Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą

CF jest spowodowany mutacjami w genie CFTR (transmembrane conductance regulator) mukowiscydozy, który koduje nabłonkowy kanał anionowy. Mukowiscydoza dotyka około 85 000 osób na całym świecie¹. Zidentyfikowano ponad 2000 mutacji CFTR (www.genet.sickkids.on.ca). Ta różnorodność częściowo wyjaśnia szerokie spektrum obserwowanych fenotypów chorób (www.CFTR2.org)^2,3. Sześć klas mutacji CFTR zdefiniowano na podstawie ich wpływu na ekspresję i funkcję białka CFTR: (I) brak syntezy, (II) upośledzony transport, (III) wadliwe bramkowanie kanałów, (IV) zmienione przewodnictwo, (V) obniżony poziom normalnie funkcjonującego CFTR i (VI) upośledzona stabilność powierzchni komórki⁴. Chociaż powszechne mutacje CFTR są dobrze zbadane, funkcja CFTR i związek ze statusem klinicznym pozostają słabo poznane na poziomie jednostki, szczególnie w przypadku dużej grupy rzadkich mutacji "sierocych" (www.CFTR2.org)^1,3.

Ostatnio opracowano leki, które celują w białko CFTR w sposób specyficzny dla mutacji. Dwie klasy leków ukierunkowanych na białko CFTR są obecnie w użyciu klinicznym i mają różne sposoby działania. Wzmacniacze, takie jak VX-770, zwiększają otwarte prawdopodobieństwo wystąpienia zmutowanego CFTR zlokalizowanego wierzchołkowo i działają bezpośrednio po ich dodaniu do komórek⁵. Korektory, takie jak VX-809, przywracają transport nieprawidłowo sfałdowanego CFTR zlokalizowanego w retikulum endoplazmatycznym i wymagają wstępnej inkubacji z komórkami, zanim zaobserwuje się efekty⁶. Wzmacniacz CFTR, VX-770, został zarejestrowany dla pacjentów z mutacją G551D^7,8, a także dla ośmiu innych mutacji bramkowania CFTR, w tym S1251N⁹; Łącznie mutacje te są nosicielami 5% wszystkich pacjentów z mukowiscydozą. Inne badania kliniczne wykazały, że VX-770 w połączeniu z korektorem VX-809 ma ograniczony, ale znaczący wpływ na czynność płuc i powoduje zmniejszenie częstości zaostrzeń u osób homozygotycznych pod względem mutacji F508del przenoszonych przez 45-50% pacjentów^10,11.

Konwencjonalne badania kliniczne mające na celu zidentyfikowanie osób reagujących na leki u pozostałych 50% pacjentów z mukowiscydozą są kosztowne i czasochłonne oraz niewykonalne dla osób z niezwykle rzadkimi genotypami CFTR. Nowatorskie, opłacalne i spersonalizowane metody mają kluczowe znaczenie dla dopasowania rosnącej liczby modulatorów CFTR do osób będących nosicielami dowolnego rodzaju mutacji CFTR. Do tej pory włączenie do badania grup pacjentów z określonymi mutacjami CFTR opierało się na badaniach z wykorzystaniem transfekcji zmutowanego genu CFTR w heterologicznych układach komórkowych, a następnie na badaniach elektrofizjologicznych w komorach Usinga^5,6,12. Ze względu na brak odpowiednich modeli zwierzęcych mukowiscydozy, do opracowania leków wykorzystano badania skuteczności leków w komórkach nabłonka oskrzeli różnicowanych powietrzem, cieczą i interfejsem, pochodzących z materiałów eksplantatów płuc mukowiscydozy^13,14,15. Jednak ograniczona dostępność tkanek eksplantacyjnych płuc i inwazyjne procedury pozyskiwania komórek oskrzeli od osób bez schyłkowej fazy choroby utrudniają analizę rzadziej występujących mutacji CFTR i uniemożliwiają testowanie leków w spersonalizowany sposób. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, "łatwo dostępne" tkanki, takie jak organoidy jelita grubego, komórki dróg oddechowych nosa i komórki dróg oddechowych pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, są obecnie badane pod kątem spersonalizowanych terapii lekowych.

Poprzednio ustaliliśmy protokoły hodowli nabłonkowych komórek macierzystych z dowolnego narządu przewodu pokarmowego w formie organoidów 3D^16,17. W przypadku ludzkiej okrężnicy/odbytnicy warunki hodowli obejmują określone czynniki wzrostu (nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF), gastryna, Wnt-3A, R-spondyna 3 (Rspo3) i Noggin) w połączeniu z małymi cząsteczkami (nikotynamid, A83-01 i SB202190) w macierzy błony podstawnej. W tych warunkach pojedyncze komórki macierzyste lub małe fragmenty tkanek wyrastają w zamknięte, torbielowate, trójwymiarowe struktury utworzone przez silnie spolaryzowany nabłonek, którego podstawa jest skierowana na zewnątrz. Wszystkie typy komórek zwykle pojawiają się w swoich normalnych proporcjach i pozycjach. Organoidy mogą być namnażane przez długi czas poprzez cotygodniowe mechaniczne zakłócenia i ponowne powlekanie. Są one stabilne genetycznie i fenotypowo i mogą być przechowywane, co pozwala na długoterminową ekspansję i biobankowanie¹⁷. Są one podatne na wszystkie standardowe manipulacje biologiczno-genetyczne i techniki analityczne opracowane dla linii komórkowych 2D¹⁸.

