Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55139

⸱

15 lutego 2017

 ,  ,  , 
1Department for Molecular and Cellular Biology, Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), 2Molecular Neurobiology Department, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC-UAM)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

Streszczenie

Układ nerwowy składa się z ogromnej liczby różnych typów neuronów. Te subpopulacje neuronalne charakteryzują się, między innymi, odrębną morfologią dendrytyczną, specyficznymi wzorcami połączeń aksonalnych i selektywnymi reakcjami na odpalanie. Mechanizmy molekularne i komórkowe odpowiedzialne za te aspekty różnicowania podczas rozwoju są nadal słabo poznane.

Tutaj opisujemy połączone protokoły do oznaczania i charakteryzowania strukturalnej łączności i pobudliwości neuronów korowych. Modyfikacja protokołu elektroporacji in utero (IUE) umożliwia znakowanie rzadkiej populacji neuronów. To z kolei umożliwia identyfikację i śledzenie dendrytów i aksonów poszczególnych neuronów, precyzyjną charakterystykę laminarnego położenia projekcji aksonalnych oraz analizę morfometryczną. IUE może być również używany do badania zmian w pobudliwości neuronów typu dzikiego (WT) lub genetycznie modyfikowanych poprzez połączenie go z zapisem całych komórek z ostrych wycinków mózgów poddanych elektropostacji. Te dwie techniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia sprzężenia połączeń strukturalnych i funkcjonalnych oraz mechanizmów molekularnych kontrolujących różnorodność neuronów podczas rozwoju. Te procesy rozwojowe mają ważne implikacje dla okablowania aksonów, funkcjonalnej różnorodności neuronów i biologii zaburzeń poznawczych.

Wprowadzenie

Rozwój struktur dendrytycznych i aksonalnych jest ważnym aspektem regulacji obwodów w układzie nerwowym, w tym w korze mózgowej. Odgrywa kluczową rolę podczas selektywnego okablowania różnych subpopulacji neuronów. Szereg ostatnich doniesień wykazało, że oprócz łączności, różnorodność molekularna neuronów znajduje odzwierciedlenie w nabywaniu wysoce specyficznych sposobów odpalania. Jednak mechanizmy decydujące o pobudliwości i łączności różnych podtypów neuronów podczas rozwoju, a także o stopniu ich koordynacji, są nadal słabo poznane1,2.

Analizy in vivo utraty i wzmocnienia funkcji pozwalają na badanie związku między poziomem ekspresji określonych genów a ich wpływem na rozwój obwodu. Elektroporacja in utero (IUE) jest techniką szeroko stosowaną do badania funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania w określonych populacjach neuronów oraz do badania ogólnych wzorców ich połączeń. Jednak, aby określić cechy morfologiczne aksonów i dendrytów w warstwach korowych u żywych myszy, konieczne jest rzadkie oznaczanie neuronów. System rekombinacji Cre w połączeniu z IUE może być używany do oznaczania rzadkiej populacji neuronów o wystarczająco niskiej gęstości, aby rozdzielić projekcje emitowane przez poszczególne komórki zidentyfikowanych blaszek korowych. Metoda ta oznacza wystarczającą liczbę neuronów na korę, aby uzyskać dane ilościowe po analizie rozsądnej liczby mózgów poddanych elektroporacji (ryc. 1). Niniejszy manuskrypt przedstawia metodę takiej dokładnej analizy łączności. Przedstawiono również podobną strategię analizy, w oddzielnych eksperymentach, właściwości elektrycznych neuronów poprzez wykonywanie zapisów cęgów prądowych na komórkach elektroporowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) z ostrych wycinków kory mózgowej. Protokoły te są wszechstronne i mogą być stosowane do badania pobudliwości i połączeń neuronów WT i zwierząt transgenicznych, a także neuronów, w których straty i zyski funkcji są wprowadzane przez dodatkowe plazmidy podczas IUE.

