Method Article

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

DOI:

10.3791/55164

⸱

February 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scharakteryzowanie pierwszego zdarzenia biologicznej produkcji węglanu wapnia wymaga połączenia podejść mikroskopowych. Po pierwsze, wewnątrzkomórkowy rozkład pH i jony wapnia można obserwować za pomocą mikroskopii na żywo w czasie. Pozwala to na identyfikację etapu życia i tkanki z cechą będącą przedmiotem zainteresowania dla dalszych badań mikroskopii elektronowej. Etap życia i tkanki będące przedmiotem zainteresowania mają zazwyczaj wyższe sygnały pH i Ca.

Tutaj, używając H. elegans, prezentujemy protokół charakteryzujący obecność struktur węglanu wapnia w próbce biologicznej na skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), używając spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS) do wizualizacji składu pierwiastkowego, używając dyfrakcji wstecznego rozpraszania elektronów (EBSD) do określenia obecności struktur krystalicznych, oraz używając transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do analizy składu i struktury materiału. W tym protokole skupiona wiązka jonów (FIB) jest używana do izolowania próbek o wymiarze odpowiednim do analizy TEM. Ponieważ FIB jest techniką specyficzną dla danego miejsca, pokazujemy, w jaki sposób informacje z poprzednich technik można wykorzystać do identyfikacji obszaru zainteresowania, w którym sygnały Ca są najwyższe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomineralizacja to złożona seria zdarzeń, która łączy w sobie szereg aktywności komórkowych, w wyniku których powstają doskonale uporządkowane minerały1. Wyzwanie polega na scharakteryzowaniu zarówno dynamicznego procesu komórkowego, jak i wyrafinowanych struktur mineralnych przy użyciu kombinacji metod mikroskopii optycznej i elektronowej. Podwyższenie wewnątrzkomórkowego pH sprzyja tworzeniu się kryształów CaCO3, stąd identyfikacja etapu życia, który ma podwyższone pH, ujawnia czas, w którym prawdopodobnie wystąpi zwapnienie2,3.

Rureczki z rodziny Serpulidae są powszechnymi kalcyfikatorami w oceanie4. Jest to również popularny model bezkręgowców do badań morskich, zwłaszcza w biofoulingu5,6. W niniejszej pracy obserwuje się proces zwapnienia w komorach mineralizujących podczas biomineralizacji. Szybki proces metamorfozy obejmuje pojawienie się struktur węglanu wapnia7,8.

Pokazujemy, jak można przeprowadzić wewnętrzne pomiary pH na rureczniku oraz jak można badać etapy życia i tkanki istotne dla zwapnienia. Po zidentyfikowaniu interesującego etapu życia tkankę odpowiedzialną za zwapnienie można scharakteryzować w wyższej rozdzielczości za pomocą metod mikroskopii elektronowej. Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej określamy czas potrzebny do pojawienia się węglanu wapnia po indukcji metamorficznej. Podobny etap życia został następnie zwizualizowany za pomocą SEM-EDS w celu dystrybucji składu pierwiastkowego, a zdeponowany minerał przeanalizowano przy użyciu dwóch różnych metod mikroskopii elektronowej, w szczególności SEM-EBSD i FIB-TEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Badania przesiewowe pod kątem etapu życia i tkanki będącej przedmiotem zainteresowania za pomocą obrazowania na żywo

