Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza 1,2-azaborin i otrzymywanie ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55154

⸱

25 marca 2017

 , 
1Department of Chemistry, Boston College

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół

Przedstawiono protokół syntezy 1,2-azaboryny i otrzymywania ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4.

Streszczenie

Opisujemy ogólną syntezę 1,2-azaboryny przy użyciu standardowych technik bezpowietrznych i preparatu kompleksu białkowego z mutantami lizozymu T4 metodą dyfuzji pary. Związki wrażliwe na tlen i wilgoć są przygotowywane i izolowane w atmosferze obojętnej (N2) za pomocą próżniowego kolektora gazowego lub komory rękawicowej. Jako przykład syntezy azaboryny demonstrujemy syntezę i oczyszczanie lotnej N-H-B-etylo-1,2-azaboryny za pomocą pięcioetapowej sekwencji obejmującej destylację i chromatografię kolumnową w celu izolacji produktów. Mutanty lizozymu T4 L99A i L99A/M102Q ulegają ekspresji szczepu Escherichia coli RR1. Standardowe protokoły chemicznej lizy komórek, po której następuje oczyszczanie za pomocą kolumny jonowymiennej karboksymetylu, zapewniają białko o wystarczająco wysokiej czystości do krystalizacji. Krystalizację białek przeprowadza się w różnych stężeniach środka strącającego w różnych zakresach pH metodą dyfuzji par w postaci wiszących kropli. Złożone przygotowanie z małymi cząsteczkami odbywa się metodą dyfuzji parowej w atmosferze obojętnej. Analiza dyfrakcji rentgenowskiej kompleksu krystalicznego dostarcza jednoznacznych dowodów strukturalnych na oddziaływania wiążące między miejscem wiązania białka a 1,2-azaborynami.

Wprowadzenie

Heterocykle zawierające azot borowy (np. 1,2-azaboryny) przyciągnęły ostatnio znaczną uwagę jako izosterydy aren. Ten izosteryzm może prowadzić do dywersyfikacji istniejących motywów strukturalnych w celu rozszerzenia przestrzeni chemicznej2,3,4. Azaboryny mają potencjalną użyteczność do zastosowania w badaniach biomedycznych5,6,7,8, zwłaszcza w dziedzinie chemii medycznej, w której chemicy przeprowadzają syntezę bibliotek strukturalnie i funkcjonalnie istotnych cząsteczek. Istotne jest jednak to, że chociaż istnieje wiele dobrze rozwiniętych metod syntezy do dostępnych cząsteczek zawierających arenę, opisano tylko ograniczoną liczbę metod syntezy azaboryn9,10,11,12,13. Wynika to głównie z ograniczonej liczby opcji źródła boru oraz wrażliwego na powietrze i wilgoć charakteru cząsteczki we wczesnym etapie sekwencji syntetycznej.

W pierwszej części tego artykułu opiszemy syntezę N-TBS-B-Cl-1,2-azaboryny na skalę wielogramową (3) przy użyciu standardowych technik bezpowietrznych. Związek ten służy jako wszechstronny półprodukt, który może być dalej funkcjonalizowany do strukturalnie bardziej złożonych cząsteczek14,15. Począwszy od punktu 3, opisana zostanie synteza i oczyszczanie N-H-B-etylo-1,2-azaboryny (5) do stosowania w badaniach wiązania białek. Ze względu na lotność 5, jego skuteczna izolacja wymaga precyzyjnej kontroli temperatury, czasu i warunków destylacji reakcji.