Chociaż ten protokół opisuje elektroporację myszy w dniu embrionalnym (E)15.5, ta technika może być wykonywana w każdym wieku między E9.53 a dniem po urodzeniu (P)24. Podczas gdy elektroporacja we wczesnych stadiach jest ukierunkowana na neurony i prekursory wzgórza oraz głębokich warstw kory mózgowej, elektroporacja na późniejszym etapie oznacza bardziej powierzchowne warstwy (np. E15.5 IUE celuje w neurony warstwy II-III). Podsumowując, połączenie IUE z analizą morfologiczną pojedynczych komórek i elektrofizjologią jest użytecznym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ogromnej różnorodności strukturalnej i funkcjonalnej neuronów w układzie nerwowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Wspólnoty Madrytu, zgodnie z krajowym i europejskim prawodawstwem (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Zachowaj sterylne warunki podczas zabiegu.

1. Elektroporacja in utero

UWAGA: Ten protokół dla IUE jest zaadaptowany z innych, które zostały wcześniej opublikowane5,6,7. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół IUE zarodków E15.5, z modyfikacjami strategii reporterowej, które pozwalają na badanie morfologii pojedynczych neuronów8 i ich właściwości elektrofizjologicznych w oddzielnym eksperymencie z wykorzystaniem standardowych plazmidów reporterowych GFP.

  1. Przygotowanie DNA
    1. Przygotuj plazmidy DNA za pomocą zestawu do izolacji bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta i rozcieńcz je w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      1. Do znakowania pojedynczych komórek należy przygotować 10 μl mieszaniny DNA na operację (1 μl na zarodek) przy użyciu następujących konstruktów i stężeń końcowych: plazmid kodujący reporter białka fluorescencyjnego (np. CAG-DsRed29), 1 μg/μL jako kontrola wydajności elektroporacji; plazmid doświadczalny, który ma być badany, zwykle przy 1 μg/μL; LoxP-stop-LoxP-fluorescencyjny plazmid białkowy (CALNL-GFP10), 1 μg/μL; i kodowanie konstrukcyjne Cre10, 1 - 4 ng/μL. Dodaj 1 μL 0,1% Fast Green do wody (waga/objętość), aby uwidocznić wstrzyknięte DNA.
        UWAGA: Rekombinacja Cre konstruktu GFP zachodzi tylko w kilku neuronach, co pozwala na wizualizację i rekonstrukcję poszczególnych projekcji aksonalnych (ryc. 1A).
      2. W przypadku standardowych badań patch-clamp należy przygotować 10 μl mieszaniny DNA na operację (1 μl na zarodek) następującego plazmidu kodującego białko fluorescencyjne (np. CAG-GFP11), 1 μg/μL jako kontrolę reporterową; plazmid eksperymentalny, zwykle 1 μg/μL; i 1 μL 0,1% Fast Green w wodzie (waga/objętość).
        UWAGA: Są to standardowe warunki elektroporacji, które analizują ostre plastry zawierające dużą liczbę znakowanych neuronów pobudzających w pożądanej blaszce. Aby przeprowadzić badania patch-clamp w pojedynczych komórkach, należy przygotować DNA zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.1.

2. Przygotowanie do operacji

  1. Wykonaj operację przetrwania, stosując procedury aseptyczne. Zapewnij sterylne warunki, w tym maski, rękawice, instrumenty i pole operacyjne. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (skalpel, kleszcze Adson, utwardzone drobne nożyczki, zakrzywione nożyczki, kleszcze Dumonta i uchwyt na igły).
  2. Wybierz kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej/wewnętrznej 1/0,58 mm. Pull kapilary 3. Tarcza zapewnia optymalną długość końcówki 1 cm po pociągnięciu. Przeciąć końcówkę igły pod kątem około 30° za pomocą drobnych kleszczyków (Rysunek 1B).
  3. Przygotuj 500 ml sterylnego roztworu izotonicznego (1x PBS lub Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (HBSS)). Dodać penicylinę-streptomycynę w stosunku 1:100 i ogrzać roztwór do temperatury 37 °C. Po zabiegu może być przechowywany w temperaturze 4 °C.
  4. Podskórnie wstrzyknąć przedoperacyjną dawkę leków przeciwbólowych (np. karprofen, 5 mg/kg masy ciała).
  5. Utrzymuj zwierzęta w cieple przed operacją, umieszczając je na poduszce grzewczej. Ogrzej czystą klatkę do temperatury 37 °C w celu rekonwalescencji pooperacyjnej.