Niedawno wykazaliśmy, że funkcję CFTR można łatwo zmierzyć w organoidach jelita grubego w teście na obrzęk wywołany forskoliną (FIS)^19,20. Pod wpływem forskoliny (Fsk) lub, alternatywnie, toksyny, organoidy gwałtownie zwiększają poziom cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP), co z kolei powoduje otwarcie kanału CFTR¹⁹. Organoidy pochodzące od osób zdrowych lub od osób z mutacjami CFTR związanymi z funkcją resztkową będą następnie pęcznieć w wyniku transportu jonów i wody do światła organoidu, co jest odpowiednikiem biegunki wydzielniczej in vitro. Wcześniej wykazano, że odpowiedź FIS organoidów jelita grubego jest w pełni zależna od CFTR, na co wskazują organoidy pochodzące od osób bez CFTR oraz zastosowanie specyficznych farmakologicznych inhibitorów CFTR¹⁹. Duże zestawy danych specyficznych dla pacjenta można uzyskać w ciągu kilku tygodni po wykonaniu biopsji.

Dla szczegółowo opisanego tutaj testu FIS, organoidy są hodowane z biopsji doodbytniczej, które można uzyskać w każdym wieku i z ograniczonym dyskomfortem²¹. Organoidy są przenoszone co tydzień przez mechaniczne rozerwanie do pojedynczych krypt, które łatwo ponownie się zamykają i tworzą nowe organoidy. Do przeprowadzenia testu FIS, ~30-80 tych uszkodzonych małych organoidów jest platerowanych w każdym dołku 96-dołkowej płytki¹⁹. W dniu testu organoidy są barwione zielenią kalceinową, fluorescencyjnym barwnikiem przepuszczalnym dla komórek, który jest zatrzymywany w żywych komórkach, ułatwiając obrazowanie na żywo. Następnie dodaje się Fsk, który podnosi wewnątrzkomórkowy cAMP i tym samym aktywuje CFTR, w celu stymulacji obrzęku organoidów. Wzmacniacze, które działają na wierzchołkowy CFTR, są dodawane jednocześnie z forskoliną, podczas gdy korektory, które przywracają transport CFTR, są dodawane 24 godziny przed dodaniem Fsk. Pęcznienie organoidów określa się ilościowo za pomocą automatycznej analizy obrazu, która oblicza względny wzrost całkowitej powierzchni wszystkich obiektów fluorescencyjnych dla każdego punktu czasowego po dodaniu forskoliny.

3D organoidowe pęcznienie zapewnia zalety i wady w porównaniu z istniejącymi elektrofizjologicznymi odczytami CFTR w hodowanych komórkach dróg oddechowych 2D w komorach Ussing. Główną zaletą jest przepustowość testu pęcznienia. Komórki są hodowane i oznaczane przy użyciu jednego rodzaju pożywki hodowlanej, a doświadczony technik może hodować do 25 próbek organoidów tygodniowo, jednocześnie określając ilościowo około 1200 punktów danych tygodniowo w 12 próbkach pacjentów. Konwencjonalnie typujemy pojedynczy warunek eksperymentalny poprzez zduplikowane lub potrójne pomiary na płytce i powtarzamy takie pomiary w trzech niezależnych punktach czasowych inkubacji. W sumie mierzy się około 300-500 pojedynczych struktur organoidowych w każdym warunku eksperymentalnym, co prowadzi do bardzo precyzyjnych pomiarów funkcji CFTR przy ograniczonej zmienności technicznej. Ta precyzja pozwala nam jasno zdefiniować różnice w funkcji resztkowej i odpowiedzi na modulatory CFTR i pozwala nam łatwo wychwycić genetyczne efekty tła między pacjentami z identycznymi mutacjami CFTR^{19,22,23,24,25}. Jakość danych można łatwo ocenić na podstawie obrazów mikroskopowych. Chociaż FIS jest w pełni zależny od CFTR, jest pośrednią miarą wyniku dla funkcji CFTR, a jego odczyt jest spowodowany sprzężeniem transportu jonów z transportem płynów. Kontrastuje to z bezpośrednimi pomiarami funkcji CFTR w komorach Ussing, które mierzą transnabłonkowe prądy jonowe²⁶. Komory użytkowe umożliwiają selektywną stymulację przedziałów wierzchołkowych lub podstawno-bocznych (na co nie pozwala test organoidowy); poprzez przepuszczalnie błon podstawno-bocznych, wierzchołkowe wydzielanie anionów zależne od CFTR może być selektywnie mierzone²⁷.

Wszystkie eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich opisane tutaj zostały zatwierdzone przez komisję etyczną w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Utrechcie (UMCU; TcBio #14-008). Świadomą zgodę na pobranie, wytwarzanie, przechowywanie i wykorzystanie organoidów uzyskano od pacjentów Szpitala Dziecięcego Wilhelmina (WKZ)-UMCU.

1. Przygotowanie odczynników do hodowli

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego i zgodnie ze standardowymi wytycznymi dotyczącymi pracy z kulturami komórkowymi. Aby ułatwić tworzenie ładnych kropel matrycy błony podstawnej, należy utrzymywać w inkubatorze wstępnie podgrzany zapas 96-, 24- i 6-dołkowych płytek w temperaturze 37 °C.

