.3).
  14. Zwiększ powiększenie do 40 - 60X i śledź kontynuacje dendrytu, klikając prawym przyciskiem myszy na końcu dendrytu z rekonstrukcji i wybierając "Dodaj do zakończenia" z menu rozwijanego, a następnie śledząc dendryt za pomocą myszy jako narzędzia do rysowania. Postępuj zgodnie z monitem, aby określić, czy kontynuacja znajduje się w nowej sekcji.
  15. Podążaj za dendrytami przez co najmniej 3 sąsiednie sekcje (po jednym z każdej strony sekcji głównej), wykonując kroki 3.8 - 3.15. Dodawaj do rekonstrukcji, aż co najmniej 3 całkowite sekcje zostaną prześledzone dla neuronu lub do momentu, gdy dendryty nie będą już mogły być śledzone lub znajdowane. W razie potrzeby obrysuj kontury w sąsiednich sekcjach, wykonując powyższe czynności.

4. Niezależne grupowanie

Uwaga: Niezależne analizy skupień umożliwiają bezstronne analizy dużych, wielowymiarowych zbiorów danych, które w innym przypadku mogłyby być trudne do wizualizacji i, co ważne, dostarczają ilościowej oceny różnorodności morfologicznej. Platforma programistyczna oparta na macierzy jest bardzo przydatna do analizy wielowymiarowych zbiorów danych i umożliwia wyrafinowane manipulacje danymi i analizy statystyczne. Funkcje wymienione w krokach 4 - 6 są zdefiniowane na platformie programistycznej wymienionej w Tabeli Konkretnych Materiałów/Urządzeń, wiersz 15.

  1. Wyodrębnij dane morfologiczne z każdej pojedynczej rekonstrukcji neuronalnej za pomocą programu ekstrakcji powiązanego z systemem rekonstrukcji neuronów (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersze 11 - 12).
    1. Najpierw wybierz dane morfologiczne pożądane dla każdej rekonstrukcji, w tym: informacje o konturze, informacje o markerach, dane morfologiczne ciała komórki i arboryzacji dendrytycznej itp.
    2. Z menu rozwijanego Edytuj na górnym pasku narzędzi wybierz "Zaznacz wszystkie obiekty". Następnie wybierz "Analiza konstrukcji rozgałęzionej" z menu rozwijanego Analiza na górnym pasku narzędzi, kliknij każdą zakładkę i wybierz żądane opcje analizy w każdej zakładce.
    3. Wyodrębnij wszystkie żądane dane, klikając przycisk "OK" w oknie Analiza i zapisz w formacie arkusza kalkulacyjnego, klikając prawym przyciskiem myszy okna wyjściowe i wybierając "Eksportuj do Excela".
  2. Skompiluj główny arkusz kalkulacyjny (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu, wiersz 16), w którym każda zmienna/metryka morfologiczna jest reprezentowana przez pojedynczą obserwację numeryczną na neuron. W tym głównym arkuszu kalkulacyjnym zapisz identyfikator wiersza dla każdego neuronu.
  3. Należy sprawdzić, czy wszystkie zmienne uwzględnione w analizie skupień (np. metryki morfologiczne) są od siebie niezależne. Na przykład liczba węzłów będzie skorelowana z liczbą gałęzi w arboryzacji dendrytycznej lub aksonalnej. W związku z tym tylko jedna z tych dwóch zmiennych powinna zostać uwzględniona w analizie skupień.
  4. Upewnij się, że każdy pomiar zawiera obserwację dla każdej zmiennej, tj. każdy neuron (pomiar) musi mieć punkt danych (obserwację) odpowiadający każdej metryce morfologicznej (zmiennej). Jeśli brakuje obserwacji dla określonej zmiennej (na przykład długości aksonu) dla podzbioru neuronów, ta zmienna (długość aksonu) nie może zostać uwzględniona w analizie skupień.
  5. Uporządkuj dane w głównym arkuszu kalkulacyjnym w jedną macierz, w której każdy wiersz reprezentuje neuron, a każda kolumna zawiera dane liczbowe dla każdej metryki morfologicznej (rysunek 1). Na przykład zestaw danych zawierający 100 neuronów, dla których istnieją obserwacje dla 5 zmiennych niezależnych, byłby reprezentowany przez macierz 100 x 5 (wiersz po kolumnie). Nie jest konieczne dołączanie żadnej identyfikacji dla każdego neuronu w macierzy - indeks wierszy będzie służył jako unikalny identyfikator każdego neuronu. W matrycy nie powinno być również żadnych luk ani "NaN". Zapisz macierz jako pojedynczą zmienną (np. Dane = [macierz 100 x 5]; zobacz Plik kodu uzupełniającego, aby uzyskać przykładowy kod).
  6. Wybierz algorytm do obliczania odległości między punktami reprezentującymi poszczególne neurony w przestrzeni n-wymiarowej, gdzie n jest definiowane przez liczbę zmiennych. Funkcja "pdist" zapewnia elastyczność w obliczaniu odległości między neuronami. Domyślnym sposobem obliczania odległości jest odległość euklidesowa i była ona wcześniej używana do podobnych analiz danych morfologicznych neuronów5,6.
  7. Z danymi wyjściowymi odległości między neuronami funkcji "pdist", użyj funkcji "wiązanie", aby utworzyć klastry. Również w tym przypadku dostępnych jest wiele opcji grupowania. Metoda Warda i odległość środka ciężkości dały podobne wyniki w analizach zbiorów danych morfologicznych5,6.
  8. Jeśli jest to pożądane, użyj funkcji 'kmeans' jako alternatywnego podejścia do grupowania funkcji 'pdist' i 'linkage'. 'kmeans' wykorzystuje kwadrat odległości euklidesowej do obliczania odległości między neuronami, a następnie odległość środka ciężkości do przypisywania klastrów.
  9. Aby zwizualizować hierarchiczne drzewo klastrów, należy użyć funkcji "dendrogram" na danych wyjściowych operacji "powiązanie". Ta funkcja ma domyślne ustawienie, które ogranicza wizualizację do 30 pomiarów, ale można je zastąpić, określając liczbę wyświetlanych pomiarów (np. neuronów). Dendrogram ilustruje odległości sprzężeń na osi y dla każdego z neuronów, identyfikowane przez ich indeks rzędów na osi x.
    UWAGA: Dane wyjściowe "sprzęgnięcia" i "dendrogramu" nie definiują optymalnej liczby klastrów. Wynik 'kmeans' przypisuje pomiary do klastrów, ale nie sprawdza, czy te klastry są optymalne. Można przeprowadzić oddzielne porównania statystyczne i weryfikację optymalnego grupowania (patrz poniżej).

