Method Article

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/55148

⸱

March 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka monotopowe pełnią swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony, a takie interakcje zależą od specyficznego składu lipidów i dostępności wystarczającej powierzchni do pełnienia funkcji. Nanodyski służą do zapewnienia powierzchni membrany o kontrolowanej wielkości i zawartości lipidów. W przypadku braku związanych białek zewnętrznych, nanodyski barwione fosfowolfanem sodu wyglądają jak stosy monet, gdy patrzy się na nie z boku za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Protokół ten został zatem zaprojektowany tak, aby celowo promować układanie w stosy; W związku z tym zapobieganie układaniu się w stosy może być interpretowane jako wiązanie białka wiążącego błonę z nanodyskiem. W kolejnym kroku obrazy TEM kompleksów białko-nanodysk mogą być przetwarzane za pomocą standardowych metod jednocząsteczkowych w celu uzyskania struktur o niskiej rozdzielczości jako podstawy do prac krioEM o wyższej rozdzielczości. Ponadto nanodyski dostarczają próbki nadające się do elektroforezy TEM lub żelu niedenaturującego. Aby zilustrować metodę, przedstawiono indukowane przez Ca2+ wiązanie 5-lipooksygenazy na nanodyskach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniach medycznych wiele uwagi skupia się na białkach błonowych, zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych, zaangażowanych w różne interakcje lipidowe. Praca z białkami oddziałującymi z lipidami obejmuje albo wybór substytutu lipidów, takiego jak detergenty, amfipole1, lub małe białka2, albo znalezienie substytutu błony, który utrzymuje białko rozpuszczalne i aktywne. Substytuty błon liponowych obejmują liposomy i nanodyski (ND)3,4.

Nanodyski to niemal natywne platformy błonowe, które powstały dzięki inżynierii części białkowej, ApoA-1, lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) naturalnie występującej we krwi. ApoA-1 jest długim na 243 reszty łańcuchem krótkich amfipatycznych α-helis i ma konformację rozpuszczalną bez lipidów. W in vitro, w obecności lipidów, dwie kopie białka ApoA-1 spontanicznie przegrupowują się, aby otoczyć hydrofobową część łańcucha acylowego dwuwarstwowej łaty lipidowej5. Zmodyfikowane wersje ApoA-1 są ogólnie nazywane białkami rusztowania błonowego (MSP), a coraz więcej z nich jest dostępnych na rynku w postaci plazmidów lub oczyszczonych białek. Powtórzenia lub delecje α-helis w ApoA-1 skutkują dłuższymi6 lub krótszymi7 białkami rusztowania błonowego. To z kolei umożliwia formowanie krążków o średnicy około 6 nm7 do 17 nm8. Istnieją różne typy zastosowań nanodysków3,9. Najczęściej stosowanym zastosowaniem jest zapewnienie niemal natywnego środowiska błonowego do stabilizacji integralnego białka błonowego8, sprawdzone wcześniej3,9. Mniej zbadanym zastosowaniem jest zapewnienie powierzchni błony w nanoskali do badania białek błony obwodowej10,11,12,13,14,15,16,17. Sekcja 1 poniższego protokołu wizualizuje procedurę wytwarzania nanodysków złożonych z fosfolipidów i białka rusztowania błonowego.

Przygotowanie próbki jest wąskim gardłem w większości metod. Próbki specyficzne dla danej metody mogą dodawać określone informacje, ale także utrudniają porównywanie wyników. Dlatego jest to prostsze, gdy próbki są multimodalne i mogą być wykorzystywane bezpośrednio w kilku różnych metodach. Jedną z zalet stosowania nanodysków jest niewielki rozmiar nanodysku w porównaniu z liposomami (np. próbki mogą być bezpośrednio wykorzystywane zarówno do elektroforezy TEM, jak i elektroforezy żelowej bez denaturacji, jak w niniejszym protokole).