3. Chirurgia

  1. Znieczulij ciężarną mysz C57BL/6 E15.5 izofluranem. Najpierw napełnij zamkniętą komorę 3% izofluranem o stężeniu 0,8 l/min tlenu i pozostaw mysz w środku, dopóki nie zaśnie. Przenieś mysz na poduszkę grzewczą i umieść nos i usta w masce w celu podania izofluranu. Stopniowo zmniejszaj znieczulenie w trakcie zabiegu do 1,5% izofluranu za pomocą maski. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, obserwując utratę odruchu pedałowania (szczypanie palców). Optymalna procedura trwa około 20 minut i nie więcej niż 45 minut.
  2. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.
  3. Usuń włosy z ~ 3-centymetrowego obszaru brzucha (za pomocą elektrycznej maszynki do golenia lub kremu do depilacji). Umyj obszar operacyjny bawełnianymi wacikami nasączonymi 70% etanolem, a następnie wacikiem z jodem. Powtórz trzy razy.
  4. Przykryj obszar operacyjny sterylną gazą, aby zapobiec infekcjom.
  5. Za pomocą skalpela wykonaj pionowy otwór przez skórę o długości 2 cm i równoległy do linii środkowej. Oddziel skórę i mięśnie brzucha za pomocą, zakrzywionych nożyczek. Przytrzymaj mięsień kleszczami i przetnij go przez linea alba, aby odsłonić jamę brzuszną.
  6. Zlokalizuj zarodki za pomocą kleszczy. Zwilż dwa mokre bawełniane waciki sterylnym roztworem soli fizjologicznej przygotowanym w kroku 2.3 i użyj ich do manipulowania dostępnym zarodkiem przez otwór. Umieść bawełniane waciki wokół zarodka i delikatnie wyjmij oba rogi macicy z jamy brzusznej. Utrzymuj zarodki i otwartą jamę brzuszną nawodnione ciepłym roztworem soli fizjologicznej przez cały czas trwania zabiegu, aby zapobiec ich wysuszeniu.

4. Wstrzykiwanie DNA i elektroporacja

  1. Delikatnie manipuluj zarodkami palcami, aby zlokalizować kresomózgowie (może być wyraźnie uwidocznione przez oko jako dwa bardziej przednie pęcherzyki mózgu). Umieść przygotowaną kapilę borokrzemianową w pipecie do ust. Przełóż końcówkę igły przez macicę, omijając naczynia krwionośne, aż dotrze do jednej bocznej komory. Powoli wstrzyknąć około 1 μl roztworu DNA o szybkim zielonym zabarwieniu, aż do zaobserwowania dużej niebieskiej plamki.
  2. Umieść 7-milimetrowe platynowe elektrody bocznie na głowie zarodka (ryc. 1C).
    UWAGA: DNA jest naładowane ujemnie; Dlatego porusza się w kierunku elektrody dodatniej, gdy napięcie jest przyłożone między elektrodami platynowymi. Zmieniając położenie elektrod, można celować w różne obszary mózgu.
  3. Przyłóż napięcie za pomocą elektrod platynowych (dla zarodków E15,5: 5 impulsów, 38 V, długość cyklu w odstępie 50 ms, przerwa w odstępie 950 ms. Warunki te różnią się w zależności od etapu rozwoju)12.
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z warunkami napięcia i elektrodami dla różnych stadiów zarodka.
  4. Powtórz kroki 4.1 - 4.3 dla każdego zarodka.

5. Zakończenie operacji i po operacji

  1. Użyj bawełnianych wacików, aby manipulować macicą z powrotem do matki. Napełnij jamę brzuszną podgrzanym roztworem soli fizjologicznej (dodaj około 2 ml).
  2. Zszyj mięsień prostymi przerwanymi szwami lub ciągłym szwem. Użyj szwów #6-0.
  3. Użyj zszywek, aby zamknąć zewnętrzną ranę. Uważaj, aby oddzielić skórę od mięśnia przed zszywaniem. Zdejmij maskę na nos.
  4. Pozwól myszy dojść do siebie przez 30 minut w ogrzewanej, czystej klatce przed umieszczeniem jej w pomieszczeniu dla zwierząt. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy umieszczać zwierzęcia, które przeszło operację, w towarzystwie innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  5. Nadzoruj zwierzę przez kilka dni po zabiegu. Leki przeciwbólowe należy stosować podskórnie (karprofen, 5 mg/kg masy ciała) co 12 godzin przez 2 dni lub zgodnie z przepisami dotyczącymi zwierząt. Szczenięta nie są objęte dodatkową opieką pooperacyjną.

