Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (Δ_Ψm) do sekwestracji wapnia (Ca²⁺), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca²⁺ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca²⁺ i ΔΨ_m w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Oprócz ich zasadniczej roli w generowaniu ATP, mitochondria działają również jako lokalne wapnia (Ca²⁺) do ścisłej regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺. Aby to zrobić, mitochondria wykorzystują potencjał elektrochemiczny przez swoją błonę wewnętrzną (ΔΨ_m) do sekwestracji Ca²⁺. Napływ Ca²⁺ do mitochondriów stymuluje trzy dehydrogenazy ograniczające szybkość cyklu kwasu cytrynowego, zwiększając transfer elektronów przez kompleksy fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS). Stymulacja ta utrzymuje ΔΨ_m, który jest tymczasowo rozpraszany, gdy dodatnie jony wapnia przechodzą przez wewnętrzną błonę mitochondriów do macierzy mitochondrialnej.

Opisujemy tutaj metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca²⁺ i ΔΨ_m w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Poprzez przenikanie komórek, mitochondrialny Ca^{2 +} można zmierzyć za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika Ca^{2 +} Fluo-4, AM, z pomiarem ΔΨ_m przy użyciu barwnika fluorescencyjnego tetrametylorodaminy, estru metylowego, nadchloranu (TMRM). Zaletą tego systemu jest to, że nakładanie się widma między barwnikami fluorescencyjnymi jest bardzo niewielkie, co pozwala na dokładny pomiar mitochondriów Ca²⁺ i ΔΨ_m jednocześnie. Stosując sekwencyjne dodawanie podwielokrotności Ca²⁺, można monitorować wychwyt mitochondrialnego Ca^{2 +} i określić stężenie, przy którym Ca^{2 +} indukuje przejście przepuszczalności błony mitochondrialnej i utratę ΔΨ_m.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają ważną rolę w regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺, działając jako lokalne Ca²⁺¹. Ca²⁺ dostaje się do mitochondriów za pośrednictwem uniportera Ca²⁺, proces napędzany przez gradient elektrochemiczny, który występuje w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej (ΔΨ_m)². Po wejściu do macierzy mitochondrialnej Ca^{2 +} może aktywować fosforylację oksydacyjną poprzez stymulację trzech dehydrogenaz ograniczających szybkość cyklu kwasu cytrynowego³. Stymulacja ta utrzymuje ΔΨ_m, który jest tymczasowo rozpraszany, gdy dodatnie jony wapnia przechodzą przez wewnętrzną błonę mitochondriów do macierzy mitochondrialnej. Jeśli stężenie Ca²⁺ w mitochondriach stanie się bardzo wysokie, można zainicjować przejście przepuszczalności mitochondriów, co spowoduje rozproszenie ΔΨ_m, zaprzestanie fosforylacji oksydacyjnej i indukcję szlaków sygnalizacji śmierci komórki⁴.

Ważna rola, jaką mitochondria odgrywają w przestrzennym buforowaniu wapnia komórkowego, sprawia, że dokładne monitorowanie mitochondrialnego wapnia ma kluczowe znaczenie. Opracowano różne metody monitorowania mitochondrialnego wapnia, w tym stosowanie barwników na bazie rodaminy. Jeden z takich barwników, Rhod-2, AM, jest dość skuteczny w partycjonowaniu do mitochondriów w celu zmierzenia mitochondrialnych poziomów Ca^{2+ 5,6}. Należy jednak zachować ostrożność, ponieważ część barwnika gromadzi się w innych organellach, takich jak liposomy, lub pozostaje w cytozolu komórkowym. Niemniej jednak, dalsze analizy mogą być wykorzystane do odróżnienia tych sygnałów od tych z mitochondriów⁷.

Inna technika monitorowania mitochondrialnego wapnia wykorzystuje fluorescencyjne konstrukty reporterowe⁸. Zaletą tych genetycznie kodowanych sond jest to, że mogą być one specyficznie ukierunkowane na mitochondria przy użyciu endogennych N-końcowych peptydów, na przykład N-końcowego sygnału docelowego ludzkiej podjednostki COX VIII. System ten został wykorzystany do wygenerowania ukierunkowanej na mitochondria sondy aequorin, która okazała się niezwykle przydatna do badania mitochondrialnej sygnalizacji wapnia⁹. Główną wadą tych genetycznie kodowanych sond jest to, że muszą one zostać wprowadzone do komórek przez przejściową ekspresję (co nie jest wykonalne dla niektórych typów komórek i może dawać zmienne wyniki) lub poprzez tworzenie stabilnych systemów ekspresji (co jest czasochłonne).

