Ten protokół opisuje test do pomiaru funkcji CFTR i odpowiedzi modulatora CFTR w hodowanej tkance od osób z mukowiscydozą (CF). Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji pęcznieją w sposób napędzany przez cAMP, odpowiedź ta jest wadliwa (lub silnie zmniejszona) w organoidach CF i może zostać przywrócona przez ekspozycję na modulatory CFTR.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrzęk organoidów jelitowych wywołany forskoliną: test in vitro do oceny odpowiedzi na lek u pacjentów z mukowiscydozą
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedawno opracowane leki modulujące transbłonowy regulator przewodnictwa (CFTR) dla mukowiscydozy poprawiają ekspresję powierzchniową i/lub funkcję zmutowanego kanału CFTR u osób z mukowiscydozą (CF). Identyfikacja osób, które mogą odnieść korzyści z tych leków, jest trudna ze względu na dużą heterogeniczność mutacji CFTR, a także inne nieznane czynniki, które przyczyniają się do skuteczności poszczególnych leków. W tym miejscu opisujemy prosty i stosunkowo szybki test do pomiaru indywidualnej funkcji CFTR i odpowiedzi na modulatory CFTR in vitro. Trójwymiarowe (3D) organoidy nabłonkowe są hodowane z biopsji odbytnicy w standardowym podłożu organoidowym. Po ustaleniu, organoidy mogą zostać wykorzystane w biobankach do przyszłej analizy. Do testu 30-80 organoidów wysiewa się na 96-dołkowych płytkach w macierzy błony podstawnej, a następnie poddaje się działaniu leków. Dzień później organoidy są barwione zielenią kalceinową, a obrzęk wywołany forskoliną jest monitorowany za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek w temperaturze 37 °C. Obrzęk wywołany forskoliną jest w pełni zależny od CFTR i jest wystarczająco czuły i precyzyjny, aby umożliwić rozróżnienie między reakcjami na lek u osób z różnymi, a nawet identycznymi mutacjami CFTR. Reakcje na pęcznienie in vitro korelują z odpowiedzią kliniczną na leczenie. Test ten zapewnia opłacalne podejście do identyfikacji osób reagujących na leki, niezależnie od ich mutacji CFTR. Może również odegrać zasadniczą rolę w rozwoju przyszłych modulatorów CFTR.
Wprowadzenie
CF jest spowodowany mutacjami w genie CFTR (transmembrane conductance regulator) mukowiscydozy, który koduje nabłonkowy kanał anionowy. Mukowiscydoza dotyka około 85 000 osób na całym świecie1. Zidentyfikowano ponad 2000 mutacji CFTR (www.genet.sickkids.on.ca). Ta różnorodność częściowo wyjaśnia szerokie spektrum obserwowanych fenotypów chorób (www.CFTR2.org)2,3. Sześć klas mutacji CFTR zdefiniowano na podstawie ich wpływu na ekspresję i funkcję białka CFTR: (I) brak syntezy, (II) upośledzony trans....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich opisane tutaj zostały zatwierdzone przez komisję etyczną w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Utrechcie (UMCU; TcBio #14-008). Świadomą zgodę na pobranie, wytwarzanie, przechowywanie i wykorzystanie organoidów uzyskano od pacjentów Szpitala Dziecięcego Wilhelmina (WKZ)-UMCU.
| sprzęt | Materiałów eksploatacyjnych | Narzędzia |
| Okap z przepływem laminarnym | Probówki stożkowe 15 i 50 ml | Zei.... |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1A przedstawia reprezentatywną świeżą izolację krypt osadzonych na BMM. Krypty pochodzą z biopsji jelita grubego pacjenta z CF. Zazwyczaj z każdej krypty generowany jest jeden organoid (Rysunek 1A-C). Ze względu na dysfunkcję CFTR większość organoidów jelita grubego w CF nie ma charakteru torbielowatego, lecz są one zwarte, z wypustkami i pączkowaniami (Rysunek 2A-2B). Jednakże niektóre hodowle or.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj zapewniamy kompletny protokół wytwarzania, namnażania, zamrażania i rozmrażania ludzkich organoidów jelita grubego. Chociaż już jakiśczas temu opracowaliśmy hodowle ludzkich organoidów, czasami okazywało się trudno wprowadzić tę technologię w innych laboratoriach bez praktycznego szkolenia. Przewidujemy, że te protokoły zastąpią takie szkolenia.