Pęcherzyki i liposomy od dawna są używane do zrozumienia funkcji białek oddziałujących z błoną. Do badań strukturalnych i wizualizacji dostępny jest przykład strukturalnego oznaczania białka transbłonowego w liposomach18. Jednak, o ile nam wiadomo, nie opublikowano jeszcze struktury 3D monotopowego białka błonowego osadzonego na błonie liposomowej. Nanocząstki złota lub przeciwciała mogą być używane do wizualizacji białek wiążących się z liposomami lub pęcherzykami za pomocą TEM19. Mimo że sondy te są bardzo specyficzne, mogą zakłócać białka wiążące błonę, zasłaniając miejsce wiązania błony lub maskując obszary zainteresowania elastycznymi częściami. Białka znakowane złotem lub skompleksowane przeciwciałami mogłyby być prawdopodobnie analizowane na żelu, ale zwiększyłoby to koszt eksperymentu.

Chociaż liposomy są doskonałą platformą, nie można być pewnym, że populacja ma określony stosunek białka na liposom, cechę, którą można zbadać za pomocą nanodysków20. W liposomie kofaktory i substraty mogą zostać uwięzione w rozpuszczalnym wnętrzu. Substancje, które są rozpuszczalne w błonie, będą dzielić ten sam los dla obu rodzajów mimetyków błonowych. Niemniej jednak, ponieważ obszar dwuwarstwy jest mniejszy w nanodyskach, do nasycenia membran nanodysków potrzebna jest mniejsza ilość substancji.

Zrozumienie funkcji białka poprzez określenie struktury atomowej było niezbędne dla wielu dziedzin badań. Metody oznaczania struktury białek obejmują X-ray21; magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)22,23; i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)24 w temperaturach kriogenicznych, cryoEM. Rozdzielczość cryoEM została ostatnio znacznie poprawiona, głównie dzięki zastosowaniu bezpośrednich detektorów elektronów25,26. Makrocząsteczki są obrazowane w cienkim, szklistym lodzie27 w stanie zbliżonym do natywnego. Jednak ze względu na niski kontrast cząsteczek biologicznych stają się one trudne do wykrycia w zakresie wielkości 100 - 200 kDa. W przypadku próbek o odpowiedniej wielkości można zebrać dane i zastosować metodę rekonstrukcji pojedynczej cząstki w celu uzyskania struktury28.

Jednakże, określanie struktury białka za pomocą TEM jest procesem wieloetapowym. Zwykle rozpoczyna się od oceny monodyspersyjności próbki za pomocą barwienia ujemnego TEM29 przy użyciu soli metali ciężkich, takich jak fosfotungsten (PT)30 lub uranium31. Zazwyczaj wykonuje się rekonstrukcję modelu makrocząsteczki o niskiej rozdzielczości, który może dostarczyć ważnych informacji na temat struktury molekularnej29. Równolegle może rozpocząć się zbieranie danych za pomocą cryoEM. Należy zachować ostrożność podczas oceny danych TEM o ujemnym zabarwieniu, aby uniknąć błędnej interpretacji powstawania artefaktów. Jednym ze szczególnych artefaktów jest wpływ barwienia PT na fosfolipidy i liposomy32, co skutkuje powstawaniem długich prętów przypominających stosy monet oglądane z boku33. Takie "rouleau" lub "stosy" (dalej oznaczane jako "stosy") były obserwowane wcześnie dla HDL34, a później także dla nanodiscs35.

Układanie i przekształcanie membran może nastąpić z wielu powodów. Na przykład może być indukowany przez kofaktory, takie jak miedź, co wykazano za pomocą obrazowania TEM w barwieniu molibdenianem amonu36. Frakcja lipidów błonowych w liposomach zawierała grupę głowicową kwasu iminodiacetowego naśladującą kompleksowanie metali przez EDTA, układając w ten sposób liposomy po dodaniu jonów miedzi36. Układanie w stosy może być również spowodowane interakcją białko-białko przez białko w lub na dwuwarstwach lipidowych (użyta plama nie jest wymieniona)37. Tworzenie się stosu fosfolipidów przez PT zaobserwowano wcześnie; Jednak późniejsze prace skupiły się na usunięciu lub zniesieniu tej formacji artefaktu38.