5. Weryfikacja grupowania

Uwaga: Jak stwierdzono powyżej, analiza skupień sama w sobie nie dostarcza bezpośrednio statystycznej oceny, czy klastry zilustrowane w dendrogramie klastra są unikalne i reprezentatywne dla próby. Zaproponowano metody weryfikacji klastrów z dendrogramu15, jednak nie zapewniają one statystycznej weryfikacji optymalnego grupowania. Istnieje wiele metod weryfikacji optymalnego grupowania.

  1. Metoda 1: Ocena grupowania:
    1. Użyj funkcji 'evalclusters' określającej metodę używaną do obliczania klastrów, takiej jak 'kmeans' lub 'linkage'. Można również ocenić dane wyjściowe modelu mieszaniny Gaussa (patrz krok 5.2 poniżej; zobacz Plik kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładowym kodem).
    2. Określ kryterium oceny spośród kilku opcji (np. "CalinskiHarabasz" - opisy opcji kryterium znajdują się w menu Pomoc, szukając "evalclusters").
    3. Określ zakres optymalnych numerów klastrów do przetestowania (np. [1:6], aby sprawdzić, czy 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 klastrów jest optymalnych).
      Uwaga: Wynikiem "evalclusters" jest optymalna liczba klastrów, biorąc pod uwagę określony algorytm grupowania i kryterium.
  2. Metoda 2: Grupowanie modelu mieszaniny Gaussa:
    UWAGA: Algorytmy grupowania modeli mieszanin gaussowskich (GMM) zakładają, że obserwacje dla każdej zmiennej pochodzą z mieszaniny rozkładów Gaussa definiujących każdy domniemany grupter, z których każdy ma własną średnią i kowariancję. GMM następnie wykorzystuje algorytm maksymalizacji oczekiwań do przypisania prawdopodobieństwa a posteriori do każdego pomiaru, wskazując prawdopodobieństwo przynależności do określonego cluster16.
    1. Zaimplementuj GMM za pomocą funkcji "fitgmdist", wprowadzając przypuszczalną liczbę klastrów, które można obserwować w danych. Alternatywnie, aby uniknąć przypisania a priori liczby klastrów, należy użyć analizy głównych składowych (PCA) z serią różnych optymalnych numerów klastrów, wykonując kroki opisane tutaj (zobacz Plik kodu uzupełniającego dla przykładowego kodu).
    2. Użyj funkcji "pca" na oryginalnej macierzy danych i zapisz wyniki głównych składowych jako dane wyjściowe.
    3. W pętli rozpoczynającej się od 1 i przechodzącej przez pewną liczbę przypuszczalnie optymalnych klastrów, użyj funkcji "rozkład.fitgm" na wynikach głównych składowych i wygeneruj GMM dla każdej liczby przypuszczalnie optymalnych klastrów.
    4. Oceń każdy GMM, badając ujemne prawdopodobieństwo logarytmu, kryterium informacyjne Akaike i kryterium informacyjne Bayesa. GMM z najniższymi kryteriami jest optymalny.
    5. W razie potrzeby należy sprawdzić, czy średnie wartości dla każdego klastra różnią się znacząco, gdy liczba klastrów jest optymalna (średnie z każdego klastra są przechowywane w wyjściu "mu" każdego GMM).