6. Przygotowanie i analiza próbek

  1. Opcjonalnie: Na P2 sprawdź ekspresję fluorescencji u elektroporowanych szczeniąt za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego; gdy IUE zakończy się sukcesem, fluorescencję można wyraźnie zobaczyć w head13. Zaznacz lub oddziel myszy, które są dodatnio elektroporowane, do użycia w poniższych krokach. Trzymaj matkę i młode w standardowych warunkach w pomieszczeniu dla zwierząt.
  2. Na pożądanym etapie badania wykonaj perfuzję myszy przezsercowo. Zazwyczaj najbardziej aktywna faza wzrostu dendrytycznego i aksonalnego przypada na pierwsze trzy tygodnie po urodzeniu2,14,15.
    1. Przygotuj 30 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS na mysz i schłodź na lodzie.
      UWAGA: PFA jest znanym alergenem i czynnikiem rakotwórczym. Jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
      UWAGA: Potrzebna ilość PFA zależy od wieku myszy (np. dla P16 potrzebne jest 20 ml do perfuzji i 10 ml do postfiksacji).
    2. Przygotuj mieszankę ketaminy i ksylazyny, aby znieczulić zwierzę o stosunku objętościowym 1:1:8 wynoszącym 100 μg/ml ketaminy: 100 μg/ml ksylazyny: PBS (przygotuj około 0,2 ml na mysz).
    3. Znieczulić mysz poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,2 ml mieszanki przygotowanej w kroku 6.2.2.
    4. Umieść znieczuloną mysz na plecach. Wykonaj poziome nacięcie nad klatką piersiową za pomocą skalpela. Przetnij mięsień i przeponę cienkimi nożyczkami, aż będzie można zaobserwować serce.
      1. Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku cienkimi nożyczkami. Powoli wstrzyknąć 20 ml PBS do lewej komory za pomocą igły o rozmiarze 25 w celu usunięcia krwi. Wstrzyknąć 20 ml PFA (krok 6.2.1), aż mysz stanie się sztywna, a narządy staną się białe.
      2. Natychmiast zdejmij głowę i wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od szyi do czaszki. Delikatnie oderwij czaszkę za pomocą zakrzywionych kleszczy i wyjmij mózg. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przebić ani nie uszkodzić mózgu podczas usuwania czaszki. Umieść mózg w 10 ml 4% PFA w temperaturze 4 °C na noc, aby go utrwalić.
  3. Cryoprotect utrwalił mózgi w 10 ml 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez 1 - 2 dni, aż zatoną. Przygotuj 1 cm3 kostki folii aluminiowej. Napełnij kostki w 2/3 wysokości OCT. Włóż mózgi do środka i zamroź je, kładąc kostki na suchym lodzie. Zamrożone mózgi przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Umieść kroplę OCT na powierzchni krążka próbki, oderwij folię aluminiową od kostki histologicznej i umieść kostkę w żądanej orientacji do krążka próbki na wierzchu ciekłego OCT. Zastosuj mocny nacisk, aż zostanie zamocowana. Włóż krążek z próbką do głowicy próbki kriostatu. Ustaw próbkę w odpowiedniej pozycji (przesuń ją do korzystnej pozycji względem noża/ostrza).
    1. Podziel mózgi na kriostat. Za pomocą cienkiego pędzla wybierz pływające kriosekcje o grubości 50 - 100 μm16 i umieść je w PBS.
  5. Bejca w razie potrzeby.
    UWAGA: Do badania morfologii aksonów zdecydowanie zaleca się barwienie przeciwciałem GFP2.
    1. Blokować skrawki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej 5% płodową surowicą bydlęcą w PBS zawierającym 0,5% Triton-X 100 (roztwór blokujący). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem w stosunku 1:500 (np. króliczym anty-GFP) rozcieńczonym w roztworze blokującym.
    2. Umyj sekcje trzy razy w PBS. Dodać 1:500 przeciwciała drugorzędowego (np. koziego przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 488) rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj sekcje trzy razy w PBS.
    3. Barwienie przeciwstawne za pomocą DAPI (1:10 000) w PBS zawierającym 0,5% Triton-X 100 przez 10 min. Przepłukać skrawki PBS. Zamontuj sekcje w wodnym medium montażowym16.