Tutaj proponujemy metodę wykorzystania indukowanego przez NaPT układania nanodysków do badania białek wiążących błony za pomocą TEM. Krótko mówiąc, wiązanie białek na nanodyskach zapobiegłoby układaniu się nanodysków. Chociaż powody układania w stosy nie są jasne, zaproponowano39, że istnieje oddziaływanie elektrostatyczne między fosfolipidami a grupą fosforylową PT, powodujące sklejanie się krążków ze sobą (Rysunek 1A). Hipoteza stojąca za naszym protokołem jest taka, że gdy białko wiąże się z nanodyskiem, większość powierzchni fosfolipidów nie jest dostępna do interakcji z PT z powodu sterycznej przeszkody ze strony białka. Zapobiegłoby to tworzeniu się komina (rysunek 1B). Można wyciągnąć dwa wnioski. Po pierwsze, zapobieganie układaniu się w stosy oznacza, że białko będące przedmiotem zainteresowania związało się z błoną. Po drugie, kompleks białkowy-ND można traktować standardowymi metodami przetwarzania pojedynczych cząstek24,40, aby uzyskać przybliżoną morfologię kompleksu. Ponadto można przeprowadzać analizy za pomocą takich metod, jak elektroforeza żelowa bez denaturacji lub dynamiczne rozpraszanie światła.

Aby zademonstrować tę hipotezę, użyliśmy białka 5-lipooksygenazy (5LO) wiążącego błonę, które jest zaangażowane w wiele chorób zapalnych41,42. To białko o masie 78 kDa wymaga jonów wapnia, aby związać się ze swoją błoną43. Chociaż to asocjacja błony była szeroko badana przy użyciu liposomów44,45,46 i frakcje membranowe47, nie można ich używać do analizy TEM i określania struktury.

Przygotowanie nanodysków rozpoczyna się od zmieszania MSP z lipidem zawieszonym w protektorze cholan sodu. Po inkubacji na lodzie przez 1 godzinę, detergent jest powoli usuwany z mieszaniny do rozpuszczenia za pomocą żywicy adsorpcyjnej. Ten rodzaj materiału jest często wykonany z polistyrenu w kształcie małych koralików. Są one stosunkowo hydrofobowe i mają silną preferencję do wiązania detergentów w porównaniu do lipids48. Po usunięciu kulek hydrofobowych i przeprowadzeniu klarowania za pomocą wirowania, nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). Oczyszczone nanodyski miesza się z monotopowym białkiem błonowym (i ewentualnymi kofaktorami) w stosunku równomolowym (lub kilku proporcjach do miareczkowania) i pozostawia się do reakcji (15 min). Analizę za pomocą TEM przeprowadza się poprzez naniesienie μl próbki na rozżarzone, pokryte węglem siatki, a następnie poprzez barwienie ujemne za pomocą NaPT. Ta sama próbka, od której podwielokrotności zostały nałożone na siatki TEM, może być wykorzystana do analizy za pomocą elektroforezy żelowej bez denaturacji lub SDS PAGE, a także do różnego rodzaju pomiarów aktywności, bez większych zmian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie Nanodysków