Pożywka kondycjonowana Wnt-3A jest jednym z najważniejszych odczynników, aby odnieść sukces w ustanowieniu i utrzymaniu .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Hans Clevers jest wynalazcą patentów na hodowlę organoidów i test obrzęku indukowanego forskoliną. Jeffrey M. Beekman jest wynalazcą patentu na test obrzęku indukowanego forskoliną. Sylvia F. Boj i Robert Vries są zatrudnieni przez Fundację Hubrecht Organoid Technology (HUB), która posiada wyłączną licencję na technologię organoidów. Poza tym autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez program HIT-CF holenderskiej fundacji CF (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Fundusz Badawczy Szpitala Dziecięcego Wilhelmina i CZ oraz Zilverenkruis/Achmea. Chcielibyśmy podziękować S. Heida-Michel, M. Geerdink, K.M. de Winter-de Groot i G. Berkers (Oddział Pulmonologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy Wilhelmina, UMC Utrecht) oraz R.H.J. Houwen (Oddział Gastroenterologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy Wilhelmina, UMC Utrecht) za kontakt z pacjentami i pobranie biopsji w celu stworzenia biobanku mukowiscydozy.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zaawansowany Dulbecco' s Modyfikowana Pożywka Orły z Mieszanką Składników Odżywczych Szynki F-12 (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Naukowy: Invitrogen | #12634 | przechowywany w temperaturze 4 stopni; C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Naukowy: Invitrogen | #35050 | przechowywany w temperaturze 4 stopni C |
| Hepes | Thermo Fisher Naukowy: Invitrogen | # 15630-056 | przechowywany w temperaturze 4 stopni; C |
| Penicylina/Streptomycyna | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | przechowywany w temperaturze -20 stopni; C |
| 96-dołkowa płytka hodowlana | Cellstar | #655180 | |
| 24-dołkowa płytka hodowlana | Cellstar | #662160 | |
| 6-dołkowa płytka hodowlana | Cellstar | #657160 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | przechowywany w temperaturze 4 ° C |
| Dulbecco' s Zmodyfikowane Orły Średnie (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Naukowy: Invitrogen | #31966-021 | Do produkcji kondycjonowanej pożywki Wnt-3A. Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | do produkcji pożywki kondycjonowanej Wnt-3A. Przechowywany w temperaturze -20 ° |
| Linia komórkowa CL Wnt3A | ATCC | #CRL-2647 | Do produkcji pożywki kondycyjnej Wnt-3A. |
| Plazmidy TOP/FOP | Millipore | #17-285 | Do pomiaru aktywności Wnt |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | Do pomiaru aktywności Wnt |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | Do pomiaru aktywności Wnt |
| System testowy reporterowy z podwójnym lucyferazy | , Promega | #E1910 | Do pomiaru aktywności Wnt |
| Zeocyna | Thermo Fisher Naukowy: Invitrogen | #R250-01 | Do wyboru linii komórkowej Wnt-3A |
| suplement B27 | Thermo Fisher Naukowy: Invitrogen | #17504-044 | przechowywany w temperaturze -20 stopni; C |
| N-acetylocysteina | Sigma Aldrich | #A9165-5G | przechowywana w temperaturze -20 & deg; C |
| Nikotynamid | Sigma Aldrich | #N0636 | przechowywany w temperaturze -20 stopni; C |
| Ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | przechowywany w temperaturze -20 ° C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | przechowywany w temperaturze -20 & deg; C |
| Inhibitor receptora TGFb typu I (A83-01) | Tocris | #2939 | przechowywany w temperaturze -20 ° C |
| Y-27632 dichlorowodorek (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | przechowywany w temperaturze -20 &; C |
| p38 Inhibitor MAPK (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | przechowywany w temperaturze -20 & deg; C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | przechowywany w temperaturze -20 & deg; C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | przechowywany w temperaturze -20 ° C |
| Ludzka R-spondyna 3 (hRspo-3) | R& D Systems | #3500-RS/CF | przechowywany w temperaturze -20 ° C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | przechowywany w temperaturze -20 & C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | przechowywany w temperaturze -20 & deg; C |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C |
| Matrigel | Corning | #354230 | przechowywany w temperaturze -80 & deg; C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | do trypsynizacji organoidów do zamrażania |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | do zamrażania |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | przechowywany w temperaturze -20 stopni; C |
| Forskolina | R& D Systems | #1099-50 mg | przechowywane w temperaturze -80 ° C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | przechowywany w temperaturze -80 &; C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | przechowywany w temperaturze -80 & deg; C |
| Nazwa odczynników/Materiał | Solvent | >Stężenie zapasów | Stężenie końcowe |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicylina/Streptomycyna | 10K U/ml 10K &mikro; g/ml | 100 U/ml 100 &mikro; g/ml | |
| Zeocyny | 100 mg/ml | 125 i mikro; g/ml | |
| B27 suplement | 100x | 1x | |
| N-acetylocysteina | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nikotynamid | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu (hEGF) | DPBS 0,1% BSA | 0,5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastryna | DPBS | 100 &mikro; M | 10 nM |
| Inhibitor receptora TGFb typu I (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dichlorowodorek (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 &mikro; Inhibitor M |
| p38 MAPK (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 &mikro; M |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 &mikro; g / ml | |
| Ludzki Noggin (hNoggin) | DPBS 0,1%BSA | 100 &mikro; g/ml | 100 ng/ml |
| Ludzka R-spondyna 3 (hRspo-3) | zmienia się w zależności od partii | 300 ng/ml | |
| Wankomycyna | 10 mg/ml | 50 &mikro; g/ml | |
| Gentamycyna | 10 mg/ml | 50 &mikro; g/ml | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | MiliQ H2O | 0,5 M | 2 mM |
| Kalceina | DMSO | 10 &mikro; g/ml | 3,3 ng/ml |
| Forskolina | DMSO | 10 mM | zmienna |
| Lumakaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | zmienna |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | zmienna |
Bibliografia
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