7. Obrazowanie i analiza

  1. Mikroskopia fluorescencyjna lub konfokalna
    1. Aby zrekonstruować całe neurony, uzyskaj obrazy o dużym powiększeniu (co najmniej 40X) i wysokiej rozdzielczości (minimum 1,024 x 1,024). Wybierz opcję "Skanowanie kafelków" lub równoważną opcję w oprogramowaniu do akwizycji, aby pokryć obszar zainteresowania, obejmujący wszystkie dendryty i procesy aksonalne. Uzyskaj wystarczającą liczbę stosów na osi z, aby uniknąć utraty informacji.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, oprogramowanie mikroskopu ma opcję "Zoptymalizowany stos", ale jeśli tak nie jest, przetestuj ręcznie, aby określić, ile kroków jest potrzebnych, aby obrazy nakładały się na siebie, aby poprawnie zdefiniować poszczególne projekcje. Dwa kluczowe parametry to otwór i obiektyw; Weź pod uwagę "większe powiększenie, większą rozdzielczość i więcej niezbędnych kroków Z".
  2. Analiza
    UWAGA: Chociaż można przeanalizować kilka parametrów, krok 7.2.1 skupia się na dwóch: morfologii dendrytów i rozgałęzianiu aksonów. Pobierz Fidżi (http://fiji.sc/).
    1. Otwórz obraz, wybierz z menu opcję "Linia segmentowa". Narysuj linię (poruszając się w górę i w dół wzdłuż osi z poprzez przewijanie myszy) podążającą za strukturą neuronu. Przejdź do "Analizuj, Narzędzia, Menedżer ROI, Dodaj" (alternatywnie naciśnij "t"), aby zapisać linię. Powtórz ten proces dla każdego aksonu lub dendrytu analizowanego neuronu2.
    2. W menu Menedżera ROI naciśnij przycisk "Zmierz", aby uzyskać długość (lub dodatkowe parametry). Wyeksportuj pomiary do pliku tekstowego lub arkusza kalkulacyjnego, aby je przeanalizować.

8. Elektrofizjologia

UWAGA: Celem tego protokołu jest uzyskanie zapisów cęgów prądowych całych komórek z neuronów komórek piramidowych warstwy II/III, zidentyfikowanych wizualnie przez ekspresję GFP w mózgach myszy poddanych elektroporacji GFP (lub jakiegokolwiek innego białka fluorescencyjnego wcześniej elektroporowanego). Jest to adaptacja wcześniej opublikowanych metod17,18. Za pomocą tego protokołu możliwe jest zbadanie wpływu modyfikacji genetycznej wprowadzonej przez IUE na właściwości elektryczne neuronu. Akwizycja określonych trybów wypalania jest stopniowym procesem różnicowania, który obejmuje dynamiczną ekspresję szerokiego repertuaru kanałów jonowych i który skutkuje ekspresją przejściowych trybów wypalania przed późnymi stadiami postnatalnymi. Na przykład dojrzałe reakcje elektryczne nie są obserwowane w warstwie II/III somatosensorycznej kory myszy przed P162,19.