W drugiej części zostaną przedstawione protokoły ekspresji białek i izolacji mutantów lizozymu T4 (L99A i L99A/M102Q)17,18,19,20, a następnie krystalizacja białka i przygotowanie kompleksów krystalicznych białko-ligand. Mutanty lizozymu T4 L99A i L99A/M102Q zostały wybrane jako systemy modeli biologicznych w celu zbadania zdolności wiązania wodorowego cząsteczek N-H zawierających azaborynę17. Korzystając ze standardowego protokołu biologii molekularnej, białko ulega ekspresji w szczepie Escherichia coli RR1 i jest indukowane izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Oczyszczanie białek odbywa się za pomocą jonowymiennej chromatografii kolumnowej. Krystalizację białek przeprowadza się za pomocą wysoko stężonego oczyszczonego roztworu białka (czystość >95% metodą elektroforezy żelowej) metodą dyfuzji par w postaci wiszącej kropli. Ze względu na wrażliwość ligandów w tym badaniu na tlen, kompleksy białko-ligand są przygotowywane w warunkach bezpowietrznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie manipulacje wrażliwe na tlen i wilgoć przeprowadzano w atmosferze obojętnej (N2), stosując standardowe techniki beztlenowe lub rękawicę laboratoryjną. THF (tetrahydrofuran), Et2O (eter dietylowy), CH2Cl2 (dichlorometan), toluen i pentan oczyszczano poprzez przepuszczenie przez kolumnę z neutralną tlenkiem glinu w atmosferze argonu. Acetonitryl osuszano nad CaH2 (wodorkiem wapnia) i destylowano w atmosferze azotu przed użyciem. Pd/C (pallad na węglu) ogrzewano w wysokiej próżni w temperaturze 100 °C przez 12 h przed użyciem. Żel krzemionkowy (230-400 mesh) suszono przez 12 h w temperaturze 180 °C w wysokiej próżni. Chromatografię błyszczową przeprowadzano z użyciem tego żelu krzemionkowego w atmosferze obojętnej. Wszystkie pozostałe odczynniki i rozpuszczalniki zakupiono i stosowano bez dalszej puryfikacji.

UWAGA: Zachowaj ostrożność, przed użyciem zapoznaj się ze wszystkimi istotnymi kartami charakterystyki bezpieczeństwa substancji (MSDS). Kilka z chemikaliów wykorzystanych w syntezie jest silnie toksycznych i rakotwórczych.

1. Przygotowanie 1,2-azaborinów

UWAGA: Dane z charakterystyki wszystkich związków w niniejszym badaniu zostały opisane we wcześniejszych publikacjach12, 13, 16.