  1. Hodowla larw morskich do kompetencji zgodnie z wcześniej opisanymi metodami6,7,9. Wysiadywać larwy tubeworm w ilości 5 larw na ml gęstości w przefiltrowanej wodzie morskiej z 10 μM SNARF-1 AM przez noc. Przykryj pojemnik folią aluminiową, aby chronić sondę fluorescencyjną przed fotowybielaniem.
  2. Obserwuj larwy za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Właściwe larwy rurkowca gotowe do metamorfozy będą pływać w kierunku do przodu zamiast ruchu okrężnego.
  3. Przenieś właściwe larwy do siatki o grubości 60 μm. Dociśnij siatkę do szalki Petriego, zapewniając dobre uszczelnienie zatrzymujące płyn. Szybko zwolnij uszczelkę, aby uwolnić i wyrzucić wodę morską zawierającą barwnik fluorescencyjny, zatrzymując larwy.
  4. Umyj larwy dwukrotnie przefiltrowaną sztuczną wodą morską (FASW), uważając, aby nie wysuszyć larw w tym procesie.
  5. Umieścić od 10 do 20 larw w cienkich szklanych naczyniach z dnem z 5 ml FASW zawierającego 10-4 M izobutylometyloksantyny (IBMX) w celu obserwacji procesu metamorfozy.
  6. Włóż kostki filtrujące, aby wykryć sygnał SNARF-1 (kanał 1: Ex 510/25 Em 580/30; Kanał 2: Ex 510/25 Em 640/35) oraz obraz DIC larw.
  7. Umieść metamorfozujące larwy pod obiektywem 20X, a następnie zoptymalizuj czas otwarcia migawki (100-300 ms) wystarczająco szybko, aby zapewnić uchwycenie wyraźnego obrazu żywych zwierząt.
  8. Ustaw odległość 1 μm, aby uchwycić stos Z wszystkich trzech kanałów, podczas obrazowania żywego zwierzęcia, obrazowanie każdej warstwy dla wszystkich trzech kanałów przed przejściem do następnej warstwy kierunku z umożliwiłoby lepszą korelację między kanałami.
  9. Eksportuj obrazy w skali szarości dla wszystkich kanałów i warstw jako pliki TIF z oprogramowania mikroskopu: Plik | Eksport | Typ pliku: TIF | Początek.
  10. Korzystając z ImageJ, zaimportuj sekwencję obrazów dla każdego kanału: Plik | Import | Sekwencja obrazów.
    1. Aby zaimportować kanał 1 λ1em, wprowadź obraz początkowy 3 i przyrost: 4.
    2. Aby zaimportować kanał 2 λ2em, wprowadź obraz początkowy 4 i przyrost: 4.
  11. Wygeneruj obraz kompozytowy, dzieląc λ2em przez λ1em dla każdej warstwy piksel po pikselu (punkt menu Process | Kalkulator obrazów... | Plik obrazu 640 nm "divide" plik obrazu 580 nm), czyli stosunek 640/580 nm.
  12. Wybierz punkt menu Obraz | Tabele przeglądowe | 16 kolorów.
  13. Wybierz pozycję Analizuj | Narzędzia | Pasek kalibracji.
  14. Sprawdź różne warstwy, identyfikując warstwę zawierającą największą niejednorodność. Dostarcza to najbardziej przydatnych informacji dotyczących wewnętrznego rozkładu pH.
  15. Korzystając z zależności między stosunkiem 640/580 nm a pH, skonstruuj profil wykresu, aby zobrazować rozkład wewnętrznego pH.

2. Kalibracja wewnętrznego pH

  1. Po nocnym barwieniu około 20 larw 10 μM SNARF-1 AM, dodać roztwory podstawowe nigerycyny i KCl, aby uzupełnić 50 μM nigerycyny i 150 mM KCl do kalibracji.
  2. Dostosuj pH kalibracyjnego AFSW za pomocą rozcieńczonego NaOH lub HCl, aż do uzyskania pH około 5,9. Zanotuj dokładną wartość pH. Zmierz pH za pomocą pH-metru ze szklaną elektrodą, która została skalibrowana za pomocą 2-amino-2-hydroksymetylo-1,3-propanodiolu (Tris) na bazie wody morskiej i 2-aminopirydyny9.
  3. Przenieść jedną barwioną larwę tubeworm wraz z cieczą o znanym pH do suchego i czystego naczynia w celu pomiaru intensywności sygnałów przy 640 nm i 580 nm.
  4. Powtórz kroki 2.2 i 2.3 dla czterech kolejnych punktów pH w zakresie od 5,9 do 9.9. Reprezentują one szereg wartości istotnych z fizjologicznego punktu widzenia.
  5. Sprawdź, czy sygnały wydają się jednorodne w całym ciele zwierzęcia. Oznacza to, że wewnątrzkomórkowe pH zostało zrównoważone ze środowiskową wodą morską.
  6. Wyobraź sobie larwy tubeworma w pięciu różnych środowiskach pH wody morskiej, zapisz intensywności pokazane jako "szare wartości" przy 640 nm i przy 580 nm, tj. λ2exc i λ1exc.

3. Analiza danych obrazowania ratiometrycznego

  1. Wprowadź szare wartości mierzone w pięciu losowych lokalizacjach lub w obszarze zainteresowania w arkuszu kalkulacyjnym.
  2. Sprawdź, czy pięciopunktowa kalibracja wykazała liniową zależność wskazującą wewnątrzkomórkowe pH (np. równanie takie jak y = 0,30x - 1,47; y = wartość szara; x = pH; R² = 0,934).
  3. Obliczyć wewnątrzkomórkowe wartości pH z równania, używając zmierzonego współczynnika intensywności 640/580 nm w kroku 1.13.