  1. Wymagania wstępne dotyczące wycinków ostrych
    1. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne do usunięcia mózgów myszy: gilotynę, aby usunąć głowę; małe nożyczki, aby przeciąć czaszkę; kleszcze, aby oddzielić czaszkę od tkanki; szpatułkę, aby delikatnie usunąć tkankę mózgową z jej obudowy; metalową krajalnicę, aby rozciąć korę mózgową na dwie równe połowy; i pipetę Pasteura. w celu przesunięcia wycinków z wibratomu (umieścić je w roztworze zawierającym sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) do kontroli, a następnie przenieść wycinki z ACSF do miejsca inkubacji).
    2. Przygotuj 1 l ACSF przy użyciu wody o wysokiej czystości (woda podwójnie destylowana) zawierającej 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM glukozy, 2,5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 i 1 mM NaH2PO4. Miareczkować pH do 7,3 - 7,4 za pomocą HCl lub NaOH. Dostosuj osmolarność do 290 mOsm.
    3. Pęcherzyk ACSF z karbogenem (95% O2/5% CO2 ) przez 15 - 20 min za pomocą rurek teflonowych (~ 1 mm), w celu ustabilizowania pH do 7,3 - 7,4.
    4. Zamrozić 200 ml roztworu ACSF nasyconego karbogenem w temperaturze -80 °C przez 10 - 15 minut, aby uzyskać roztwór do rozwarstwiania w postaci błota pośniegowego. Umieść naczynie do hodowli tkankowej o wymiarach 100 x 20 mm na lodzie, aby pokroić mózg.
    5. Przygotuj 100 ml 1% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Ostudzić roztwór, wyciąć kwadratowy kawałek agarozy (wymiary: 1 x 1 x 0,5 mm) i przykleić go do tylnej części platformy, tuż za miejscem, w którym mózg jest krojony (żel agarozowy zapewnia podparcie dla mózgu podczas krojenia). Przód powinien być jak najbardziej płaski.
  2. Uzyskiwanie ostrych plastrów
    1. Unieruchomij mysz i znieczul ją izofluranem 2%. Umieść głowę w otworze gilotyny i szybko ją odetnij. Usuń jego czaszkę tak szybko, jak to możliwe, za pomocą strażników kości lub cienkich kleszczy. Umieść mózg w schłodzonym ACSF.
      UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok szybko.
    2. Umieść mózg w schłodzonym naczyniu hodowlanym. Odetnij móżdżek małymi nożyczkami.
    3. Podnieś mózg szpatułką i osusz go na ręczniku papierowym.
    4. Przyklej brzuszno-ogonową płaszczyznę mózgu do uchwytu wibratomu. Umieść uchwyt na wibratomie wypełnionym lodowatym ACSF.
    5. Uzyskać ostre plastry, przecinając skrawki koronalne o średnicy 300 μm (zapewnić ciągłą karbonizację przez cały czas trwania zabiegu, np. umieścić bełkotkę (rurkę z politetrafluoroetylenu o średnicy 1 mm) w komorze wibratomu) przy następujących ustawieniach wibratomu: amplituda 0,06 mm i prędkość 0,08 - 0,10 mm/s. Ustaw wyprzedzenie na najniższą możliwą prędkość (~ 22 s na przejazd). Zmodyfikuj te optymalne ustawienia i w razie potrzeby uzyskaj optymalne warunki dla każdej maszyny empirycznie.
    6. Inkubować ostre plastry przez co najmniej 60 minut w ACSF uzupełnionym 3 mM mio-inozytolem, 0,4 mM kwasem askorbinowym i 2 mM pirogronianem sodu, bulgocząc 95% gazem O2/5% CO2 . Utrzymać temperaturę na poziomie 25 °C.
    7. Wykonaj procedurę krojenia w mniej niż 15 minut. W razie potrzeby plastry można przechowywać przez 1 - 7 godzin przed przeniesieniem do komory zapisu w celu użycia.
  3. Wymagania wstępne dotyczące nagrywania całej komórki
    1. Upewnij się, że stacja elektrofizjologii jest wyposażona w komorę rejestracyjną, system perfuzyjny, mikroskop, elektrody (rejestrującą, stymulującą i uziemiającą), makro- i mikromanipulatory, sztywny, odporny na wibracje blat stołu i klatkę Faradaya, stymulator, wzmacniacz i przetwornik analogowo-cyfrowy (A/D), komputer z oprogramowaniem do akwizycji oraz filtr GFP (lub dowolny inny fluorochrom) do analizy genetycznie zmodyfikowanych neuronów18 (Rysunek 2A).
    2. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający 115 mM glukonianu potasu, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na2ATP i 0,3 mM Na3GTP, dostosowany do pH 7,2 przez KOH i do 290 mOsm przez KCl.