Schemat ścieżki syntezy organicznej z użyciem NTBS, przedstawiający reakcje chemiczne i wydajności dla etapów 1-5.
Rycina 1: Schemat syntezy 1,2-azaborinów. Szczegółowe protokoły syntezy każdego związku (1-5) opisano w sekcji protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie N-allylowy-N-TBS-B-addukt chlorku allylu (1)
    1. W komorze z rękawicami (glove box) odważ 6,70 g (50,0 mmol) triallyloboranu22 do wysuszonej w piekarniku kolby okrągłodnej o pojemności 1 l ze szlifem 24/40, wyposażonej w mieszadło magnetyczne, i dodać 250 ml dichlorometanu. Kolbę zamknąć septem gumowym. Poza komorą chłodniczą schłodzić roztwór do -78 °C w atmosferze azotu na próżniowym manifoldzie gazowym.
    2. Do roztworu triallylboranu w temperaturze - dodaj 100 ml 1,00 M roztworu trójchlorku boru (100 mmol) w heksanie.78 °C przesiąść za pomocą kaniuli. Mieszaninę reakcyjną mieszać w tej temperaturze przez 4 h.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność, trójchlorek boru jest silnie reaktywny w kontakcie z wodą.
    3. W oddzielnej kolbie o pojemności 100 ml odważ 25,7 g N-(t-butyldimetylosylylo-N-allylamina (150 mmol) i dodać 20,0 ml dichlorometanu. Do kolby reakcyjnej o pojemności 1 l dodać ten roztwór za pomocą transferu kaniulą, utrzymując temperaturę reakcji na poziomie -78 °C.
    4. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 21,0 ml trietyloaminy (150 mmol). Kontynuować mieszanie w stałym przepływie azotu i pozostawić do stopniowego ogrzania się do temperatury pokojowej w ciągu nocy.
    5. Po 18 h mieszania odparować około połowy rozpuszczalnika za pomocą manifoldu próżniowego, stosując wysoką próżnię (300–500 mTorr) z pułapką z ciekłym azotem.
    6. Przenieść kolbę reakcyjną do komory rękawicowej i odfiltrować białą sól powstałą w mieszaninie reakcyjnej przez wysuszoną w suszarce zaprawkę o średniej porowatości, wyposażoną w adapter próżniowy 24/40 oraz kolbę okrągłodenna o pojemności 500 mL z szlifem 24/40 i mieszadłem magnetycznym. Do przeniesienia wszystkich pozostałych materiałów użyć dichlorometanu.
    7. Usuń wszystkie pozostałe substancje lotne z przesączu poza urządzeniem, używając linii próżniowej z wysoką próżnią.
    8. W komorze rękawicowej przenieś zagęszczoną mieszaninę reakcyjną wraz z mieszadełkiem magnetycznym do wysuszonej w piekarniku kolby okrągłodennej o pojemności 100 mL ze szlifem 14/20, aby przygotować ją do destylacji. Zamknij kolbę septem.
    9. W przepływie azotu szybko otwórz septum i dodaj 200 mg wodorku wapnia jako środek osuszający.
    10. Zmontować aparat do destylacji, mocując wysuszoną w piecu głowicę destylacyjną 14/20 z termometrem, podłączając z jednej strony kolbę odbiorczą 14/20 o pojemności 50 mL do przechowywania w warunkach beztlenowych, a z drugiej strony kolbę o pojemności 100 mL zawierającą produkt surowy. Głowicę destylacyjną należy schłodzić wodą. (Wszystkie szlifowane połączenia aparatu do destylacji należy nasmarować smarem).
      UWAGA: Produkt zaczyna się destylować, gdy temperatura par osiągnie 60 °C przy 300 mTorr.
    11. Kontynuuj zbieranie produktu, podnosząc temperaturę kąpieli olejowej, aż termometr w głowicy destylacyjnej wskaże 75 °C.
      UWAGA: Produkt jest przezroczystym, bezbarwnym płynem.
    12. Zatrzymaj destylację, usuwając źródło ciepła, a następnie schłodź aparat do temperatury pokojowej przed odstawieniem do przechowywania. Po ochłodzeniu ponownie nadmuchaj aparat azotem i szczelnie zamknij zawór grzybkowy w kolbie do przechowywania w warunkach beztlenowych. Wyizolowany produkt przechowuj w zamrażarce wewnątrz komory rękawicowej.
      UWAGA: Wydajność może wynosić od 65% do 84%.
  2. Przygotowanie N-TBS-B-produkt z zamkniętym pierścieniem Cl (2)
    1. W komorze rękawicowej odważ 56,0 g N-allylowy-N-TBS-B-addukt chlorku allylu (1) (217 mmol) do osuszonej w piecu kolby okrągłodennej o pojemności 1 L ze szlifem 24/40 zawierającej mieszadło magnetyczne i dodać 500 ml toluenu.
    2. Odmierz 1,79 g Grubbs 1st katalizator generujący (2,17 mmol).
    3. Do mieszaniny 1 w temperaturze pokojowej w gloveboxie dodawaj katalizator porcjami, stale mieszając roztwór. Podczas dodawania przeciągaj glovebox, aby usunąć powstający w wyniku reakcji etylen.