4. Konserwacja, odwadnianie i montaż próbek do mikroskopii elektronowej

  1. Zachowaj interesujący Cię etap życia za pomocą 4% paraformaldehydu. W tym badaniu napraw rurki 2-4 dni po przyczepieniu, trzymaj zwierzęta w utrwalaczu do czasu analizy.
  2. Pracując w dygestorium, należy utrwalić próbkę 1% wodnym roztworem tetratlenku osmu przez 30 minut, aby zminimalizować kurczenie się tkanek podczas procesu odwadniania.
  3. Odwodnić próbkę za pomocą serii stopniowanych etanoli: 50% etanolu przez 5 minut, 70% etanolu przez 5 minut, 85% etanolu przez 5 minut, 95% etanolu przez 5 minut, a na koniec etanol absolutny przez 5 minut dwa razy.
  4. Pracując pod wyciągiem, dodaj do próbki roztwór etanolu i heksametyldisilazanu (HMDS) w stosunku 1:1, pozwalając cieczy całkowicie odparować.
  5. W dygestorium dodaj 100% HMDS do próbki, pozwalając cieczy całkowicie odparować.
  6. Za pomocą noża diamentowego wprowadź kilka nacięć do naczynia hodowlanego, otaczając kilka rureczników. Przy założonej pokrywie przytrzymaj dno naczynia o aluminiowy króciec, aby rozbić naczynie.
  7. Pod mikroskopem preparacyjnym znajdź pęknięty fragment zawierający nienaruszoną rurkę.
  8. Nałóż srebrną farbę na aluminiowy króciec i ostrożnie przymocuj fragment do kłódka. Pomaluj krawędzie plastikowego fragmentu, aby zmniejszyć ładowanie.

5. Lokalizowanie regionu bogatego w wapń za pomocą SEM-EDS

  1. Przymocuj króciec próbki do uchwytu na próbkę.
  2. Zmierz wysokość całego zespołu względem miernika dostarczonego z mikroskopem, regulując wysokość, poluzowując podkładkę blokującą i obracając słupek, aż próbka znajdzie się na standardowej wysokości lub wprowadź wysokość zgodnie z zapisem.
  3. Wpuścić powietrze do komory wymiany mikroskopu i otworzyć drzwi komory. Wsuń uchwyt próbki na koniec pręta wymiennika. Następnie zamknij i opróżnij komorę.
  4. Otwórz zasuwę i wsuń pręt wymiennika w kierunku komory mikroskopu. Wsuń pręt wymienny do końca, aby całkowicie osadzić uchwyt próbki w stoliku mikroskopu. Zdejmij pręt wymienny i zamknij zasuwę.
  5. Wprowadź wymiary próbki i wyślij stolik do pozycji początkowej, aby umieścić próbkę pod kolumną elektronów.
  6. Ustaw poziom podciśnienia w komorze na 20-30 Pa w trybie VP-SEM. Ustaw napięcie przyspieszające elektrony na 20 kV i włącz wysokie napięcie.
  7. Podnieś stolik do odległości roboczej próbki 10 mm. Zdobądź żywy pokarm i zlokalizuj próbkę. Zoptymalizuj obraz, dostosowując astygmatyzm i ostrość w razie potrzeby.
  8. Otwórz program SEM-EDS i wybierz opcję trybu EDS-SEM. Wybierz opcję menu, aby uruchomić mapę EDS.
  9. Zmień ustawienia soczewki kondensora i przysłony, aby uzyskać czas martwy ~30% przy czasie procesu wynoszącym 3, zgodnie z monitorem za pomocą miernika szybkości w programie SEM-EDS. Uruchom procedury wyrównywania wiązki i przysłony po wprowadzeniu jakichkolwiek zmian w ustawieniach wiązki.
  10. Wybierz takie powiększenie, aby pojedynczy organizm wypełniał całe pole widzenia. Włącz opcję korekcji dryftu i przechwyć obraz w programie SEM-EDS.
  11. Pozyskaj dane mapowe z organizmem wypełniającym całe pole widzenia, wykorzystując czas przebywania 50-100 ms. Uruchom mapę, aż dane pokażą wyraźną lokalizację Ca w organizmie (około 15 minut).
  12. Aby uzyskać dane kwantyfikacji punktowej, zmień czas procesu na 6 i dostosuj sondę elektronową, aby uzyskać czas martwy ~30%. Uruchom kroki wyrównywania i zoptymalizuj obraz zgodnie z potrzebami.
  13. Wybierz opcję Punkt i identyfikator w programie SEM-EDS i uzyskaj inny obraz. Korzystając z narzędzia pojedynczego punktu, kliknij obszary, które wydawały się bogate w Ca na mapie EDS, a także obszary z niedoborem Ca w celu porównania. Skanuj każdy punkt, aby uzyskać czas transmisji na żywo wynoszący 30 s.