    3. Wykonaj pipety z łatkami, ciągnąc kapilary ze szkła borokrzemianowego. Przygotować elektrody do plastrów za pomocą ściągacza do mikropipet. Używaj kapilar borokrzemianowych (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm, długość 10 cm). Wykonaj elektrody łatowe wykazujące rezystancję 3-10 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.
    4. Przeprowadzić fuzję komory rejestracyjnej za pomocą ACSF z szybkością 2 ml/min. Utrzymać temperaturę komory na poziomie około 33 °C.
  4. Nagrywanie całej komórki
    1. Przenieś plastry do komory zapisu za pomocą pipety Pasteura (odetnij długą końcówkę) lub małego pędzelka. Przytrzymaj plasterek za pomocą harfy. Perfuzuj plastry w sposób ciągły za pomocą ACSF z szybkością 2 ml/min.
    2. Załataj neuron GFP-dodatni.
      1. Umieść plasterek w komorze nagrywającej i znajdź obszar zainteresowania przez mikroskop przy małym powiększeniu (10X). Następnie znajdź komórkę GFP-dodatnią do załatania za pomocą obiektywu 60x.
      2. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym. Użyj strzykawki połączonej z filtrem (filtr 4 mm) i końcówką mikroładowarki, aby napełnić elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym.
      3. Umieść szklaną pipetę w uchwycie na pipety. Umieść końcówkę pipety w kąpieli i skup się na końcówce. Gdy pipeta znajdzie się w kąpieli, należy zastosować nadciśnienie przez system kontroli ciśnienia wstecznego.
      4. Łataj neuron, który jest fluorescencyjny (ryc. 2B).
        1. Zbliżyć się do celi zainteresowania pod kierunkiem wizualnym, utrzymując ciśnienie wsteczne w pipecie. Po pojawieniu się małego wgłębienia na powierzchni komórki zwolnij ciśnienie. W tym momencie może powstać szczelne uszczelnienie (rezystancja większa niż 1 GΩ). W przeciwnym razie zastosuj lekkie podciśnienie (ssanie), aby to ułatwić.
        2. Podczas formowania uszczelki doprowadzić napięcie trzymania clamp do -60 mV. Po uformowaniu uszczelki GΩ zastosuj impuls ssania, aby rozerwać błonę komórkową pod pipetą i przejść w tryb całej komórki. Zobacz reference20, aby uzyskać więcej informacji.
      5. Rejestruj aktywność przy użyciu warunków cęgów prądowych21. W trybie całych ogniw przełącz się z trybu cęgów napięciowych na cęgi prądowe i rozpocznij nagrywanie. Na przykład, aby zarejestrować pobudliwość komórek, zastosuj wstrzyknięcia prądu depolaryzującego o długości 500 ms (100 - 400 pA).
        1. Oblicz szybkość wypalania, wykreślając liczbę potencjałów czynnościowych wzdłuż pociągu dla rosnących prądów wejściowych.
          UWAGA: Spoczynkowy potencjał membrany, rezystancja wejściowa i pojemność membrany mogą być również obliczane na podstawie recordings21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby szczegółowo scharakteryzować zmiany morfologiczne neuronów w trakcie rozwoju, niezbędne jest rzadkie znakowanie neuronów. System z rozcieńczoną rekombinazą Cre umożliwia ekspresję interesującego genu w rzadkiej populacji neuronów, tak że tylko te neurony, które włączą ten enzym, wykazują ekspresję GFP (Rysunek 1A). Stosując tę strategię, warstwa II-III jest ukierunkowana i znakowana za pomocą IUE w dniu E15.5. CAG-DsRed2 w stężeniu 1 µg/µL jest ko-elektroporowany jako...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten szczegółowo opisuje, jak oznaczać neurony kory somatosensorycznej myszy C75BL / 6 w celu analizy ich połączeń i pobudliwości. W odniesieniu do istniejących metod, wizualizuje rozróżniające aspekty łączności, takie jak liczba gałęzi aksonalnych na neuron, ich dokładna topografia i lokalizacja anatomiczna. Zmieniając położenie elektrod, możliwe jest celowanie w inne populacje neuronów, takie jak kora obręczy (zachowaj ten sam kąt między elektrodami a mózgiem, ale zmień orientację biegunów) lub hipokamp