  1. Ekspresja i oczyszczanie białka rusztowania błonowego8,35
    1. Wyrazić MSP1E3D1 znakowaną His w szczepie E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 w kolbach. Przygotuj 50 ml nocnej kultury starterowej z pożywką LB uzupełnioną 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć nocną kulturę starterową w 2 litrach wspaniałej pożywki bulionowej uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny.
    2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie około 3. Indukować ekspresję białka za pomocą 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 3 godziny w temperaturze 18 °C.
    3. Przygotować bufor do lizy (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; i 10% glicerolu). Dodaj 1 mM TCEP bezpośrednio przed użyciem.
    4. Po 3 godzinach indukcji w temperaturze 18 °C, zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, zważyć pobrane komórki i ponownie zawiesić je w buforze do lizy w proporcji 2 ml buforu do lizy na g komórek.
    5. Lizuj komórki za pomocą pulsacyjnej sonikacji (częstotliwość powtarzania: 4 s WŁ., 4 s WYŁ.) przez 3 minuty przy amplitudzie 80%.
    6. Odwirować lizaty przez 20 minut w temperaturze 49 000 x g i temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad z tego wirowania.
    7. Wstrzyknąć supernatant do 5 ml kolumny chelatującej Ni+ połączonej z automatycznym systemem chromatografii cieczowej, najlepiej utrzymywanym w temperaturze 4 °C.
    8. Przed etapem elucji (etap 1.1.9) przemyć kolumnę 1 - 3 poniżej, aby usunąć wszystkie białka z wyjątkiem MSP znakowanego His. Monitorować zawartość białka przy długości fali 280 nm, aby śledzić proces oczyszczania; zapis UV przy 280 nm powinien wracać do wartości wyjściowej po każdym praniu.
      1. Przemyć buforem płuczącym 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 1% Tritonem, pH 8,0.
      2. Przemyć buforem do przemywania 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu i 50 mM cholanu sodu, pH 8,0.
      3. Przemyć buforem do przemywania 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl i 50 mM imidazolu, pH 8,0.
    9. Eluować MSP za pomocą 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl i 500 mM imidazolu, pH 8,0.
    10. Zmień bufor na standardowy bufor MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; i 0,5 mM EDTA) przez filtrację żelową8,35; wydajność na partię powinna wynosić około 7 mg L-1.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego fosfolipidów
    1. Dodać 305 μl 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC) rozpuszczonej w chloroformie o stężeniu 25 mg/ml do szklanej zlewki i odparować chloroform, przepłukując go delikatnym strumieniem azotu. Wysuszyć lipid przez noc w eksykatorze próżniowym. UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia rozpuszczalnika z lipidu, który pozostawia cienką warstwę lipidu na dnie szklanej zlewki.
    2. Zawiesić placek lipidowy w 200 μl standardowego buforu MSP zawierającego 100 mM cholanu sodu, wirując probówkę, aż roztwór stanie się przezroczysty; zapewni to roztwór o stężeniu POPC 50 mM.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, stosunek molowy lipidów do detergentu w tym momencie powinien wynosić 1:2 (lipid:detergent)8. Ta mieszanka lipidów i detergentów może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez prawie 2 miesiące.
  3. Przygotowanie kulek hydrofobowych do usuwania detergentu
    1. Umieść 5 g kulek (w suchej masie) w probówce o pojemności 50 ml.
    2. Umyj kulki 30 ml 100% metanolu, a następnie 40 ml ultraczystej wody.
    3. Umyj kulki 10 ml standardowego buforu MSP. Na koniec przechowywać kulki w 15 ml buforu wzorcowego MSP w temperaturze 4 °C.
  4. Rekonstytucja Nanodisc
    1. Dozować 190 μl MSP1E3D1 (0,124 mM) do probówki do mikrofuge i dodać 61,5 μl podstawowego roztworu fosfolipidów (50 mM POPC) do tej samej probówki. Mieszaninę do rozpuszczenia należy inkubować na mokrym lodzie przez 1 godzinę. UWAGA: Odpowiada to stosunkowi molowemu 1:130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Dodać kulki hydrofobowe w stężeniu 0,5 g kulek na ml mieszaniny do rozpuszczenia, aby rozpocząć proces samoorganizacji. Inkubować w inkubatorze obrotowym przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    3. Po inkubacji odwirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadów i agregatów. Wyrzucić osad i zachować supernatant.
    4. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość (zamontowaną na zautomatyzowanym systemie chromatografii cieczowej) z buforem wzorcowym MSP, aż absorbancja przy 280 nm będzie stabilna. Wstrzyknąć supernatant do kolumny i zebrać frakcje szczytowe.
    5. Zmierzyć stężenia nanodysków we frakcjach pikowych przy 280 nm. Do obliczenia stężenia nanodysku należy użyć współczynnika ekstynkcji molowej wynoszącego MSP1E3D1 (ε = 29,910 cm-1 M-1). UWAGA: Liczba lipidów na nanodysk może być mierzona przez kombinację lipidów znakowanych radioaktywnie i analizy fosforanów4 lub przez samą analizę fosforanów.