6. Identyfikacja informacji krystalograficznych regionów bogatych w wapń za pomocą SEM-EBSD

  1. Usuń plastikowy fragment zawierający badaną próbkę z płaskiego króćca próbki i przymocuj do nachylonej powierzchni nachylonego pod kątem 45° króćca za pomocą srebrnego kleju przewodzącego.
  2. Przykręć króciec do uchwytu próbki i ustaw kątową powierzchnię króćca (z próbką) w kierunku przodu uchwytu na próbkę. Włóż uchwyt próbki do komory mikroskopu za pomocą komory wymiennej.
  3. Ustaw próżnię w komorze na 30 Pa i napięcie przyspieszające elektrony na 20 kV. Wyślij próbkę pod kolumnę elektronów i przechyl stolik o 25°, aby umieścić powierzchnię próbki około 70° od normalnej do wiązki elektronów. Włącz wysokie napięcie.
  4. Podnieś stolik na odległość roboczą ~18 mm. Użyj trackballa, aby przesunąć stolik i zlokalizować próbkę. Zwiększ powiększenie, aby wykadrować określone obiekty, które Cię interesują. Wyrównaj wiązkę i zoptymalizuj obraz zgodnie z potrzebami.
  5. Otwórz program SEM-EDS w trybie EBSD. Wybierz kalcyt i aragonit jako interesujące Cię fazy. Włóż kamerę EBSD w odległości 154 mm. Ustaw warunki kamery na binning 1 x 1 i czas klatek 100 ms. Korzystając z rastra jasnej wiązki, uzyskaj tło.
    UWAGA: W zależności od sondy elektronowej może być wymagana inna liczba klatek na sekundę; Dostosuj liczbę klatek na sekundę sondy lub kamery, aby uzyskać sygnał o około 90%.
  6. Przechwyć obraz w programie SEM-EDS. Użyj narzędzia do analizy punktowej i kliknij w dowolnym miejscu obrazu, aby zeskanować belkę w tym punkcie. Obserwuj okno kamery, aby zobaczyć, czy wykryto jakieś wzory Kikuchi.
  7. Kliknij różne obszary obrazu, aby zeskanować potencjalne miejsca zwapnienia, obserwując okno kamery w każdym punkcie, aby sprawdzić, czy obecne są pasma Kikuchiego. Jeśli istnieją wzorce i pasują do którejkolwiek z wybranych faz w bazie danych, zostaną one automatycznie zindeksowane.