1. Preparat podstawowy
   UWAGA: Pożywka podstawowa (BM) odnosi się do zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Advanced Dulbecco z mieszanką składników odżywczych szynki F-12 (Ad-DF) uzupełnioną kwasem 4-(2-hydroxyethil)-1piperazynoetanosulfonowym (HEPES), glutaminą i penicyliną/streptomycyną (Pen/Strep).
   1. Do 500 ml pożywki Ad-DF dodaj 5 ml 200 mM glutaminy, 5 ml 1 M HEPES i 5 ml roztworów wstrzykiwacza/paciorkowca (10 000 U/ml, 10 000 μg/ml).
   2. Przechowywać BM w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 tygodnie.
2. Pożywka kondycjonowana Wnt-3A
   UWAGA: Pożywka kondycjonowana Wnt-3A jest wytwarzana we własnym zakresie przy użyciu linii komórkowej L-Wnt-3A zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. W celu zebrania pożywki kondycjonowanej Wnt-3A, należy zebrać pożywkę wystawioną na działanie komórek przez tydzień i wirować ją przez 5 minut przy 450 x g, aby usunąć pływające komórki.
   2. Przefiltrować pożywkę kondycjonowaną Wnt-3A przez filtr 0,22 μm i podzielić ją na 40 ml podwielokrotności w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać je w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 miesiące bez utraty aktywności.
   3. Zbadać aktywność pożywki kondycjonowanej Wnt-3A w teście TOP/FOP przy użyciu ludzkich komórek nerki zarodkowej (HEK)-293 transfekowanych lucyferazem TOP i FOP oraz TK-Renilla i mierzonych za pomocą zestawu do oznaczania Renilla-lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: TOP-lucyferazy jest plazmidem reporterowym, który zawiera regiony wiążące TCF typu dzikiego. Jeśli pożywka kondycjonowana Wnt-3A jest aktywna, aktywowana jest kanoniczna sygnalizacja Wnt. Beta-katenina przemieszcza się do jądra, aby połączyć się z czynnikami transkrypcyjnymi TCF / LEF i aktywuje transkrypcję reportera lucyferazy, indukując wzrost względnej aktywności lucyferazy po dodaniu substratu. FOP-lucyferazy jest stosowana jako kontrola ujemna, ponieważ regiony wiążące TCF przed genem lucyferazy są zmutowane.
3. Preparat na poziomie okrężnicy
   UWAGA: Przygotować i rozcieńczyć wszystkie czynniki wzrostu i odczynniki zgodnie z zaleceniami producentów. Używaj małych porcji i unikaj cykli zamrażania i rozmrażania. Funkcjonalne czynniki wzrostu są niezbędne dla uzyskania wyników.
   1. Przygotuj pożywkę okrężnicy (CM), uzupełniając BM 1x B27, 1,25 mM N-acetylocysteiny, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastryny, 10 mM nikotynamidu, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 μM A83-01, 10 μM SB202190 i 100 μg / ml środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek pierwotnych.
   2. Podzielić CM na porcje i zamrozić je w temperaturze -20 °C na okres do 4 miesięcy. Rozmrozić podwielokrotności, aby przygotować pełne podłoże okrężnicy (FCM), dodając do CM 50% pożywki zawartej w Wnt-3A. Przechowywać FCM do 7 dni w temperaturze 4 °C bez utraty aktywności.
   3. W celu ustalenia hodowli organoidów z biopsji odbytnicy należy uzupełnić FCM o 50 μg/ml wankomycyny, 50 μg/ml gentamycyny i inhibitora kinazy serynowo-treoninowej (RhoKi) związanego z rho związanym z rho. Używaj tej pożywki, zwanej pożywką izolacyjną (IM), tylko przez pierwsze dwa do trzech dni w hodowli.
4. Przygotowanie roztworu podstawowego EDTA
   1. Przygotować 0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 8, w ultraczystym_H2O, wysterylizowany filtrem 0,22 μm.
5. Manipulacja matrycą błony podstawnej
   1. Przygotować matrycę membrany podstawnej (BMM) zgodnie z zaleceniami producenta.
   2. Rozmrozić BMM przez noc na lodzie.
   3. Podczas przenoszenia BMM z butelki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml należy użyć pipety o pojemności 5 ml i probówki stożkowej o pojemności 15 ml wstępnie schłodzonych w temperaturze -20 °C.
   4. Po rozmrożeniu przechowuj BMM w lodówce w temperaturze 4 °C i inkubuj na lodzie przez co najmniej 30-60 minut przed użyciem.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, BMM musi być zimny i odpowiednio wymieszany przed zatopieniem krypt lub organoidów.

2. Ustalanie organoidów jelita grubego na podstawie biopsji pacjenta z mukowiscydozą

UWAGA: Po pobraniu tkanki, ważne jest, aby utrzymać próbkę na lodzie w soli fizjologicznej, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca²⁺ and Mg²⁺ (DPBS), lub BM. Zaleca się szybkie przetwarzanie biopsji, ale okazało się, że możliwe jest stworzenie kultur organoidowych z biopsji przechowywanych na lodzie przez okres do 7 dni.