2. Przygotowanie 5-lipooksygenazy białkowej monotopowej35

  1. Przygotuj kulturę starterową na noc. Uzupełnij 50 ml pożywki LB 100 μg/ml ampicyliny. Zaszczepić pożywkę bakterią E. coli BL21 (DE3) zawierającą plazmid genu 5-lipooksygenazy (ALOX5). Rozcieńczyć całonocną kulturę starterową w pożywce ekspresyjnej zawierającej 42 mM Na2HPO4, 24 mM KH2PO4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glukozy, 0,1%, 5 μMFeSO4 i 100 μg/ml ampicyliny. Hoduj komórki, aż OD600 wyniesie ~ 0,5 w 25 °C. Indukuj ekspresję białka za pomocą 0,2 mM IPTG przez 16 godzin w 20 °C35.
  2. Zbierać przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 7 000 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zważyć osad znajdujący się na dnie probówki zawierającej pobrane komórki i ponownie zawiesić zebrane komórki w buforze do lizy (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% glicerolu; i 1 mM TCEP) zawierającym inhibitor proteazy i 0,5 mg/ml35 lizozymu w proporcji 2 ml buforu do lizy na g komórek.
  3. Lizować komórki przez sonikację przez 5 x 15 s przy 80% amplitudzie. Usunąć resztki komórek przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 7 000 x g i 4 °C. Przeprowadzić wytrącanie siarczanu amonu do 30 - 60% nasycenia, aby wytrącić białka w roztworze35. Wirować przez 15 minut w temperaturze 16 000 x g i 4 °C. UWAGA: Granulat 5LO można szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  4. Zawiesić osad z 20 ml buforu do lizy i odwirować na 15 minut w temperaturze 40 000 x g i 4 °C.
  5. Inkubować supernatant na kolumnie z agarozą ATP w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć kolumnę raz jedną objętością kolumny buforu do lizy zawierającego 0,5 M NaCl. Eluować 5LO za pomocą 20 mM ATP w buforze do lizy zawierającym 10 μM FeSO4 i 20 μg/ml katalazy. Przeprowadzić chromatografię z filtracją żelową, aby usunąć ATP35.
    UWAGA: 5LO jest niestabilny i powinien być używany natychmiast po oczyszczeniu. W przeciwnym razie zaleca się zatrzymanie na etapie wytrącania siarczanu amonu (patrz uwaga po etapie 2.1.3).

3. Przygotowanie kompleksu białkowego Nanodisc

  1. Przygotować całkowitą objętość 100 μl kompleksu. Zmieszać 0,8 μM ND i 0,8 μM 5LO z 1 mM Ca2+ obecnym w buforze wzorcowym MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA; i 1,5 mM CaCl2) i inkubować przez 10 minut na lodzie. UWAGA: Próbka może być przechowywana przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C35.