7. Przygotowanie próbki TEM za pomocą FIB-SEM

  1. Rozpylić przygotowaną próbkę SEM platyną lub podobnym materiałem, aby utworzyć warstwę przewodzącą.
    1. Umieść wcześniej zamocowane, odwodnione i zamontowane próbki w obudowie powlekarki i włącz zasilanie, aby rozpocząć pompowanie komory w dół.
    2. Gdy próżnia w komorze wskaże 40 mTorr lub mniej, włącz przełącznik gazu i zwiększ przepływ argonu, aby osiągnąć ciśnienie w komorze 200 mTorr. Wyreguluj przepływ gazu, aby osiągnąć końcowe ciśnienie w komorze 80 mTorr.
    3. Włącz przełącznik napięcia i zwiększ napięcie, aby osiągnąć prąd 15 mA. Ustaw timer i powłokę na dłuższy czas (~10 min), aby utworzyć grubą warstwę (~60 nm), która chroni powierzchnię próbki przed uszkodzeniem przez promieniowanie jonowe. Reguluj napięcie, aby utrzymać stabilny prąd 15 mA.
    4. Po zakończeniu wyłącz powlekarkę, aby uwolnić próżnię i usunąć próbkę.
  2. Przykręć podstawę przygotowanej, pokrytej rozpylaniem próbki do zacisku M4 uchwytu próbki instrumentu. Dokręć do oporu ręcznie, poluzuj nakrętkę zabezpieczającą, a następnie obróć słupek uchwytu próbki, aby zmienić wysokość zespołu. Użyj laserowego miernika wysokości i wyreguluj wysokość tak, aby mieściła się w granicach 1 mm (= 0.04 cala, jak pokazano na filmie) od normy dostarczonej z instrumentem.
  3. Zamknij wszystkie zawory pistoletu w FIB-SEM, a następnie wpuść powietrze do śluzy eucentrycznej sceny. Gdy ciśnienie wyrówna się z otoczeniem, przesuń śluzę powietrzną i przymocuj uchwyt próbki na zębach pręta wymiennika. Przekręć pokrętło na końcu pręta wymiennika do pozycji "lock". Zamknij śluzę powietrzną i opróżnij komorę śluzy powietrznej.
  4. Po opróżnieniu śluzy powietrznej stopnia eucentrycznego i dopasowaniu ciśnienia do ciśnienia w komorze FIB-SEM, otwórz zasuwę i włóż próbkę, wciskając pręt wymiennika. Wsuń pręt wymienny do końca, aby osadzić uchwyt próbki w eucentrycznym stage instrumentu, a następnie obróć pręt wymienny do pozycji "odblokowania". Wysuń pręt wymiennika z powrotem i zamknij zasuwę.
  5. Przesuń stolik, aby umieścić próbkę pod kolumną wiązki jonów. Otwórz zasuwy i uzyskaj obraz elektronów wtórnych FIB indukowany żywym jonem. Użyj małego powiększenia i szybkiego skanowania rastrowego, aby zminimalizować uszkodzenia jonowe. Zresetuj ostrość normalnej wiązki obserwacyjnej i podnieś wysokość Z stolika, aż próbka będzie zogniskowana. W tym momencie próbka znajduje się w punkcie krzyżowym, w którym zarówno wiązka jonów, jak i elektronów są skupione w tym samym miejscu.
  6. Korzystając z obrazu elektronów wtórnych z SEM, zlokalizuj obszar zainteresowania w próbce, używając trackballa do przesuwania próbki. Obszarami zainteresowania są obszary bogate w Ca, które wcześniej określono za pomocą mapowania EDS. W razie potrzeby obróć stolik, aby uzyskać interesujące Cię cechy w jednej linii z ramą okna.
  7. W interfejsie okna FIB uchwyć szybką migawkę próbki w powiększeniu 1,000X z dodatkowym 2-krotnym zoomem cyfrowym i narysuj szablon osadzania ~8 μm x 2 μm nad obszarem zainteresowania. Wielkość powiększenia pudełka do osadzania może być dostosowana do cech o różnych rozmiarach. Ustaw warunki napylania tak, aby osadzać węgiel za pomocą wiązki 40 kV, 0,09 nA, używając czasu przebywania 0,5 μs przez 5 minut.
  8. Po osadzeniu węgla zmodyfikuj warunki osadzania, aby zdeponować wolfram za pomocą wiązki 40 kV, 0,7 nA i osadzać przez 5 minut, aby wytworzyć nasadkę wolframową ~2-3 μm.
  9. Zrób migawkę FIB za pomocą wiązki obserwacyjnej i użyj narzędzia do napylania mikropróbkowania, aby narysować wzór czterech pól wokół wolframowej nasadki. Ustaw górne i dolne pola na około 15 μm x 8 μm; Prawe pole 10 μm x 5 μm, a lewe pole 6 μm x 5 μm lub wystarczająco duże, aby otaczać obszar zainteresowania.
    1. Zmodyfikuj warunki produkcji, aby ciąć przy użyciu wiązki 40 kV, 19 nA i czasu przebywania 50 μs oraz 3-4 ramek skanowania dla każdej skrzynki. Następnie sfabrykuj wzór. Po wyprodukowaniu obszar zainteresowania, z ochronnymi warstwami C i W, będzie przypominał wyspę, z której cały przylegający materiał zostanie usunięty na górze, na dole i po prawej stronie.
  10. Przechylić stolik o 58°, aby powierzchnia próbki była normalna do kolumny elektronów i pod ostrym kątem do kolumny jonowej. Zlokalizuj tylną stronę próbki "wyspy" za pomocą FIB i zrób migawkę w powiększeniu 1,000x i 2-4-krotnym zoomie cyfrowym.