1. Pozwól, aby biopsje osiadły na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml i usuń supernatant.
2. Dodać 10 ml DPBS do biopsji i pipetować w górę i w dół 10-20 razy za pomocą pipety 10 ml.
   UWAGA: Pipeta musi być wstępnie zwilżona BM przed pipetowaniem biopsji.
3. Pozwól, aby biopsje osiadły na dnie i usuń supernatant.
4. Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3 4-5 razy, aż supernatant będzie klarowny.
5. Dodać 10 ml DBPS i 200 μl EDTA (0,5 M) do biopsji i umieścić probówkę na kołyszącej się platformie probówki na 60-120 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od pacjenta. Jeśli krypty zostaną zwolnione, DPBS staje się mętny. Inkubacja EDTA może zostać sfinalizowana, gdy krypty można obserwować pod mikroskopem.
6. Pozwól kryptom się uspokoić. Odrzucić supernatant.
7. Pobrać 2 ml BM i dodać je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Potrząśnij tą nową rurką ręcznie w taki sposób, aby wnętrze było pokryte BM.
8. Używając pipety zwilżonej BM, dodaj 2 ml DPBS do probówki zawierającej biopsje i pipetuj w górę i w dół 10-20 razy.
9. Pozwolić, aby biopsje się ustabilizowały i przenieść DPBS wraz z kryptami do nowej probówki zawierającej 2 ml BM, która została przygotowana w kroku 2.7.
10. Powtarzaj kroki 2.8 i 2.9, aż nie zostaną zwolnione żadne krypty.
11. Wiruj krypty w dół przy 130 x g przez 5 minut w temperaturze 8 °C.
12. W międzyczasie przenieś IM do szafy bezpieczeństwa w temperaturze pokojowej (RT).
13. Odrzucić supernatant i dodać 10 ml BM do osadu kryptowego i powtórzyć krok 2.11.
14. Zawiesić osad w 1 ml BM. Weź 5-10 μl i policz liczbę krypt na oko pod mikroskopem.
15. Wiruj krypty w dół przy 130 x g przez 5 minut w temperaturze 8 °C.
16. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 55% BMM (v BMM do v IM).
    UWAGA: Krypty są ponownie zawieszane w odpowiedniej objętości 55% BMM przy 1 krypcie na μl. Jeśli nie ma wystarczającej liczby krypt, minimalna objętość BMM wynosi 40 μl.
17. Do wysiewu odpipetować 35 μl na dołek (w płytce 24-dołkowej). Podziel 35 μl BMM na 3-5 kropli osobno, aby poprawić dyfuzję czynników wzrostu do BMM. Nie twórz bąbelków.
18. Umieścić i pozostawić płytkę do góry nogami w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 20 minut, aby BMM zastygł.
19. Dodać 500 μl IM do studzienki i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
20. Odświeżaj podłoże co 2-3 dni. Usuń starą pożywkę, odpipetowując pipetą P1000, pozostawiając krople BMM w stanie nienaruszonym. Ostrożnie dodać FCM, pipetując go z boku studzienki, a nie bezpośrednio na krople BMM.
    UWAGA: Jeśli w protokole izolacji nie zostaną uwolnione żadne krypty, odwiruj supernatant, przemyj osad 2-3 razy za pomocą BM i ponownie zawieś go w BMM. Weź resztki chusteczki i pokrój je na małe kawałki brzytwą. Zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwiruj i ponownie zawieś w tym samym BMM. Jeśli obecne są jakiekolwiek nabłonkowe komórki macierzyste, będą one również generować organoidy.

3. Pasażowanie organoidów jelita grubego w celu konserwacji, zamrażania i testu obrzęku wywołanego forskoliną (FIS)

UWAGA: Każda hodowla organoidów ma swój własny czas podwajania. Zwykle organoidy mukowiscydozy jelita grubego można rozszerzać 1:3-1:5 razy co 7-10 dni. To dobry znak, jeśli obserwuje się pączkujące struktury. Organoidy mukowiscydozy jelita grubego są mniej torbielowate (ryc. 2A-2C) niż normalne organoidy jelita grubego (ryc. 2D). W celu założenia i utrzymania organoidy są hodowane na płytkach 24-dołkowych; do zamrażania, na płytkach 6-dołkowych; oraz do testu FIS, w pasztetach 96-dołkowych.

1. Pasażowanie organoidów
   1. Trzymaj BMM na lodzie przez co najmniej 30-60 minut przed użyciem.
   2. Trzymaj FCM w temperaturze RT przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
   3. Oznacz jedną probówkę stożkową o pojemności 15 ml nazwą próbki, a drugą probówkę jako "umytą".
   4. Ostrożnie odessać pożywkę z dołków za pomocą pipety P1000, nie naruszając kropli BMM.
   5. Dodać 1 ml BM do 1 studzienki i rozdrobnić krople BMM za pomocą pipety P1000. Przenieść ten 1 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z nazwą próbki.
   6. Przemyć studzienkę kolejnym 1 ml BM i przenieść ją do tej samej probówki o pojemności 15 ml.
   7. Powtórzyć kroki 3.1.5 i 3.1.6 z 5 kolejnymi dołkami (do 6 dołków 24-dołkowej płytki zostanie umytych w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml).
   8. Napełnij probówkę do 12 ml BM. Pipetuj w górę i w dół za pomocą wstępnie zwilżonej pipety o pojemności 5 ml.
   9. Wirować w temperaturze 85 x g przez 5 minut w temperaturze 8 °C.
   10. Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml BM do osadu. Używając tej samej końcówki do pipety P1000, weź końcówkę P10 bez filtra i pipetuj w górę i w dół 20 razy. Wyrzuć zarówno końcówki P1000, jak i P10.
   11. Dodać 4 ml BM za pomocą pipety o pojemności 5 ml i trzymać probówkę przechyloną pod kątem około 70° z pionu na jedną stronę. Wstępnie zwilż nową końcówkę P1000 i energicznie wymieszaj 2-3 razy z P1000 (objętość 1 ml).
   12. Policz do 10, pozostając w pozycji pochylonej, ostrożnie zbierz najwyższą warstwę za pomocą pipety P1000 i przenieś 4 x 1 ml do probówki oznaczonej jako "umyta".
   13. Obserwuj, jak organoidy osiadają na dnie w przechylonej probówce; niezakłócone organoidy i większe kawałki opadną na dno. Odwirować "przemytą" probówkę o pojemności 15 ml przez 5 minut w temperaturze 85 x g i temperaturze 8 °C.
   14. Odrzucić sklarowany osad i dodać wymaganą ilość pożywki i BMM do osadu organoidowego do końcowego stężenia 55% BMM. Mieszać, pipetując w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków (Rysunek 3B).
       UWAGA: Dobrą gęstość uzyskuje się poprzez wysiew 25-30 organoidów w 10 μl BMM.
   15. Wykonaj kroki 2.17-2.19.
2. Pasażowanie do zamrażania
   1. Trzymaj BM w lodzie przez co najmniej 30-60 minut przed użyciem. Trzymaj FCM w temperaturze RT przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
   2. Przygotuj FCM uzupełniony RhoKi (Krok 1.3.3).
   3. Weź trypsynę z lodówki i pozostaw ją w temperaturze RT na co najmniej 30 minut przed użyciem.
   4. Wykonaj kroki 3.1.5-3.1.10.
   5. Usuń jak najwięcej supernatantu, dodaj 4 ml trypsyny i wiruj przez 30 sekund.
   6. Umieścić probówkę w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 minutę i energicznie wirować przez 30 sekund.
   7. Sprawdź roztwór w probówce. Jeżeli nienaruszone organoidy są nadal widoczne pod mikroskopem, należy powtórzyć krok 3.2.7.
   8. Gdy organoidy zostaną rozerwane, dodaj 8 ml BM, aby zneutralizować trypsynę i odpipetuj 10 razy.
   9. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 450 x g w temperaturze 8 °C.
   10. Odrzucić supernatant i dodać wymaganą ilość pożywki i BMM do organoidów, aby uzyskać 55% roztwór BMM. Mieszać, pipetując w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków.
       UWAGA: W celu zamrożenia organoidy należy wysiać w stosunku 1:1 po trypsynizacji.
   11. Wysiewać 250 μl w jednym dołku wstępnie podgrzanej 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, wytwarzając małe, oddzielone kropelki o objętości ~10 μl. Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostawić BMM do zestalenia się na 20-30 minut.
   12. Dodać 2,5 ml świeżego FCM + RhoKi do każdej płytki 6-dołkowej i przenieść płytkę do inkubatora (Rysunek 3C).
3. Organoidy pasażujące do testu FIS
   UWAGA: W zależności od liczby i wielkości organoidów, do wysiania 27 dołków płytki 96-dołkowej wystarczy od 4 do 6 dołków płytki 24-dołkowej.
   1. Przetwarzać organoidy zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.1.13.
   2. Zawiesić granulat w 120 μl 50% BMM.
   3. Potwierdź liczbę organoidów (30-50) w kropli BMM o objętości 3 μl pod mikroskopem.
   4. Na płytkę umieszczono organoidy za pomocą pojedynczej kropli o objętości 3 μl umieszczonej pośrodku każdego dołka 96-dołkowego pasztetu.
   5. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 minut, aby BMM zastygł; dalsze kroki opisano w kroku 6.1.1.