4. Analiza próbek

  1. Elektroforeza żelowa
    1. Elektroforeza niedenaturująca
      1. Wymieszaj 15 μl próbki z 5 μl buforu ładującego (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glicerolu i 0,001% Pąsu S, pH 7,2)49 i załaduj go na 4 - 16% żelu Bis-Tris w celu przeprowadzenia elektroforezy.
      2. Napełnij zbiornik katodowy lekkim buforem katodowym (50 mM Bis Tris; 50 mM Tricine, pH 6,8; i 0,002% Coomassie G-250) oraz zbiornik anodowy z buforem roboczym (50 mM Bis Tris i 50 mM Tricine, pH 6,8). Rozpocznij separację, używając stałego napięcia przy napięciu 150 V.
      3. Zatrzymaj separację elektroforetyczną, gdy przód Coomassie dotrze do końca żelu.
      4. Zabarwić żel standardowym niebieskim protokołem Coomassie.
    2. Elektroforeza denaturacji
      1. Zmieszać 40 μl próbki z 10 μl buforu ładującego zawierającego SDS (0,05% (m/v) błękitu bromofenolowego; 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8; 20% (v/v) glicerolu; 10% (w/v) SDS; i 10 mM 2-merkaptoetanolu) i załadować ją do 4 - 20% żelu glicynowego Tris w celu przeprowadzenia elektroforezy.
      2. Napełnij zbiorniki katody i anody buforem roboczym (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glicyny; i 0,1% (w/v) SDS). Rozpocznij separację, używając stałego napięcia przy napięciu 150 V.
      3. Zatrzymaj separację elektroforetyczną, gdy przód barwnika załadowczego dotrze do końca żelu.
      4. Zabarwić żel standardowym niebieskim protokołem Coomassie.
  2. Przygotowanie roztworu NaPT
    1. Rozpuścić 1 g fosfounganowianu soli sodowej w 50 ml wody przez mieszanie w temperaturze pokojowej, aby uzyskać 2% (m/v) kwaśny roztwór.
    2. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Usuń cząstki za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotowanie próbki do analizy TEM
    1. Siatki miedziane powlekane węglem jarzeniowym (400 mesh) przez 20 s przy 30 mA w celu nadania siatkom hydrofilowości przed adsorpcją próbki. Umieścić 3,5 μl próbki (0,8 μM w odniesieniu do nanodysków) na siatce i inkubować przez 30 s. UWAGA: Zastosowana objętość może wahać się od 2,5 do 5 μl, w zależności od stężenia próbki. Odpowiedni zakres stężeń dla nanodysków wynosi 0,5 - 1 μM.
    2. Zetrzyj nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej.
    3. Natychmiast zabarwić siatkę kroplą 2% NaPT przez 30 s. Zetrzyj nadmiar roztworu i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu.
    4. Oceń siatki za pomocą TEM. Mikroskop z napięciem przyspieszającym 120-200 keV wystarcza do oszacowania zakresu układania w stosy. UWAGA: W niniejszym protokole użyto skalibrowanego transmisyjnego mikroskopu elektronowego, wyposażonego w pistolet do emisji pola o natężeniu 200 keV.
    5. Zapisz obrazy TEM. W przypadku obrazów przedstawiających długie stosy nie należy ich dalej przetwarzać; Obrazy pokazują kompleks nanodysków z zewnętrznym białkiem, które może zawierać kilka krótkich stosów, ale większość cząstek znajduje się w kompleksie. Nagraj kilka obrazów i przetwórz je zgodnie ze standardowymi metodami, aby uzyskać średnie klas i trójwymiarowy model kompleksu o niskiej rozdzielczości.
      UWAGA: W celu zebrania danych o barwieniu ujemnym siatki zostały wykonane w co najmniej trzech różnych dniach. Dla każdego dnia przeprowadzano inkubację nowych próbek (jak w kroku 3.1) przed nałożeniem barwienia ujemnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda, którą proponujemy, zależy od przygotowania nanodysków, które zapewniają powierzchnię błony do monotopowego wiązania błona-białko. Ponieważ w dwuwarstwie lipidowej nanodysku nie ma białka transbłonowego, nanodyski są tutaj oznaczone jako "puste nanodyski" (ryc. 2A). Mają one obliczoną masę cząsteczkową 256 kDa dla kompozycji dwóch MSP1E3D1 białek rusztowania i około 260 cząsteczek POPC8. Wykorzystując ten stosunek białka do lipidów do rekons...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodę można podzielić na trzy części: rekonstytucję pustych nanodysków, przygotowanie kompleksów białko-nanodysk oraz barwienie ujemne dla TEM tych kompleksów. Każda część zostanie omówiona osobno pod kątem ograniczeń techniki, krytycznych kroków i przydatnych modyfikacji.