  11. Narysuj wzór rozpylania o wymiarach ~15 μm x 2 μm na spodzie tylnej strony "wyspy" próbki, na samym końcu miejsca, w którym jest widoczny. Wytwarzaj pudełko za pomocą wiązki 4 nA przez 3 minuty lub do momentu, gdy wiązka przetnie dno próbki "wyspy".
  12. Przechyl stolik eucentryczny o -58° od bieżącej pozycji (z powrotem do zera). Włóż wolframową sondę do mikropróbkowania, klikając "Probe In" w interfejsie FIB. Wybierz "MS" na stage control panel i użyj trackballa, aby przesunąć sondę nad próbką.
  13. Uzyskaj obraz na żywo z FIB w powiększeniu 1 kx i ustaw sondę tak, aby końcówka znajdowała się bezpośrednio nad prawą stroną wolframowej nasadki mikropróbki. Obserwując obraz SE na żywo z SEM, użyj pokrętła Z stage panel, aby opuścić sondę, aż zetknie się z wolframową nasadką. Po nawiązaniu kontaktu rozlegnie się brzęczyk.
  14. Zrób migawkę za pomocą FIB przy użyciu wiązki 40 kV, 0,01 nA, przy powiększeniu 1,000X i 2-krotnym zoomie cyfrowym. Za pomocą narzędzia do osadzania narysuj ramkę o wymiarach 2 μm x 2 μm nad końcówką sondy w miejscu, w którym styka się z wolframową nasadką mikropróbki.
    1. Ustaw warunki do osadzania wolframu za pomocą wiązki 40 kV, 0,09 nA, przez 2 minuty i czas przebywania 0,5 μs. Następnie sfabrykuj wzór.
  15. Narysuj wzór rozpylania ~2 μm x 5 μm na lewym końcu "ramienia" mikropróbki (gdzie jest nadal połączone z większością próbki). Wytwarzaj wzór za pomocą wiązki 40 kV, 0,7 nA, przez 2 minuty lub do momentu, gdy sygnał dźwiękowy wskaże, że mikropróbka została odłączona od próbki zbiorczej.
  16. Użyj pokrętła sterującego Z, aby podnieść sondę z dołączoną mikropróbką, aż usunie próbkę masową, a następnie wycofaj sondę. Wyślij etap eucentryczny do pozycji Home lub Exchange.
  17. Umieść miedzianą półkratkę w uchwycie z bocznym wejściem i załaduj uchwyt do komory przedmuchiwania stopnia z bocznym wejściem. Opróżnij komorę i włóż uchwyt bocznego wejścia. Ustaw uchwyt w pozycji FIB.
  18. Naciśnij przycisk Side na panelu sterowania sceny i użyj trackballa, aby wyświetlić półsiatkę na monitorze FIB. Przejdź do czystego obszaru połówki siatki i użyj pokrętła Z, aby ustawić ostrość powierzchni.
  19. Naciśnij przycisk Probe In, aby włożyć sondę, naciśnij MS na stage panel sterowania i użyj trackballa i pokrętła Z, aby ustawić mikrosample nad połówką siatki. Opuść sondę, aż mikropróbka zetknie się z siatką.
  20. Uchwyć obraz na FIB w powiększeniu 1,000x (zoom 2x). Użyj narzędzia do osadzania i narysuj wzór o wymiarach ~10 μm x 3 μm na dolnej stronie mikropróbki. Osadzaj wolfram wiązką 40 kV, 0,7 nA, wykorzystując czas przebywania 0,5 μs przez 3 minuty.
  21. Użyj narzędzia do napylania i narysuj mały wzór 1 μm x 3 μm na końcówce sondy. Wykonaj wzór za pomocą wiązki 40 kV, 0,7 nA przy czasie oczekiwania 3 ms, aby odciąć sondę od mikropróbki. Cofnij sondę, gdy jest wolna.
  22. Uchwyć obraz FIB w powiększeniu 5,000x i narysuj dwa wzory rozpylania 7 μm x 4 μm na górze i na dole mikropróbki, pozostawiając odstęp ~1 μm między pudełkami. Wyśrodkuj wzory tak, aby nie przeciąć lewej i prawej strony mikropróbki. Oba wzory należy wytworzyć za pomocą wiązki 40 kV, 4 nA i czasu przebywania 3 μs przez 2 minuty, ustawiając kierunek rastru w kierunku środka mikropróbki.
  23. Zrób kolejny obraz za pomocą wiązki obserwacyjnej FIB o powiększeniu 5,000x. Zmień rozmiar poprzednich skrzynek napylania na ~6,5 μm x 1 μm, zbliż się do siebie, aby pozostawić odstęp ~0,5 μm i wyprodukuj przy użyciu wiązki 40 kV, 0,7 nA.
  24. Przechyl boczny stopień wejściowy o 0,5° i zrób kolejny obraz FIB. Zmień rozmiar pudełek napylania na szerokość 6 μm. Umieść górny wzór na górnej stronie mikropróbki i wyprodukuj za pomocą wiązki 40 kV, 0,7 nA. Nachylić o -0,5° i powtórzyć z dolnym wzorem rozpylania i dolną stroną mikropróbki.
  25. Zmniejsz szerokość wzoru o ~0,5 μm. Przechyl o 0,5° i rozpyl górną część mikropróbki za pomocą wiązki 40 kV, 0,09 nA. Powtórz z dolną stroną pod kątem -0,5°.
  26. Przechyl stolik o 2,2° i uzyskaj obraz FIB z powiększeniem 10 000x. Zmień rozmiar wzorów rozpylania na szerokość 5 μm i zmień warunki wiązki na 5 kV, 0,03 nA. Umieść górny wzór na górnej stronie mikropróbki, aż do górnej krawędzi i wyprodukuj. Nachylenie -2,2° i powtórz z dolnym i dolnym wzorem.
  27. Powtarzaj etapy mielenia 5 kV, aż mikropróbka stanie się przezroczysta dla elektronów (grubość ~100 nm). Po zakończeniu zamknij zawory pistoletu i wyjmij boczny uchwyt wejściowy.