      UWAGA: Reakcja zazwyczaj kończy się w ciągu 30 min od ustania wydzielania gazu. Innym wskaźnikiem zakończenia procesu jest całkowita zmiana barwy reakcyjnej z początkowej purpurowej na brązową. W tym momencie produkt można wyizolować za pomocą destylacji próżniowej; szczegóły znajdują się w odniesieniu 12. W niniejszym protokole przedstawiono jednopodstawową, dwuetapową procedurę bezpośredniej syntezy 3 zostało opisane.
  3. Przygotowanie N-TBS-B-Cl-1,2-azaborin (3)
    1. Do roztworu reakcyjnego produktu zamknięcia pierścienia (2) w toluenie, dodać 14,0 g palladu na węglu (10% mas. Pd, 13,2 mmol).
    2. Wyjąć kolbę z pudełka i założyć do niej osuszony w piekarniku chłodnik zwrotny 24/40, który został przepłukany azotem i wyposażony w chłodzoną wodę.
    3. Podgrzewać mieszaninę reakcyjną w łaźni olejowej do intensywnego wrzenia w temperaturze 135 °C przy mieszaniu.
    4. Po utrzymywaniu w warunkach refluksu przez 16 h schłodzić mieszaninę reakcyjną, wyjmując kolbę z łaźni olejowej. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej pobrać za pomocą strzykawki z osuszaną w piecu igłą typu Luer-lock alikwot 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej. Przenieść alikwot 0,5 ml do probówki NMR z nakrętką w celu analizy za pomocą 11B NMR12.
      UWAGA: Pożądany piki produktu pojawia się przy ok. 35,5 ppm12, podczas gdy piki materiału wyjściowego pojawiają się przy Wapń42,9 ppm12Zazwyczaj w tym momencie 11Spektroskopia NMR wskazuje, że reakcja nie została zakończona, o czym świadczy pozostały niewielki pik materiału wyjściowego.
    5. Jeśli reakcja nie przebiegła całkowicie, należy przenieść kolbę reakcyjną do komory rękawicowej i dodać dodatkowe 3,00 g palladu na węglu (10% wag. Pd, 2,82 mmol).
    6. Ponownie poddać reakcję warunkom refluksu, zgodnie z opisem w punktach 1.3.2 i 1.3.3.
    7. Po dodatkowych 24 h w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przeanalizuj kolejną porcję mieszaniny reakcyjnej za pomocą 11B NMR. Na tym etapie reakcja powinna zostać zakończona.
    8. Przenieś kolbę reakcyjną do komory glove box i przepuść mieszaninę reakcyjną przez jednorazową kolumnę do chromatografii błyskawicznej wypełnioną ręcznikami papierowymi. Zbierz filtrat, przepłukując kolumnę 50,0 ml toluenu.
    9. Usuń wszystkie substancje lotne z filtratu poza urządzeniem, wykorzystując manifold gazowy z pompą próżniową wyposażony w wysoką próżnię.
      UWAGA: Usuwanie substancji lotnych może zająć od 40 do 90 minut, w zależności od ciśnienia próżni. Gdy manometr próżniowy wskaże ciśnienie maksymalne, oznacza to całkowite usunięcie rozpuszczalnika. Podczas usuwania rozpuszczalnika należy upewnić się, że kąpiel wodna znajdująca się pod kolbą pozostaje w temperaturze pokojowej w celu odprowadzania ciepła.
    10. W komorze z rękawicami (glove box) przenieś skoncentrowaną mieszaninę reakcyjną do osuszonej w piekarniku kolby okrągłodna o pojemności 250 ml ze szlifem 24/40, zawierającej mieszadło magnetyczne. Zamknij kolbę septem.
    11. Szybko usuń septum i dodaj 200 mg wodorku wapnia jako środka osuszającego.
    12. Zmontować aparat do destylacji, stosując osuszoną w piecu głowicę destylacyjną 24/40 z termometrem, podłączając z jednej strony kolbę odbiorczą 24/40 o pojemności 100 ml do przechowywania w warunkach beztlenowych, a z drugiej strony kolbę o pojemności 100 ml zawierającą produkt surowy. Głowicę destylacyjną wyposażyć w chłodzenie wodą. Wszystkie szlify aparatu do destylacji należy przesmarować smarem.
      UWAGA: Produkt zaczyna się destylować, gdy temperatura par osiągnie od 65 do 70 °C przy 1000 mTorr i temperaturze kąpieli olejowej w zakresie 90-100 °CProdukt jest klarownym, bezbarwnym płynem.
    13. Przerwać destylację poprzez usunięcie źródła ciepła i schłodzić aparat do temperatury pokojowej przed przechowywaniem. Po ochłodzeniu ponownie wprowadzić azot do aparatu, aby przywrócić ciśnienie, i szczelnie zamknąć zawór grzybkowy kolby do przechowywania w warunkach beztlenowych. Wyizolowany produkt przechowywać w zamrażarce wewnątrz komory rękawicowej w temperaturze -30 °C.
      UWAGA: Wydajność dla jednoputowej procedury dwuetapowej wynosi 52%.