4. Zamrażanie organoidów CF

UWAGA: Organoidy są gotowe do zamrożenia 1-2 dni po trypsynizacji i hodowli, więc organoidy nadal będą małe, co zwiększa efektywność przetrwania po rozmrożeniu.

1. Dodać 1 ml BM i rozdrobnić krople BMM za pomocą pipety P1000. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
2. Umyć studzienkę kolejnym 1 ml BM i przenieść do tej samej probówki o pojemności 15 ml.
3. Powtórz kroki 4.1 i 4.2 ze wszystkimi studzienkami.
   UWAGA: Aby uniknąć nadmiaru BMM, 3 dołki płytki 6-dołkowej są zebrane w jednej probówce o pojemności 15 ml.
4. Napełnić 15 ml probówkę zawierającą organoidy 12 ml zimnego BM i pipetować w górę i w dół pipetą o pojemności 5 ml. Pozostaw tubę na lodzie na 5 minut.
5. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 450 x g i temperaturze 8 °C i usunąć supernatant.
6. Rozpuść osad organoidów w pożywce zamrażającej i pipetuj w górę i w dół, aby prawidłowo zawiesić organoidy.
   UWAGA: Na każde 100 μl BMM stosuje się 500 μl środka zamrażającego.
7. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml przenieść 0,5 ml organoidów zawieszonych w pożywce zamrażającej do sterylnych fiolek kriogenicznych.
8. Przenieść fiolki do pojemnika do zamrażania komórek i umieścić je w temperaturze -80 °C.
9. Po upływie 24 godzin przenieść fiolki do przechowywania w ciekłym azocie.

5. Zakładanie kultur z zamrożonych organoidów

UWAGA: Rozmrozić BMM na lodzie i trzymaj go na lodzie. Pozwól, aby BM osiągnął RT i ogrzej 10 ml podwielokrotności do temperatury 37 °C przed rozpoczęciem procedury rozmrażania jednego kriowialu.

1. Szybko rozmrozić fiolkę przez mieszanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie jeszcze niewielka ilość zamrożonego materiału.
2. Przenieść rozmrożone organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000.
3. Natychmiast po tym dodaj 1 ml ciepłego BM kropla po kropli, potrząsając dnem probówki. Po dodaniu 1 ml pożywki należy dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby rozcieńczyć pożywkę zamrażającą.
4. Powoli (kropla po kropli) dodawać 9 ml ciepłego BM do stożkowej probówki zawierającej organoidy. Odwróć kilka razy.
5. Wirować zawiesinę komórek przez 3 minuty w temperaturze 85 x g i temperaturze 8 °C.
6. Sklarowany osad należy wyrzucić ostrożnie, nie naruszając osadu. Zawiesić organoid w 90 μl FCM uzupełnionym RhoKi (krok 1.3.3). Następnie dodaj 110 μl BMM.
7. Dodaj 35 μl do każdego dołka wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki, tworząc małe, oddzielone kropelki.
8. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, pozostawiając płytkę do góry dnem na 20-30 minut.
9. Dodać 500 μl FCM z RhoKi do każdej studzienki i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora (ryc. 4A-4C).
10. Gdy organoidy prawidłowo zregenerują się po rozmrożeniu, rozcieńczyć więcej BMM, tak aby każde 10 μl BMM zawierało 25-30 organoidów. Procedura ta może być wykonana 2-3 dni po rozmrożeniu (ryc. 4D-4G) i zapewnia prawidłowy wzrost organoidu.

