Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Układ nerwowy składa się z ogromnej liczby różnych typów neuronów. Te subpopulacje neuronalne charakteryzują się, między innymi, odrębną morfologią dendrytyczną, specyficznymi wzorcami połączeń aksonalnych i selektywnymi reakcjami na odpalanie. Mechanizmy molekularne i komórkowe odpowiedzialne za te aspekty różnicowania podczas rozwoju są nadal słabo poznane.
Tutaj opisujemy połączone protokoły do oznaczania i charakteryzowania strukturalnej łączności i pobudliwości neuronów korowych. Modyfikacja protokołu elektroporacji in utero (IUE) umożliwia znakowanie rzadkiej populacji neuronów. To z kolei umożliwia identyfikację i śledzenie dendrytów i aksonów poszczególnych neuronów, precyzyjną charakterystykę laminarnego położenia projekcji aksonalnych oraz analizę morfometryczną. IUE może być również używany do badania zmian w pobudliwości neuronów typu dzikiego (WT) lub genetycznie modyfikowanych poprzez połączenie go z zapisem całych komórek z ostrych wycinków mózgów poddanych elektropostacji. Te dwie techniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia sprzężenia połączeń strukturalnych i funkcjonalnych oraz mechanizmów molekularnych kontrolujących różnorodność neuronów podczas rozwoju. Te procesy rozwojowe mają ważne implikacje dla okablowania aksonów, funkcjonalnej różnorodności neuronów i biologii zaburzeń poznawczych.
Wprowadzenie
Rozwój struktur dendrytycznych i aksonalnych jest ważnym aspektem regulacji obwodów w układzie nerwowym, w tym w korze mózgowej. Odgrywa kluczową rolę podczas selektywnego okablowania różnych subpopulacji neuronów. Szereg ostatnich doniesień wykazało, że oprócz łączności, różnorodność molekularna neuronów znajduje odzwierciedlenie w nabywaniu wysoce specyficznych sposobów odpalania. Jednak mechanizmy decydujące o pobudliwości i łączności różnych podtypów neuronów podczas rozwoju, a także o stopniu ich koordynacji, są nadal słabo poznane1,2.
Analizy in vivo utraty i wzmocnie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Wspólnoty Madrytu, zgodnie z krajowym i europejskim prawodawstwem (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Zachowaj sterylne warunki podczas zabiegu.
1. Elektroporacja in utero
UWAGA: Ten protokół dla IUE jest zaadaptowany z innych, które zostały wcześniej opublikowane5,6,7. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół IUE zarodków E15.5, z modyfikacjami strategii reporterowej, które pozwalają na badanie morfologii ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby szczegółowo scharakteryzować zmiany morfologiczne neuronów na różnych etapach rozwoju, niezbędne jest rzadkie znakowanie neuronów. System z rozcieńczoną rekombinazą Cre pozwala na ekspresję interesującego genu w rzadkiej populacji neuronów, tak że tylko te neurony, które włączą ten enzym, wykażą ekspresję GFP (Ryc. 1A). Stosując tę strategię, warstwy II-III są celowane i znakowane za pomocą IUE w dniu E15,5. CAG-DsRed2 w stężeniu 1 µg/µL jest współelektroporowany jako.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten szczegółowo opisuje, jak oznaczać neurony kory somatosensorycznej myszy C75BL / 6 w celu analizy ich połączeń i pobudliwości. W odniesieniu do istniejących metod, wizualizuje rozróżniające aspekty łączności, takie jak liczba gałęzi aksonalnych na neuron, ich dokładna topografia i lokalizacja anatomiczna. Zmieniając położenie elektrod, możliwe jest celowanie w inne populacje neuronów, takie jak kora obręczy (zachowaj ten sam kąt między elektrodami a mózgiem, ale zmień orientację biegunów) lub hipokamp
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni R. Gutiérrezowi i A. Moralesowi za doskonałą pomoc techniczną oraz L. A. Weissowi za redakcję. C.G.B. jest finansowany przez hiszpańskie Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Praca ta została sfinansowana z grantu Fundacji BBVA i SAF2014-58598-JIN (MINECO) dla M. Navarrete oraz z grantu Fundacji Ramón Areces i grantów SAF2014-52119-R i BFU2014-55738-REDT (z MINECO) dla M. Nieto.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Karprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Izofluran (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamina (Imalgen) | Merial | 2528-ESP | |
| Ksylazyna (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Powidon Jod | Meda | 694109.6 | |
| Maść do oczu (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) | Gibco firmy Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Rękojeść skalpela # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Ostrza skalpela # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Kleszcze Adson ząbkowane - proste 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hartowane drobne nożyczki - proste 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Nożyczki Mezenbaum-Nelson zakrzywione L=14,5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Cienkie zakrzywione końcówki - Styl 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Kleszcze-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Uchwyt na igłę Mathieu - ząbkowany | drobno Narzędzia naukowe | 12010-14 | |
| Aplikacja AutoClip | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | ||
| Szwy - Maszynka do golenia Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Kapilary ze | Panasonic ER 240 | ||
| (100 mm, 1,0/0,58 średnica zewnętrzna/wewnętrzna) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Zespoły probówek aspiracyjnych do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gaza (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | CN 482232.8 | |
| Waciki bawełniane (Star Cott) | Albasa-igła | ||
| 25 g (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sacharoza | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyd | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| Związek OCT | Sakura | 4583 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Przeciwciało poliklonalne | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Przeciwciało wtórne, koniugat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Surowica bydlęca płodu | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Elektroporator ECM 830 | Aparat BTX Harvard | 45-0002 | |
| Elektrody platynowe 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Mikroskop do obrazowania fluorescencyjnego - MZ10F | Parownik | Leica-VIP | |
| 3000 | |||
| Mikroskop | |||
| 200 | Zeiss-Cryostat | ||
| - CM 1950 | |||
| Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Oprogramowanie do analizy zacisków krosowych (p-Clamp Clampfit 10.3) | urządzeń | ||
| (wzmacniacz MultiClamp 700B) | Urządzenia molekularne | DD1440A | |
| zmotoryzowany mikromanipulator + obrotowa podstawa | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Stół powietrzny | Newport-Miniaturowe | ||
| pompy perystaltyczne | WPI- |
Bibliografia
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