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni R. Gutiérrezowi i A. Moralesowi za doskonałą pomoc techniczną oraz L. A. Weissowi za redakcję. C.G.B. jest finansowany przez hiszpańskie Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Praca ta została sfinansowana z grantu Fundacji BBVA i SAF2014-58598-JIN (MINECO) dla M. Navarrete oraz z grantu Fundacji Ramón Areces i grantów SAF2014-52119-R i BFU2014-55738-REDT (z MINECO) dla M. Nieto.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pCAG-CreAddgene13775
pCALNL-GFPAddgene13770
pCAG-DsRed2Addgene15777
pCAG-GFPAddgene11150
Fast GreenCarl Roth301.1
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
Karprofen (Rimadyl)Pfizer GmbH1615 ESP
Izofluran (IsoFlo)Abbott (Esteve)1385 ESP
Ketamina (Imalgen)Merial2528-ESP
Ksylazyna (Xilagesic)Calier0682-ESP
Powidon JodMeda694109.6
Maść do oczu (Lipolac)Angelini65.277
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Gibco firmy Life Technologies24020-091
Penicylina-StreptomycynaSigma -AldrichP4333
Rękojeść skalpela # 3 - 12 cmFine Science Tools10003-12
Ostrza skalpela # 10Fine Science Tools10010-00
Kleszcze Adson ząbkowane - proste 12 cmFine Science Tools1106-12
Hartowane drobne nożyczki - proste 11 cmFine Science Tools14090-11
Nożyczki Mezenbaum-Nelson zakrzywione L=14,5 cmTeleflexPO143281
Cienkie zakrzywione końcówki - Styl 7 DumoxelDumont0303-7-PO
Dumont #5 Kleszcze-InoxFine Science Tools11251-20
Uchwyt na igłę Mathieu - ząbkowanydrobno Narzędzia naukowe12010-14
Aplikacja AutoClipBraintree scientific, IncACS  APL
9 mm AutoClipsMikRon Precision, Inc.
Szwy - Maszynka do golenia Polysorb 6-0CovidienUL-101
 Kapilary zePanasonic ER 240
(100 mm, 1,0/0,58 średnica zewnętrzna/wewnętrzna)World Precision Instrument Inc.1B100F-4
Zespoły probówek aspiracyjnych do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigma -AldrichA5177-5EA
Gaza (Aposan)Laboratorios Indas, S.A.U.CN 482232.8
Waciki bawełniane (Star Cott)Albasa-igła
25 g (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
SacharozaSigma -AldrichS0389
ParaformaldehydSigma -Aldrich158127
Związek OCTSakura4583
Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mmFalcon353003
GFP Tag Przeciwciało poliklonalneThermo Fisher ScientificA-11122
Przeciwciało wtórne, koniugat Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
DAPISigma-AldrichD9542 
Surowica bydlęca płoduThermo Fisher Scientific10270106 
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Elektroporator ECM 830 Aparat BTX Harvard45-0002
Elektrody platynowe 650P 7 mmNepageneCUY650P7
Mikroskop  do obrazowania fluorescencyjnego - MZ10FParownikLeica-VIP
3000
Mikroskop
200Zeiss-Cryostat
- CM 1950
Micropette PullerSutter Instrument CompanyP-97
Oprogramowanie do analizy zacisków krosowych (p-Clamp Clampfit 10.3)urządzeń
(wzmacniacz MultiClamp 700B)Urządzenia molekularneDD1440A
zmotoryzowany mikromanipulator + obrotowa podstawa Sutter InstrumentMP-225
Stół powietrznyNewport-Miniaturowe
pompy perystaltyczneWPI-
205016 szkła borokrzemianowego izofluorowy System skanowania laserowego Matrx-TCS-SP5 Leica-Axiovert Leica-P-97 Oprogramowanie do akwizycji molekularnych

Bibliografia

  1. Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
  2. Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
  3. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  4. Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
  5. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
  6. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
  7. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
  8. Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
  9. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
  10. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
  11. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  12. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  13. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
  14. Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
  15. Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
  16. Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
  17. Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
  18. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
  19. Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
  20. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  21. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  22. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Łączność strukturalnaanaliza pobudliwościneurony korowerejestracja whole-cellpreparat ostrych skrawkówobrazowanie konfokalnemorfologia dendrytówprojekcje aksonalne
In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.