6. Test obrzęku wywołany forskoliną (FIS)

UWAGA: Miareczkowanie Fsk pozwala na pomiar funkcji resztkowej CFTR. W przypadku modulacji CFTR organoidy są poddawane działaniu danego korektora (np. VX-809) i/lub wzmacniacza (np. VX-770), w zależności od genotypu. Zazwyczaj VX-809 dodaje się 18-24 godziny przed pomiarem, natomiast VX-770 i Fsk dodaje się tuż przed rozpoczęciem pomiarów. Należy pamiętać, że niektóre modulatory (korektory/wzmacniacze) mogą wiązać się z plastikową powierzchnią płytki testowej.

1. Posiewanie do testu
   UWAGA: Zapasy VX-809 są podawane w temperaturze 20 mM i przechowywane w temperaturze -80 °C. Podczas rozmrażania pozostaw w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem.
   1. Przetworzyć organoidy w sposób opisany w sekcji 3.3.
   2. W przypadku badania korektora VX-809 należy przygotować krzywą dawka-odpowiedź w trzech egzemplarzach o następujących stężeniach: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 i 30 μM. Przygotować roztwory w FCM.
   3. Do płytki 96-dołkowej dodać 100 μl FCM o odpowiednim stężeniu VX-809 lub 100 μl samej FCM i inkubować płytkę.
2. Pomiar testu
   UWAGA: Akcje VX-770 są kwotowane po 20 mM, podczas gdy Fsk jest po 10 mM; oba są przechowywane w temperaturze -80 °C. Podczas rozmrażania pozostaw w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem.
   1. Weź fiolkę z kalceiną i DMSO i pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 minut.
   2. Dodać 5,1 μl DMSO do fiolki, w której kalceina jest dostarczana w postaci proszku, jeśli nie została otwarta. W przeciwnym razie należy użyć już zawieszonej fiolki z kalceiną zawierającej 2,5 μl kalceiny.
   3. Dodać 2,5 μl kalceiny do 580 μl BM w probówce o pojemności 1,5 ml i oznaczyć etykietą.
   4. Dodać 10 μl tego roztworu barwnika (BM + kalceina) do każdego dołka za pomocą powtórnej pipety.
   5. Ponownie zawiesić raz za pomocą wielokanałowego, aby upewnić się, że barwnik jest dobrze wymieszany.
   6. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   7. Podczas inkubacji kalceiny należy przystąpić do przygotowywania roztworów Fsk i VX-770, jeśli zajdzie taka potrzeba.
   8. W przypadku korzystania z potencjometru VX-770 należy przygotować krzywą dawka-odpowiedź w trzech egzemplarzach o następujących stężeniach: 0,0003, 0,003, 0,03, 3,0 i 30 μM. W przypadku miareczkowania Fsk stężenia wynoszą: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 i 5,0 μM. Przygotować roztwory w BM.
      UWAGA: W przypadku Fsk, VX-770 lub jakiegokolwiek innego leku dodanego drugiego dnia, rozcieńczenia należy przygotować w stężeniu 2x końcowym, ponieważ 100 μl roztworu Fsk/roztworu do miareczkowania leku zostanie dodane do każdej studzienki, która zawiera już 100 μl FCM.
   9. Przenieś roztwory Fsk i VX-770, pipetę p200 i końcówki do pomieszczenia mikroskopowego.
   10. Do obrazowania testu FIS należy użyć mikroskopu konfokalnego do obrazowania żywych komórek wyposażonego w zautomatyzowany stolik, podgrzewaną komorę i przepływ_CO2.
       UWAGA: Poniższe kroki odnoszą się do konkretnego mikroskopu. Do innych mikroskopów należy stosować różne konfiguracje zgodnie z instrukcjami producenta.
   11. Umieść 96-dołkową płytkę w uchwycie na płytki.
   12. Wprowadź ustawienia konfokalne dla obrazowania.
       1. Ustaw narzędzie do obrazowania na żywo na 37 °C i 5% CO₂ i pozwól komorze na wstępną inkubację przez co najmniej 30 minut przed pomiarem.
       2. Użyj opcji "Inteligentna konfiguracja", aby wybrać ścieżkę Alexa fluor-488.
       3. Ustaw obiektyw 5X i obszar skanowania na 0.6X, aby pomniejszyć i uchwycić całą studnię.
       4. Dostosuj moc lasera i czułość detektora, aby umożliwić optymalne wykrywanie organoidów znakowanych na zielono kalceiną na tle. Otwór otworkowy można zwiększyć do 130 μm, a uśrednienie obrazu można ustawić na 2.
       5. Ustaw głębię bitową na 8, a rozmiar klatki na 512 x 512.
       6. Użyj opcji szeregów czasowych, aby ustawić czas, częstotliwość i interwały pomiaru.
          UWAGA: Sugerowane dla regularnych pomiarów: 1 godzina z 10-minutowym interwałem: cykle = 7 (cykl 1 to T = 0). W celu pomiaru zmniejszonego obrzęku organoidy można obrazować przez okres do 3 godzin.
       7. Użyj opcji kafelka, aby ręcznie określić poszczególne pozycje studni.
   13. Dodać 100 μl roztworów Fsk i/lub VX-770 do odpowiednich studzienek, postępując w tej samej kolejności, co pomiar. Rozpocznij dodawanie roztworów w pierwszym obrazowanym dołku i kontynuuj kolejność obrazowania.
   14. Rozpocznij pomiar.
   15. Po zakończeniu eksperymentu zapisz plik.
3. Analiza danych testowych FIS
   1. Utwórz makro "analizy organoidów" do analizy danych testu FIS za pomocą narzędzia do analizy w oprogramowaniu do analizy obrazu, które rozpoznaje wszystkie struktury zobrazowane za pomocą ścieżki Alexa-488 i wypełnia zidentyfikowane struktury, aby obliczyć wzrost całkowitej powierzchni organoidów w różnych punktach czasowych.
   2. Otwórz plik danych z uzyskanymi obrazami w programie do analizy obrazów.
   3. Wybierz makro do analizy organoidów.
   4. Ustaw próg, aby zrównoważyć stosunek sygnału do szumu w jednym dołku w punkcie czasowym 1 i upewnij się, że wszystkie struktury organoidów są rozpoznane i wypełnione.
      1. Sprawdź 4-6 studzienek, aby zobaczyć, czy wszystkie struktury są również rozpoznawane w punkcie czasowym 7. Nieznacznie zmodyfikuj próg, aby upewnić się, że sygnały tła w punkcie czasowym 7 nie są rozpoznawane jako struktury (określony próg może się nieco zmienić między eksperymentami).
   5. Ustaw kryteria minimalnego rozmiaru obszaru rozpoznawanych obiektów na 1 000 μm².
   6. Naciśnij "analizuj", aby rozpocząć. Analiza trwa około 3 minut, w zależności od używanego oprogramowania.
   7. Po zakończeniu oprogramowania przejdź do "utwórz tabelę" i wybierz następujące dane: numery studni (tabela powinna rosnąć w tej kolejności), punkty czasowe i całkowitą powierzchnię na studnię.
   8. Zapisz plik w formacie .xlm, aby wyeksportować go do programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
   9. W tym programie oblicz względny przyrost powierzchni na studzienkę, ustawiając obszar punktu czasowego 1 na 100%. Oblicz pole pod krzywą (AUC) z punktów czasowych 1-7 dla każdego warunku; dolna granica obszaru (wartość Y) jest ustalona na 100%. Fsk lub miareczkowanie leku (oś X) są wykreślane względem AUC (osi Y).