6. Analizy statystyczne danych grupowanych

  1. Po ustaleniu optymalnej liczby klastrów za pomocą hierarchicznego grupowania i ocenie wróć do oryginalnych danych, rozdziel neurony na klastry i określ, które metryki morfologiczne przyczyniają się do grupowania neuronów w unikalne klasy.
  2. Posortuj oryginalne dane metryk morfologicznych w taki sposób, aby neurony były pogrupowane zgodnie z przypisaniem klastrów.
  3. Aby zbadać relacje między danymi morfologicznymi między neuronami (dla wszystkich neuronów lub dla neuronów podzielonych na klastry), wykonaj dopasowania regresji liniowej do 2- i 3-kierunkowych porównań morfologicznych obserwacji metrycznych. Dopasowania te można oszacować za pomocą funkcji "dopasowanie" i ocenić za pomocą funkcji "fitlm", w której wartość wyjściowa dopasowania obejmuje wartości R2 i p dla dopasowań regresji.
  4. Aby zbadać zależności statystyczne między neuronami w każdym klastrze, użyj nieparametrycznych testów dla dwóch prób (test sumy rang Wilcoxona) lub testów porównawczych dla wielu prób (ANOVA), w zależności od liczby klastrów. Co ważne, zastosowanie ANOVA dla wielu prób zapewnia, że wartości p są korygowane dla wielokrotnych porównań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykazaliśmy wcześniej, że wielkoskalowe rekonstrukcje neuronów w obrębie wyselekcjonowanej populacji są możliwe po wstrzyknięciu zmodyfikowanego wirusa wścieklizny do dLGN5Niedawno tę samą tkankę wykorzystano do zrekonstruowania 160 neuronów w sektorze wzrokowym TRN (Bragg i wsp.w recenzji; Rycina 2A-B) zgodnie ze szczegółowymi krokami metodologicznymi opisanymi powyżej. W badaniu jądra siatkowatego wzgórza (TRN) zidentyfikowano trzy unikalne klastry n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania neuroanatomiczne pozostały filarem neurobiologii, a niedawne zainteresowanie konektomomiką i relacjami struktura-funkcja odnowiło entuzjazm dla szczegółowej charakterystyki morfologicznej selektywnych populacji neuronów. Tradycyjnie, badania neuroanatomiczne opierały się na jakościowych klasyfikacjach neuronów w morfologicznie odrębne klasy neuronów zdefiniowane przez ekspertów neuroanatomów. Dzięki postępom w technikach rekonstrukcji neuronów i ekstrakcji danych morfologicznych, możliwe jest obecnie wykorzystani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować doktorom Edowi Callawayowi i Marty'emu Usreyowi za umożliwienie nam wykorzystania tkanki przygotowanej w ramach wcześniejszego badania oraz Libby Fairless i Shiyuan Liu za pomoc w rekonstrukcji neuronów. Praca ta została sfinansowana przez NIH (NEI: EY018683) i Fundację Whitehall.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SADΔ G-EGFPE.M. Callaway Laboratory, Salk Instituteprzygotowane przez Dr. F. Osakada. Wirus wścieklizny z delecją G dostępny za pośrednictwem Instytutu Salka Wirusowy rdzeń
Elektroda rejestrująca: platyna/iryd lub wolframFHCUEPSGGSE1N2MOdwiedź stronę internetową (www.fh-co.com), aby zapoznać się z alternatywnymi specyfikacjami zamówienia
Nanoject IIDrummod Scientific3-000-204, 110VAlternatywy: picospritzer, strzykawka Hamilton
Mikrotom do zamrażaniaThermo Scientific
DABSigma AldrichD5905-50TABTetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny, tabletka, podłoże 10 mg w tabletce. Uwaga: czynnik rakotwórczy - musi być wybielony przed wyrzuceniem
Cytochrom CSigma AldrichC2037-100MG
KatalazaSigma-AldichC9322-5G
Królik anty-GFPLife Technologies/Thermo Fisher#A-11122 Przeciwciało pierwszorzędowe
Biotynylowane kozy anty-królikiVector Laboratories#BA-1000Przeciwciało wtórne
Neurolucida System Oprogramowanie MicroBrightFielddo śledzenia i analizy neuronów. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida ExplorerOprogramowanie do eksportu danychMicroBrightField
Kamera Microfire Optoelektroniczna kamera mikroskopowao rozdzielczości 2 megapikseli
Mikroskop Nikon E800firmy Nikon Instruments Inc.Biologiczny mikroskop badawczy. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
MatlabThe MathWorks Inc. Oprogramowanie do matematyki obliczeniowej oparte na macierzy. http://www.mathworks.com
Microsoft OfficeExcel Arkusz kalkulacyjnyMicrosoft
. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdfProgram

Bibliografia

  1. Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , Maloine. (1911).
  2. Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
  3. Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
  4. Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
  5. Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
  6. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
  7. Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
  8. Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
  9. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
  10. Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
  11. Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
  14. Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).
  15. Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
  16. Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
  17. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstrukcja neuron wanaliza skupieledzenie za pomoc wirusa w ciekliznyarboryzacja dendrytycznawyr wnywanie przekroj w tkankowychregulacja g boko ci Zdane neuroanatomiczneocena statystycznaj dro siatkowe wzg rza

Powiązane artykuły