Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka monotopowe pełnią swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony, a takie interakcje zależą od specyficznego składu lipidów i dostępności wystarczającej powierzchni do pełnienia funkcji. Nanodyski służą do zapewnienia powierzchni membrany o kontrolowanej wielkości i zawartości lipidów. W przypadku braku związanych białek zewnętrznych, nanodyski barwione fosfowolfanem sodu wyglądają jak stosy monet, gdy patrzy się na nie z boku za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Protokół ten został zatem zaprojektowany tak, aby celowo promować układanie w stosy; W związku z tym zapobieganie układaniu się w stosy może być interpretowane jako wiązanie białka wiążącego błonę z nanodyskiem. W kolejnym kroku obrazy TEM kompleksów białko-nanodysk mogą być przetwarzane za pomocą standardowych metod jednocząsteczkowych w celu uzyskania struktur o niskiej rozdzielczości jako podstawy do prac krioEM o wyższej rozdzielczości. Ponadto nanodyski dostarczają próbki nadające się do elektroforezy TEM lub żelu niedenaturującego. Aby zilustrować metodę, przedstawiono indukowane przez Ca2+ wiązanie 5-lipooksygenazy na nanodyskach.
Wprowadzenie
W badaniach medycznych wiele uwagi skupia się na białkach błonowych, zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych, zaangażowanych w różne interakcje lipidowe. Praca z białkami oddziałującymi z lipidami obejmuje albo wybór substytutu lipidów, takiego jak detergenty, amfipole1, lub małe białka2, albo znalezienie substytutu błony, który utrzymuje białko rozpuszczalne i aktywne. Substytuty błon liponowych obejmują liposomy i nanodyski (ND)3,4.
Nanodyski to niemal natywne platformy błonowe, które powstały dzięki inżynierii części białkowej, Apo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie Nanodysków
- Ekspresja i oczyszczanie białka rusztowania błonowego8,35
- Wyrazić MSP1E3D1 znakowaną His w szczepie E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 w kolbach. Przygotuj 50 ml nocnej kultury starterowej z pożywką LB uzupełnioną 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć nocną kulturę starterową w 2 litrach wspaniałej pożywki bulionowej uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny.
- Hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie około 3. Indukować ekspresję białka za pomocą 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopir....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Proponowana przez nas metoda opiera się na przygotowaniu nanodysków, które zapewniają powierzchnię błony dla wiązania monotopowych białek błonowych. Ponieważ w dwuwarstwie lipidowej nanodysku nie osadzono żadnego białka transbłonowego, nanodyski te określono tutaj jako „puste nanodyski” (Rysunek 2A). Ich obliczona masa cząsteczkowa wynosi 256 kDa dla składu obejmującego dwa białka rusztowujące MSP1E3D1 oraz około 260 cząsteczek POPC8. Stosując ten .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metodę można podzielić na trzy części: rekonstytucję pustych nanodysków, przygotowanie kompleksów białko-nanodysk oraz barwienie ujemne dla TEM tych kompleksów. Każda część zostanie omówiona osobno pod kątem ograniczeń techniki, krytycznych kroków i przydatnych modyfikacji.
Rekonstytucja pustych nanodysków. Krytyczne etapy i ograniczenia w produkcji i użytkowaniu nanodysków.
Do przygotowania pustych nanodysków niezbędna jest optymalizacja stosunku MSP do lipidów. Dla n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Szwedzkiej Radzie ds. Badań Naukowych, Radzie Hrabstwa Sztokholm i funduszom KI za wsparcie. Ekspresję i oczyszczanie MSP przeprowadzono w Karolinska Institutet/SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). Autorzy pragną również podziękować dr Pasi Purhonen i dr Mathildzie Sjöberg za podzielenie się swoją wiedzą techniczną i za szybką pomoc.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Transmisyjny mikroskop elektronowy: JEOL2100F | JEOL | ||
| Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Niemcy | |||
| Wyładowanie jarzeniowe | Baltec | ||
| Siatka TEM: 400 mesh | TAAB | GM016/C | |
| Chromatografia wykluczająca rozmiar: Agilent SEC-5 | Agilent Technologies | 5190-2526 | |
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare Nauki Przyrodnicze | 17-5172-01 | |
| Plazmid: MSP1E3D1 | Addgene | 20066 | |
| Bakterie: BL21DE3 | NEB | C2527H | |
| Bakterie: BL21 (DE3) T1R pRARE2 | Protein Science Facility, KI, Solna | ||
| Matryca oczyszczania: ATP agaroza | Sigma Aldrich | A2767 | |
| Matryca oczyszczająca: HisTrap HP-5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5247-01 | |
| Lipidy: POPC | Avanti polarne lipidy | 850457C | 25 mg/ml w chloroformie |
| Kulki hydrofobowe: Bio-Beads, SM-2 Resin | Bio-Rad | 1523920 | |
| 13 mm filtr strzykawkowy: 0,2 μ m | Pall life sciences | PN 4554T | |
| Barwienie: Trójzasadowy hydrat fosforunglandianu sodu | Sigma Aldrich | 31648 | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma Aldrich | M3148-250ML | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Sigma Aldrich | 4693132001 | |
| TCEP | Sigma Aldrich | 646547 | |
| Detergent: Hydrat cholanu sodu | Sigma Aldrich | C6445-10G | |
| Cholan | 500 mM Cholan sodu. Zawiesić w wodzie miliQ i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. | ||
| Lipid Stock | 50 mM POPC, 100 mM cholan sodu, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. Przechowywać w temperaturze 4 & C przez tydzień; lub Sklep -80 ° C przez miesiąc, po przeczyszczeniu roztworu azotem. | ||
| Standardowy bufor | 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 stopni C. | ||
| Bufor anodowy do elektroforezy niedenaturującej | Thermo Fisher Scientific | BN2001 | 50 mM Bis-tris, 50 mM Tricine, pH 6,8 |
| Bufor katodowy do elektroforezy niedenaturującej | Thermo Fisher Scientific | BN2002 | 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250 |
| Elektroforeza niedenaturująca 4x Bufor do ładowania próbki | Thermo Fisher Scientific | BN2003 | 50 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glicerol, 0,001% Ponceau S |
| Denaturaing Electrophoresis Running Buffer Receptura | własna: 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM glicyna, 0,1% (w/v) SDS | ||
| Denaturaing Elektroforeza 5x Ładowanie próbki Bufor Receptura | własna: 0,05% (w/v) Bromophenolblue, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) glicerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-merkaptoetanol | ||
| Wspaniały bulion | Trypton - 12,0 g, Ekstrakt drożdżowy - 24,0 g, 100 ml 0,17 M KH2PO4 i 0,72 M K2HPO4, Glicerol - 4 mL. Trypton, ekstrakt drożdżowy i glicerol przygotowano do 900 ml i oddzielnie sterylizowano w autoklawie. KH2PO4 i K2HPO4 przygotowano i autoklawowano oddzielnie. Oba zostały zmieszane przed użyciem pożywki. |
Bibliografia
- Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
- Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