Rysunek 1A pokazuje reprezentatywną świeżą izolację krypt osadzonych na BMM. Krypty pochodzą z biopsji jelita grubego osoby chorej na mukowiscydozę. Zazwyczaj organoid jest generowany z każdej krypty (Rysunek 1A-C). Ze względu na dysfunkcję CFTR, większość organoidów mukowiscydozy okrężnicy nie jest torbielowata, ale raczej zwarta, z wypukłościami i pączkami (ryc. 2A-2B). Jednak niektóre hodowle organoidów CF, zwłaszcza o wysokiej funkcji resztkowej, mają kilka organoidów o torbielowatym kształcie (ryc. 2C), podobnie jak hodowle organoidów typu dzikiego (ryc. 2D).

Przed przejściem organoidów w celu rozszerzenia hodowli lub przeprowadzenia testu FIS, ważne jest, aby organoidy miały duży rozmiar z wieloma pączkami, jak pokazano na rysunku 3A. Jeśli organoidy są małe i bez licznych pączków podczas przetwarzania do pasażowania, ma to negatywny wpływ na kulturę organoidów. W zależności od jakości i aktywności podstawowych czynników wzrostu, takich jak EGF, Wnt-3A i Rspo3, organoidy osiągają pożądany rozmiar między 7 a 12 dniami (ryc. 3A). Po mechanicznym rozerwaniu pączki są przerywane i wykorzystywane do generowania nowych organoidów w następnym przejściu (ryc. 3B). W przypadku przetwarzania organoidów do zamrożenia ważne jest, aby były one trypsynizowane do małych rozmiarów, jak pokazano na rysunku 3C. Po trypsynizacji organoidy są siane przez 1 lub 2 dni, aby mogły zregenerować się po stresie związanym z manipulacją. Ten krok, w połączeniu z niewielkimi rozmiarami organoidów, zapewnia 98% regenerację komórek po rozmrożeniu (ryc. 4A).

Gdy organoidy są rozmrażane, ważne jest, aby miały dużą gęstość, więc zwykle są rozmrażane w małej objętości (Rysunek 4A). Po jednym lub dwóch dniach w hodowli i po zaobserwowaniu, że organoidy zwiększają rozmiar (porównaj rysunek 4A z rysunkiem 4B-4C), organoidy rozcieńcza się w stosunku 20-30 organoidów na 10 μl BMM, zapewniając odpowiednią gęstość, aby wyrosnąć do większych rozmiarów. Jeśli organoidy są zbyt rozcieńczone, mogą spowolnić wzrost, a nawet różnicować się i umrzeć. Jeśli organoidy są zbyt zatłoczone, brak miejsca lub niedobór czynników wzrostu również spowalnia wzrost organoidów i zmniejsza liczbę pączków.

Posiewanie organoidów z żywotnych kultur z ograniczoną ilością resztek komórkowych powinno doprowadzić do warunków, w których >95% organoidów pęcznieje po stymulacji Fsk, pod warunkiem, że obecna jest wystarczająca funkcja CFTR (>Rysunek 5A-5B). Organoidy pęcznieją w sposób zależny od genotypu i leku, co ilustrują reprezentatywne obrazy organoidów z dwoma allelami F508del (Figura 5A) i organoidami złożonymi heterozygotycznymi dla F508del i S1251N (Figura 5B), mutacji bramkującej CFTR związanej z pewną funkcją resztkową.

Aby określić ilościowo pęcznienie, dla każdego punktu czasowego wybiera się całkowite obszary powierzchni kalceinowo-zielone i wyraża je jako procent T = 0 (ustawiony na 100%; Rysunek 6A). Gruz i małe, niepęczniejące struktury zajmują zwykle poniżej 5% całkowitej powierzchni. Względny wzrost obszaru jest wyrażony w 10-minutowym przedziale czasu, a pomiary AUC (jednostki arbitralne) są generowane dla każdego warunku (T = 0 do 60 min, próg wyjściowy ustawiony na 100%; Rysunek 6B). Stwierdziliśmy, że AUC jest najbardziej solidny, ponieważ obejmuje pewną zmienność w inicjacji obrzęku, a także zależność krzywoliniową powyżej 30-40 min Fsk przy wysokich poziomach funkcji CFTR.