8. Uzyskiwanie wzoru dyfrakcyjnego wybranego obszaru na TEM

  1. Aby przygotować przyrząd do analizy, należy napełnić obie kolby Dewara ciekłym azotem i ustawić napięcie przyspieszające na 300 kV.
  2. Po przygotowaniu próbki za pomocą FIB wyjąć uchwyt z bocznym wejściem z FIB-SEM i wyregulować położenie sworznia w taki sposób, aby długość uchwytu odpowiadała długości uchwytu 300 kV TEM. Obróć końcówkę uchwytu do właściwej pozycji obserwacyjnej, ponownie porównując ją ze standardowym uchwytem TEM, aby zapewnić prawidłową orientację próbki.
    1. Alternatywnie należy wyjąć półkratkę z dołączonymi lamelami z uchwytu FIB-SEM i umieścić w standardowym uchwycie TEM.
  3. Załadować uchwyt próbki do komory wymiany TEM i opróżnić komorę. Upewnij się, że zawór pistoletu przyrządu jest zamknięty za każdym razem, gdy powietrze jest wpuszczane do komory wymiany. Gdy komora wymiany zostanie napompowana, rozlegnie się alarm dźwiękowy. Obróć uchwyt próbki zgodnie z ruchem wskazówek zegara i pozwól, aby próżnia wciągnęła uchwyt próbki do pierwszej pozycji zatrzymania.
  4. Poczekaj, aż podciśnienie w przyrządzie się przywróci, a następnie otwórz zawór pistoletu. Zresetuj ostrość i powiększ do powiększenia około 10 000X.
  5. Użyj pokręteł wyrównywania, aby przesunąć wiązkę do środka ekranu luminoforowego. Napnij i rozszerz belkę i upewnij się, że cały ruch belki jest koncentryczny. W razie potrzeby dostosuj do stygmatyzmu kondensatora.
  6. Obróć uchwyt próbki w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i pozwól, aby podciśnienie całkowicie wciągnęło uchwyt do kolumny. Użyj pokręteł ruchu stage, aby nawigować i lokalizować próbkę.
  7. Zwiększ powiększenie próbki i dostosuj wysokość Z, aż próbka będzie ostra. W razie potrzeby użyj okularów optycznych.
  8. Włóż kamerę i wyjmij ekran luminoforowy. W razie potrzeby rozszerz wiązkę, aby uniknąć przesycenia kamery. Dostosuj ostrość i parametry aparatu, a następnie rozpocznij akwizycję, aby uchwycić obraz.
  9. Aby uzyskać wzór dyfrakcyjny, najpierw wyśrodkuj interesujący Cię element. Zdejmij otwór obiektywu i włóż otwór dyfrakcyjny.
  10. Przejdź do trybu soczewki dyfrakcyjnej, naciskając przycisk DIFF na panelu sterowania i użyj pokrętła sterującego DIFF, aby zmniejszyć wiązkę.
  11. W razie potrzeby włóż zaślepkacz, aby środek wzoru dyfrakcyjnego nie spalił aparatu lub ekranu luminoforowego. Rozpocznij akwizycję z kamery, aby przechwycić obraz wzoru.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej znajdują się obserwacje procesu zwapnienia podczas metamorfozy tubeworma. Rycina 1 pokazuje, że wartości pH w okolicy kołnierza są wyższe niż w innych tkankach po metamorfozie. Rycina 2i przedstawia tubeworma z jednorodnym rozmieszczeniem Ca, co sugeruje, że nie rozpoczęły się żadne poważne zdarzenia zwapnienia; Rycina 2ii przedstawia tubeworma, który ulegał zwapnieniu przez dłuższy czas, co sugeruje, że zwapnienie wykroczyło poza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie optyczne na żywo jest przydatną metodą obserwacji zdarzeń komórkowych w organizmie wielokomórkowym. W tym przypadku wykorzystano wewnętrzne wskaźniki pH i jonów wapnia do pomiaru strumienia jonów