Wyniki chromatografii, oczyszczanie białek, metoda HPLC, piki czasu retencji, związki znakowane.
Rycina 2: 11Widma B NMR do monitorowania tworzenia się N-TBS-B-Cl-1,2-azaborina (3). A) N-allylo-Naddukt TBS-B-chlorku allylu (1), materiał wyjściowy do metatezy zamykającej pierścień. B) Utlenianie po 16 h. (Nieprzereagowane N-TBS-B- Produkt z zamkniętym pierścieniem Cl (2) i izomeryzowany B-produkt z zamkniętym pierścieniem winylowym (2') wraz z N-TBS-B-Cl-1,2-azaborinem (3) są przedstawione.) C) Utlenianie po dodatkowych 24 h. D) Produkt wyizolowany (3) po oczyszczeniu za pomocą destylacji próżniowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie N-H-B-OBu-1,2-azaborin (4)
    1. W komorze rękawicowej odważ 4,00 g N-TBS-B-Cl-1,2-azaborina (3) (17,6 mmol) do osuszonej w piekarniku kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml z mieszadłem magnetycznym i dodać 35 ml acetonitrylu. Odmierzyć 1,14 g acetamidu (19,3 mmol) i przenieść do kolby reakcyjnej. Zamknąć kolbę gumowym septem.
    2. Wyjąć kolbę reakcyjną z pudełka i założyć do niej osuszoną w piecu chłodnicę zwrotną 24/40, która została przepłukana azotem i podłączona do obiegu zimnej wody.
    3. Ogrzać mieszaninę reakcyjną do temperatury wrzenia w układzie chłodnicy zwrotnej przy 85 °C w łaźni olejowej z mieszaniem.
    4. Po 3 h ogrzewania w temperaturze wrzenia (refluks), schłodzić mieszaninę reakcyjną, wyjmując kolbę z kąpieli olejowej. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej usunąć rozpuszczalnik za pomocą próżniowego manifoldu gazowego wyposażonego w pompę wysokiej próżni.
    5. Po usunięciu substancji lotnych w próżni, pozostałość po reakcji ponownie rozpuścić w 15,0 mL THF. Do otrzymanego roztworu dodać 3,21 mL n-butanol (35,1 mmol).
    6. Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    7. Usuń rozpuszczalnik na manifoldzie próżniowym wyposażonym w pompę wysokiej próżni, aby otrzymać produkt surowy.
    8. W komorze z rękawicami wyizoluj produkt za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, używając mieszaniny pentanu i eteru dietylowego (5:1) jako eluentu. Usuń lotne składniki z frakcji zawierających produkt, korzystając z linii próżniowej wyposażonej w pompę wysokopróżniową, aby otrzymać czysty produkt w postaci białego ciała stałego.
      UWAGA: Wydajność może wynosić od 82% do 87%.
  2. Przygotowanie N-H-B-etylo-1,2-azaborina (5)
    1. W komorze z rękawicami odważ 1,00 g N-H-B-OBu-1,2-azaborina (4) (6,62 mmol) do wysuszonej w piekarniku kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml z mieszadłem magnetycznym i dodać 25 ml Et2O. Uszczelnij kolbę gumowym septem i umieść pod azotem (N2).2 na próżniowym kolektorze gazowym.
    2. Do oddzielnej, wysuszonej w ovenie kolby okrągłodennej o pojemności 100 mL należy dodać w atmosferze azotu 26,5 mL roztworu etylolitu (0,5 M w benzenie/cykloheksanie, 13,2 mmol). Usunąć mieszaninę rozpuszczalników (benzen/cykloheksan) z odczynnika etylolitowego, aby uniknąć problemów z izolacją pożądanego produktu azaboryny. Ponownie rozpuścić stały etylolit w 13,0 mL Et2O.
      UWAGA: Ostrożnie: Odczynniki litnoorganiczne są piroforyczne (zapalają się w kontakcie z powietrzem lub wodą). Pożądany produkt (5) jest szczególnie lotny (MW = 106,96). W związku z tym, ze względu na podobną lotność względem pożądanego produktu, konieczne jest usunięcie rozpuszczalnika w postaci benzenu/cykloheksanu z odczynnika etyllitowego w celu skutecznej izolacji czystego produktu.
    3. Schłodzić kolbę reakcyjną zawierającą 4 do -30 °C z użyciem łaźni chłodzącej.
    4. Przenieść roztwór etylolitu do kolby reakcyjnej za pomocą kaniuli w temperaturze -30 °CKontynuuj mieszanie w tej temperaturze przez 1 h, a następnie pozwól mieszaninie powoli ogrzać się do temperatury pokojowej.
    5. Monitorowanie reakcji poprzez 11B NMR. (Pożądany sygnał produktu pośredniego pojawia się przy ok. 39,8 ppm.)
    6. Po zakończeniu reakcji schłodzić ją do -30 °C i dodać 6,62 ml roztworu HCl (2,0 M w Et)2O, 13,2 mmol). Mieszano mieszaninę reakcyjną przez 1 h, pozwalając jej powoli ogrzać się do temperatury pokojowej.
    7. Usuń rozpuszczalnik na próżniowym manifoldzie gazowym wyposażonym w pompę niskopróżniową (20-25 Torr), aby otrzymać surową mieszaninę produktów.
    8. W komorze rękawicowej wyizoluj produkt za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując 2-metylobutan jako eluent. Usuń lotną frakcję na manifoldzie próżniowym wyposażonym w obniżoną próżnię, aby otrzymać czysty produkt w postaci bezbarwnej cieczy.
      UWAGA: Wydajność wynosi 56%.