Pomiary funkcji resztkowej w organoidach F508del/F508del zazwyczaj osiągają 0-200 jednostek AUC (100-110% wzrostu powierzchni po 60 minutach leczenia 5 μM Fsk), które mogą wzrosnąć do ~2,500-3,500 jednostek AUC po inkubacji z modulatorami CFTR (VX770+VX809; Rysunek 6C). Organoidy związane z funkcją resztkową CFTR mogą osiągnąć do 4,500 jednostek AUC po 60 minutach stymulacji 5 μM Fsk przy braku modulatorów CFTR (200-220% powierzchni w warunkach przed Fsk). Pęcznienie organoidów osiąga pułap na poziomie ~ 4,500 jednostek AUC, prawdopodobnie z powodu fizycznych ograniczeń struktur organoidów, ograniczającego szybkość wpływu podstawno-bocznego transportu jonów oraz ustanowienia homeostazy transportu jonów i płynów w warunkach "rozciągniętych". Fsk można miareczkować w celu dalszego rozszerzenia zakresu dynamicznego testu przy tych wysokich poziomach funkcji resztkowej CFTR w celu lepszego ilościowego określenia funkcji resztkowej lub wysoce skutecznego leczenia związkiem (np. na co wskazuje wyższa aktywność VX770 na pęcznienie organoidów S1251N po stymulacji niższymi stężeniami Fsk; Rysunek 6D).

Rycina 1: Ustalenie organoidów jelita grubego mukowiscydozy na podstawie biopsji. (A) Reprezentatywne obrazy wyizolowanego materiału z biopsji odbytnicy po umieszczeniu go w BMM w dniu izolacji (przejście 0, dzień 0). Powiększenie wskazanej krypty pokazane jest na prawym dolnym panelu. (B) Te same krypty były śledzone po 7 dniach w kulturze (fragment 0, dzień 7). Pokazane jest powiększenie tej samej krypty przedstawionej w panelu A. (C) Reprezentatywny obraz tej samej kultury organoidowej 11 dni po rozszczepieniu (fragment 1, dzień 11). Podziałka = 100 μm.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne obrazy organoidów jelita grubego mukowiscydozy pochodzące od osób z różnymi mutacjami CFTR. Reprezentatywne obrazy organoidów jelita grubego CF od osób z mutacjami F508del/F508del (A), F508del/R117H-7T (B) i F508del/S1251N (C). (D) Reprezentatywny obraz kultury organoidów jelita grubego od osoby badanej CFTR typu dzikiego. Podziałka = 100 μm. Obrazy te uzyskano bez stymulacji Fsk. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przetwarzanie organoidów jelita grubego CF w celu utrzymania i oznaczania lub do zamrażania. (A) Reprezentatywne obrazy hodowli organoidów jelita grubego z mukowiscydozą, gotowych do przetworzenia w celu pasażowania (B) lub zamrożenia (C). (B) Po ich mechanicznym rozerwaniu formują się małe kawałki, które wygenerują nowe organoidy w następnym przejściu. (C) Po trypsynizacji powstają bardzo małe, okrągłe organoidy, co ułatwia ich żywotność podczas procesu zamrażania. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Tworzenie hodowli organoidów jelita grubego z mukowiscydozy z zamrożonych organoidów. (A-C) Reprezentatywne obrazy hodowli organoidów jelita grubego z mukowiscydozą rozmrożonych w dniu 0 (A). Zdjęcia z tej samej studni zostały wykonane jeden (B) i dwa (C) dni później. (D-G) Reprezentatywne obrazy etapu rozcieńczania opisanego w sekcji 5.9. Gdy organoidy prawidłowo zregenerują się po rozmrożeniu (dzień 3 po rozmrożeniu), są rozcieńczane, aby miały miejsce do wzrostu (D). Zdjęcia z tej samej studni wykonano sześć (E), dziesięć (F) i piętnaście (C) dni po rozmrożeniu. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Obrzęk organoidów mukowiscydozy wywołany forskoliną. (A i B) Reprezentatywne obrazy organoidów jelita grubego F508del/F508del (A) lub F508del/S1251N (B) przed lub po 60 minutach stymulacji Fsk (5 μm) przy braku lub obecności VX-770 (3 μm]) lub VX-770 w połączeniu z VX-809 (3 μm). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Kwantyfikacja obrzęku wywołanego przez forskolinę. (A) Reprezentatywne obrazy wyboru obszaru organoidów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu organoidów F508del/S1251N przed (0 min) i po 60 minutach stymulacji Fsk (5 μM) i VX770 (3 μM). Podziałka = 200 μm. (B) Reprezentatywne obrazy względnego wzrostu powierzchni organoidów F508del/F508del lub F508del/S1251N podczas 60 min stymulacji Fsk (5 μm) przy braku lub obecności VX770 (3 μm) i/lub VX809 (3 μm). (C) Pomiary pola powierzchni pod krzywą w warunkach wskazanych w (B) (T = 60 min, próg podstawowy = 100%). (D) Powierzchnia pod krzywą pomiary organoidów F508del/F508del lub F508del/S1251N przy różnych stężeniach Fsk. Dane przedstawiają średnie ± SD z pojedynczych reprezentatywnych doświadczeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Hans Clevers jest wynalazcą patentów na hodowlę organoidów i test obrzęku indukowanego forskoliną. Jeffrey M. Beekman jest wynalazcą patentu na test obrzęku indukowanego forskoliną. Sylvia F. Boj i Robert Vries są zatrudnieni przez Fundację Hubrecht Organoid Technology (HUB), która posiada wyłączną licencję na technologię organoidów. Poza tym autorzy nie mają nic do ujawnienia.