Rekonstytucja pustych nanodysków. Krytyczne etapy i ograniczenia w produkcji i użytkowaniu nanodysków.

Do przygotowania pustych nanodysków niezbędna jest optymalizacja stosunku MSP do lipidów. Dla n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Szwedzkiej Radzie ds. Badań Naukowych, Radzie Hrabstwa Sztokholm i funduszom KI za wsparcie. Ekspresję i oczyszczanie MSP przeprowadzono w Karolinska Institutet/SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). Autorzy pragną również podziękować dr Pasi Purhonen i dr Mathildzie Sjöberg za podzielenie się swoją wiedzą techniczną i za szybką pomoc.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Transmisyjny mikroskop elektronowy: JEOL2100FJEOL
Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Niemcy
Wyładowanie jarzenioweBaltec
Siatka TEM: 400 meshTAABGM016/C
Chromatografia wykluczająca rozmiar: Agilent SEC-5Agilent Technologies5190-2526
Superdex 200 HR 10/300GE Healthcare Nauki Przyrodnicze17-5172-01
Plazmid: MSP1E3D1Addgene20066
Bakterie: BL21DE3NEBC2527H
Bakterie: BL21 (DE3) T1R pRARE2Protein Science Facility, KI, Solna
Matryca oczyszczania: ATP agarozaSigma AldrichA2767
Matryca oczyszczająca: HisTrap HP-5 mLGE Healthcare Life Sciences17-5247-01
Lipidy: POPCAvanti polarne lipidy850457C25 mg/ml w chloroformie
Kulki hydrofobowe: Bio-Beads, SM-2 ResinBio-Rad1523920
13 mm filtr strzykawkowy: 0,2 μ mPall life sciencesPN 4554T
Barwienie: Trójzasadowy hydrat fosforunglandianu soduSigma Aldrich31648
2-merkaptoetanolSigma AldrichM3148-250ML
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Bio-Rad161-0301
Koktajl inhibitorów proteazySigma Aldrich4693132001
TCEPSigma Aldrich646547
Detergent: Hydrat cholanu soduSigma AldrichC6445-10G
Cholan500 mM Cholan sodu. Zawiesić w wodzie miliQ i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Lipid Stock50 mM POPC, 100 mM cholan sodu, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. Przechowywać w temperaturze 4 & C przez tydzień; lub
Sklep -80 ° C przez miesiąc, po przeczyszczeniu roztworu azotem.
Standardowy bufor20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA.
Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
Bufor anodowy do elektroforezy niedenaturującejThermo Fisher ScientificBN200150 mM Bis-tris, 50 mM Tricine, pH 6,8
Bufor katodowy do elektroforezy niedenaturującejThermo Fisher ScientificBN200250 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250
Elektroforeza niedenaturująca 4x Bufor do ładowania próbkiThermo Fisher ScientificBN200350 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glicerol, 0,001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer Recepturawłasna: 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM glicyna, 0,1% (w/v) SDS
Denaturaing Elektroforeza 5x Ładowanie próbki Bufor Recepturawłasna: 0,05% (w/v) Bromophenolblue, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) glicerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-merkaptoetanol
Wspaniały bulionTrypton - 12,0 g, Ekstrakt drożdżowy - 24,0 g, 100 ml 0,17 M KH2PO4 i 0,72 M K2HPO4, Glicerol - 4 mL.
Trypton, ekstrakt drożdżowy i glicerol przygotowano do 900 ml i oddzielnie sterylizowano w autoklawie. KH2PO4 i K2HPO4 przygotowano i autoklawowano oddzielnie. Oba zostały zmieszane przed użyciem pożywki.
Kamera CCD sodu MSP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116(2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087(2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187(2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910(2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyNanodisc PreparationMembrane Protein BindingNegative Stain TEMSize Exclusion ChromatographyNon denaturing Gel ElectrophoresisPhosphotungstate StainingMonotopic Protein AnalysisNanodisc StackingProtein Nanodisc Complex

Related Articles