2. Przygotowanie białek i krystalizacja mutantów lizozymu T4

  1. Ekspresja i oczyszczanie białek
    1. Hodowla E. coli komórki RR1 przekształcone subklonowanymi plazmidami (L99A lub L99A/M102Q)17, 20 w 200 ml pożywki LB (lysogeny broth) z dodatkiem 40,0 mg ampicyliny przy 37 °C przez 12 h.
      UWAGA: Skład pożywki LB to 12 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g chlorku sodu i 1 g glukozy na 1 L H2O2O.
    2. Zaszczep 4,00 L pożywki LB (uzupełnionej o 800 mg ampicyliny) 160 ml kultury nocnej i inkubuj w 37 °C przy 240 obr./min z filtrowanym dopływem powietrza.
    3. Gdy gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 0,7, należy schłodzić kulturę bakteryjną do temperatury pokojowej, wyjmując ją z inkubatora.
    4. Odmierzyć 695 mg izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) (stężenie końcowe 0,7 mM) do stożkowej probówki do wirowania i dodać 4 ml pożywki LB w celu rozpuszczenia.
    5. Dodaj roztwór IPTG do hodowli, aby indukować ekspresję białka. Inkubuj hodowle przy 110 obr./min przez 21 h w temperaturze 25 °C.
    6. Wiruj kulturę z prędkością 4 412 x g przez 30 min w temperaturze 4 °COdlej nadsącz i resuspenduj osad w 300 ml 0,1 M fosforanu sodu (pH 6,6) i 0,2 M NaCl, a następnie dodaj 30,0 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (pH 8,0). Mieszaj zawiesinę przez 17 h w temperaturze 4 °C.
    7. Dodać 30,0 ml 1,0 M MgCl22 i dodano 0,500 ml deoksyrybonukleazy I (DNase I) do zawiesiny, a następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 8 h.
    8. Wirować zawiesinę lizowanych komórek z przeciążeniem 30 913 x g przez 30 min w temperaturze 4 °CZebrać nadsącz zawierający ekspresowane białko, a osad odrzucić.
    9. Przeprowadzić dializę lizatu przeciwko 20 mM fosforanu sodu (pH 6,5 dla L99A oraz pH 6,3 dla L99A/M102Q) w 4 °C przez noc.
    10. Wypłukać i zrównoważyć 20,0 ml kulek do wymiany jonowej z karboksymetylozą buforem do równoważenia (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) w kolumnie. Nanieść roztwór zawierający białko na kulki, a następnie wypłukać kolumnę 100 ml buforu do równoważenia. Eluować kolumnę za pomocą gradientu liniowego 300 mM NaCl w buforze do równoważenia o objętości 600 ml.
    11. Do oczyszczania kolumnowego należy użyć systemu chromatografii niskociśnieniowej. Przyjąć szybkość przepływu pompy 1 ml/min i zbierać frakcje o objętości 10 ml. Należy zebrać frakcje zawierające czyste białko.
      UWAGA: Podczas elucji należy monitorować gęstość optyczną (OD) przy 280 nm w celu potwierdzenia obecności białka. Czystość każdej frakcji należy określić za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i zebrać wyłącznie frakcje o najwyższej czystości.