w miejscach mineralizacji. W tych regionach wymagane jest aktywne pompowanie jonów w celu podniesienia pH i stężenia Ca2+, aby umożliwić zwapnienie 2,3. Podczas stosowania cząsteczek fluorescencyjnych do badania organizmu ważne jest, aby upewnić si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby bardzo podziękować Clemson Broadcast Productions, nagranie audio J. Brighta, narracja A. D. McQuiston, słodzenie dźwięku, K. Murphy, filmowanie G. Spake, grafika T. Messervy, montaż wideo T. Messervy i E. Rodgers. Pomoc techniczna i doradztwo naukowe zostały zainspirowane radami S. Kawady, S. Kubo, J. Hudsona, T. Darroudiego, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lama, M. B. Johnstone'a, C. Campanati, A. C. Lane'a i R. Dineshrama. Badanie to zostało sfinansowane z trzech grantów GRF z HKSAR-RGC (numery grantów: 705511P, 705112P i 17304914).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Heksametyldisilazan Mikroskopia elektronowa Nauki16700(EM)
Tetratlenek osmu 2% roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Nauki19192
IBMX 3-izobutylo-1-metyloksantynaThermoFisher ScientificPHZ1124
Nigerycyna, Wolny kwasThermoFisher ScientificN7143-5MG
Średnica 35 mm, rozmiar otworu 27 mm, Szkło nr 0, Bez powłokiThermoFisher ScientificD110400
5-(i-6)-karboksy-SNARF-1, ester acetoksymetylowy, octanThermoFisher ScientificC-1271
BDH Chlorek potasu, klasa ACSVWRBDH0258-500G
Odczynnik paraformaldehydowy
, krystaliczny		SigmaP6148
1 M Kwas solny do analizy wolumetrycznejWako Pure Chemical Industries, Ltd083-01095
0,05 M roztwór wodorotlenku sodu do analizy wolumetrycznejWako Pure Chemical Industries, Ltd199-02185
CalceinSigmaC0875
FASWIwaki Co. Ltd.Rei-sea Morskie
membrany estrowe z mieszanej celulozy; Średnica 47 mm, 0,45 &mikro; mADVANTECA045A047A
etanolWako Pure Chemical Industries, Ltd051-00476
Sztuczna woda morska dowedług SOP06 DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Chlorek soduWako Pure Chemical Industries, Ltd191-01665
Chlorek potasuWako Pure Chemical Industries, Ltd163-03545
Sześciowodny chlorek magnezuWako Pure Chemical Industries, Ltd135-00165
Chlorek wapniaWako Pure Chemical Industries, Ltd039-00475
Siarczan soduWako Pure Chemical Industries, Ltd197-03345
Kwas solnyWako Pure Chemical Industries, Ltd089-08415
2-amino-2-hydroksymetylo-1,3-propanodiol (tris)Wako Pure Chemical Industries, Ltd207-06275
2-aminopirydynaWako Pure Chemical Industries, Ltd011-02775
Miernik pH Orion 5-gwiazdkowy PlusThermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Kombinowana elektroda pH 8220BNWPThermo Scientific
Axiovision, wersja 4.6, Axio Obserwator Z1Zeiss
ImageJNIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500Hitachi
SU6600 VPSEMSystem Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM)Hitachi 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97(2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Calcium Carbonate CalcificationLive Optical MicroscopyElectron Microscopy TechniquesIntracellular pH ImagingScanning Electron MicroscopyEnergy Dispersive Xray SpectroscopyElectron Backscatter DiffractionTransmission Electron MicroscopyFocused Ion BeamMarine Tubeworm Larvae

Related Articles