Chromatogram SEC i wynik żelu SDS-PAGE dla analizy oczyszczania białka, pokazujące profil elucji.
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki oczyszczania białka mutantu T4 lizozymu L99A/M102Q. A) Chromatogram przedstawiający zmierzoną absorbancję UV w A. U. przy 280 nm (linia niebieska) oraz przewodność w mS/cm (linia czerwona). Frakcje 20–23 zostały połączone, a czystość określono za pomocą SDS-PAGE. B) Żel 15% SDS-PAGE wykazujący obecność oczyszczonego białka z frakcji 20–23 przy 18,6 kDa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Krystalizacja białka
    1. Przenieś oczyszczony roztwór białka do membrany dializacyjnej (12,000 do 14,000 MWCO). Umieść tubę dializacyjną w zlewce zawierającej 4,00 L 100 mM fosforanu sodu, 550 mM NaCl, 0,02% NaN3 (pH 6,5 dla L99A i pH 6,3 dla L99A/M102). Mieszaj 4 L roztworu przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Dodaj 2-merkaptoetanol (stężenie końcowe 5 mM) do zdializowanej próbki i zagęść do ~40,0 mg/mL przy użyciu koncentratora odśrodkowego (10,000 MWCO). Określ stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm. Przed krystalizacją usuń wszelkie osady poprzez wirowanie.
    3. Do krystalizacji białka zastosuj metodę dyfuzji pary z wiszącą kroplą. Wymieszaj 5,00 µL zagęszczonego roztworu białka z 5,00 µL roztworu rezerwuarowego (2,0-2,2 M fosforanu sodu/potasu, pH 6,7-7,1, 50 mM 2-merkaptoetanolu, 50 mM 2-hydroksyetylodisiarczku) na silikonizowanym szkiełku nakrywkowym.
    4. Równoważ kroplę mieszaniny względem 1,00 mL roztworu rezerwuarowego, kładąc szkiełko nakrywkowe do góry dnem na każdym dołku zawierającym roztwór rezerwuarowy. Użyj smaru, aby szczelnie zamknąć każdy dołek za pomocą szkiełka. Przygotuj różne warunki, używając płytki 24-dołkowej z roztworem rezerwuarowym opisanym w punkcie 2.2.3. Przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C w celu wzrostu kryształów.
      UWAGA: Kryształy zazwyczaj rosną w ciągu 1-2 tygodni w zrównoważonym buforze na szkiełku nakrywkowym. Natychmiastowe wytrącanie podczas mieszania roztworu białka z roztworem rezerwuarowym w kroku 2.2.3 wskazuje na niepowodzenie krystalizacji.

Obraz z mikroskopu krystalizacji; wzrost kryształów białka; paski skali 1,0 mm, 0,5 mm.
Rysunek 4: Reprezentatywne zdjęcie kryształów mutanta L99A lizozymu T4 przed kompleksowaniem z ligandami. Kryształy znajdują się w roztworze macierzystym (2,1 M fosforanu sodu/potasu, pH 6,9, 50 mM 2-merkaptoetanolu, 50 mM 2-hydroksyetylodisiarczku). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie kompleksu
    1. Pobrać kryształy za pomocą rurki kriogenicznej uformowanej w pętlę (patrz Lista materiałów) i umieścić je w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 mL. Dodać do probówki 50,0 µL ługu macierzystego, aby zapobiec wysychaniu i zachować kryształy.
      UWAGA: Wybór pojedynczego kryształu ułatwia zastosowanie mikroskopu.
    2. Przenieść probówkę z kryształami do komory rękawicowej. Pobrać 5,00 µL liganda azaborynowego (5) i umieścić go w zakrętce probówki. Zamknąć probówkę i przechowywać ją w lodówce (4 °C) wewnątrz komory rękawicowej przez 2-7 dni w celu równoważenia metodą dyfuzji par.
      UWAGA: Właściwości fizyczne (wysoka lotność i rozpuszczalność w roztworach wodnych) liganda azaborynowego (5) umożliwiają kompleksowanie z wcześniej uformowanymi kryształami białka za pomocą metody dyfuzji par.
    3. Przenieść kryształy za pomocą rurki kriogenicznej uformowanej w pętlę na szkiełko przedmiotowe zawierające kroplę N-paratone przed szybkim mrożeniem w ciekłym azocie. Pobrać kryształ zabezpieczony N-paratone i szybko zamrozić, zanurzając pętlę z kryształem w naczyniu Dewara z ciekłym azotem. Zamocować kryształ na pętli za pomocą kleszczyków kriogenicznych.
    4. Zebrać zestawy danych z pojedynczego kryształu przy użyciu promieniowania synchrotronowego. Przeprowadzić wymianę molekularną z wykorzystaniem opublikowanych struktur20,24; potwierdzić obecność liganda w centrum wiążącym białka na podstawie niemodelowanej plamy gęstości elektronowej.

Analiza struktury białka, mapa gęstości elektronowej, wyniki krystalografii, oddziaływania molekularne.
Rycina 5: Modele atomowe kieszeni wiążącej mutanta L99A lizozymu T4 wraz z gęstością elektronową. A) Jamka L99A z niemodelowaną plamą gęstości elektronowej w miejscu wiązania. B) Jamka L99A z wymodelowanym ligandem azaborynowym 5 w dwóch alternatywnych konformerach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczna trasa syntezy dla 1,2-azaboryn jest pokazana na rysunku 1. Protokół ten ma zastosowanie do syntezy pięciu różnych cząsteczek zawierających azot boru. Rysunek 2 przedstawia widma 11B NMR zmierzone w trakcie kroku 1.3 w celu monitorowania tworzenia się pożądanego produktu (3). Oczyszczanie białek przeprowadzono przy użyciu systemu chromatografii niskociśnieniowej, a reprezentatywny chromatogram przedstawiono na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pierwszej części niniejszego protokołu opisaliśmy zmodyfikowaną syntezę 1,2-azaboryny w oparciu o wcześniej opisane metody12, 13. Trialliloboran22 zastosowano jako substytut dróg wykorzystujących allitrifenylocycynę lub alliltrifluoroboran potasu do przygotowania adduktu chlorku N-allil-N-TBS-B (1). Ta metoda pozwala na bardziej ekonomiczne i przyjazne dla środowiska podejście. Do syntezy N-TBS...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych w tym manuskrypcie.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) i Boston College.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

st
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tetrahydrofuran (THF), wolny od inhibitorów, do HPLC, ≥ 99,9%Sigma Aldrich34865
Eter dietylowy (Et2O), do HPLC, ≥ 99,9%, bez inhibitorówSigma Aldrich309966
Chlorek metylenu  (CH2Cl2), (stabilizowany/certyfikowany ACS)FisherD37-20
ToluenFisherT290-4
Pentan, HPLCFisherP399-4
AcetonitrylFisherA21-4
Wodorek wapnia (CaH2), klasa odczynnika, 95%Sigma Aldrich208027Pallad piroforyczny
na węglu aktywnym (Pd/C), 10% wag. PdStrem46-1900
1,0 M roztwór trichlorku boru w heksanieSigma Aldrich211249Wysoce toksyczna/piroforyczna
trietyloamina, ≥ 99.5%Sigma Aldrich
Grubbs materiaC823
AcetamidSigma AldrichA0500
n-butanol, bezwodny, 99,8%Sigma Aldrich281549
roztwór etylitu, 0,5  M w benzenie/cykloheksanieSigmaAldrich 561452Wysoce toksyczny/piroforyczny
roztwór HCl, 2,0 M w Et2OSigma Aldrich455180
2-metylobutan, bezwodny, ≥ 99%Sigma Aldrich277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani i Chalmers (ATCC® 31343™)ATCC31343
T4 lizozym WT* (L99A)Addgene18476
T4 mutant lizozymu (S38D, L99A, M102Q, N144D)Addgene18477
Sól sodowa ampicylinySigma AldrichA0166
izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) InvitrogenAM9464
Fosforan sodu jednozasadowy bezwodnyFisherBP329
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisherBP332
Chlorek soduFisherS642212 
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFisherBP118
Chlorek magnezuSigma AldrichM4880
Thermo naukowe przebijanie DNaseIFisherPI-90083
GE Healthcare  Sepharose Fast Flow KationExchangeFisher45-002-931
Tris-baseFisherBP152-500 
Azydek soduTCIS0489Wysoce toksyczny
2-merkaptoetanolFisherICN806443 
Sartorius  Koncentratory odśrodkowe Vivaspin 20Fisher14-558-501
Fosforan potasu jednozasadowySigma AldrichP5379
Dwusiarczek 2-hydroksyetyluSigma Aldrich380474
N-paraton Hampton ResearchHR2-643
4 RC Rurki membranowe do dializy 12 000 do 14 000 daltonów MWCO Rybak08-667E
  CryoLoopHampton Researchrurki kriogeniczne w kształcie pętli
CryoTongThermo Fisherszczypce kriogeniczne
CootObrazy gęstości elektronów są generowane z oprogramowania
Katalizator generacji 1 471283

Bibliografia

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza 12 azaborinymetoda dyfuzji partechniki beztlenowekomora r kawicowapr niowy manifold gazowyoczyszczanie bia ekkrystalizacjadyfrakcja rentgenowskaNMR boru 11
Synteza 1,2-azaborin i otrzymywanie ich kompleksów białkowych z mutantami lizozymu T4
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.