Aby obejść powyższe problemy, opracowaliśmy nowy protokół do jednoczesnego pomiaru mitochondrialnych Ca²⁺ i ΔΨ_m. Protokół ten opiera się na wcześniej opisanej metodzie, która dodaje egzogenny wapń do komórek przepuszczalnych¹⁰. Nasz protokół ma trzy główne zalety w porównaniu z innymi metodami: po pierwsze, używamy Fluo-4, AM i TMRM do monitorowania mitochondriów Ca²⁺ i ΔΨ_m, dwóch barwników, które mają bardzo różne właściwości spektralne; po drugie, komórki są przepuszczalne, tak że sygnał Fluo-4 wykrywa tylko mitochondrialny Ca^{2 +}, a nie Ca^{2 +} zlokalizowany w innych organellach lub cytozolu komórki; i po trzecie, zastosowanie Fluo-4 do wykrywania mitochondrialnego Ca^{2 +} pozwala na szybkie i proste barwienie komórek, negując wszelkie problemy z transfekcją lub transformacją komórek, które występują przy użyciu sond kodowanych genetycznie.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Hodować komórki na 10 cm szalkach do hodowli komórkowych lub 75 cm² kolbach w pożywkach hodowlanych [10 ml Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) uzupełnione 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1x penicylina/streptomycyna (p/s)] w temperaturze 37 °C/5% CO₂.
2. Aby pobrać komórki, należy usunąć pożywkę przez aspirację, a następnie przemyć 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS). Usunąć 1x PBS przez aspirację, a następnie dodać 1,5 ml 0,25% (m/v) trypsyny/0,25% (w/v) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 2 min. Delikatnie postukać w naczynie lub kolbę, aby usunąć komórki, a następnie ponownie zawiesić w 5 ml pożywki hodowlanej.
3. Policz komórki, dodając 12 μl zawieszonych komórek do hemocytometru.
4. Komórki płytkowe w naczyniach lub komorowych szkiełkach nakrywkowych do obrazowania konfokalnego.
   UWAGA: Będą one miały odpowiednie plastikowe lub szklane dno, które zostało zaprojektowane do użytku z odwróconymi mikroskopami.
5. Płytki komórkowej tak, aby w dniu obrazowania osiągano ~80% zbieżności. Na przykład około 2 x 10⁴ 143B komórek kostniakomięsaka można umieścić w jednym dołku 8-dołkowego szkiełka na dzień przed obrazowaniem.
6. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO_{2 ,} aby umożliwić komórkom przyczepienie się i regenerację.

2. do obrazowania TMRM i Fluo-4

1. Przygotować roztwór zapisowy (RS) zawierający 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM_MgSO4, 1,25 mM KH₂PO₄, 10 mM D-glukozy, 2 mM CaCl₂ i 10 mM HEPES pH 7,35. Przechowywać RS w porcjach w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować pożywkę wewnątrzkomórkową (IM) zawierającą 6 mM NaCl, 130 mM KCl, 7,8 mM MgCl₂, 1 mM KH₂PO₄, 0,4 mM CaCl₂, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM jabłczan, 2 mM glutaminianu, 2 mM ADP i 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM roztwory podstawowe jabłczanu, glutaminianu i ADP można przygotować oddzielnie, i przechowywane w temperaturze -20 °C. Zapasy te można dodać do IM tuż przed użyciem.
3. Wolny od Ca²⁺ buforowany roztwór soli Hanka (HBSS) można uzyskać wstępnie przygotowany od dostawców komercyjnych. Dodać kwas bis(β-aminoetylowy) glikolu etylenowego-N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) do końcowego stężenia 500 μM.
4. Przygotować roztwór podstawowy 10 mM tetrametylorodaminy, estru metylowego, nadchloranu (TMRM) w 100% metanolu. Z tego wywaru zrobić zapas roboczy o wielkości 2 μM w destylowanym_H2O.
5. Przygotować roztwór podstawowy 10 mM werapamilu w 100% etanolu.
6. Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml (w/v) estru acetoksymetylowego fluo-4 (Fluo-4, AM) w dimetylosulfotlenku (DMSO).
   UWAGA: Fluo-4, AM jest wskaźnikiem wapnia, który wykazuje zwiększoną fluorescencję po związaniu Ca²⁺. Fluo-4 jest analogiem fluo-3, w którym dwa podstawniki chloru są zastąpione fluorami. Powoduje to zwiększone wzbudzenie fluorescencji przy 488 nm i wyższe poziomy sygnału fluorescencji. Grupa estrów AM powoduje powstanie nienaładowanej cząsteczki Fluo-4, która może przenikać przez błony komórkowe. Po wejściu do komórki ester AM jest rozszczepiany przez niespecyficzne esterazy, w wyniku czego powstaje naładowana forma Fluo-4, która jest uwięziona w komórce.
7. Przygotować roztwór podstawowy 1 mM cyjanku karbonylu p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) w 100% etanolu.
8. Przygotować roztwór podstawowy 25 mg/ml (w/v) digitoniny w destylowanym_H2O.
9. Przygotować roztwór podstawowy 100 μM thapsigargin w DMSO.
10. Przygotować roztwór podstawowy 40 mM chlorku wapnia (CaCl₂) w destylowanym_H2O.

3. Barwienie komórek za pomocą TMRM i Fluo-4, AM

1. Przygotuj roztwór barwiący RS z 20 nM TMRM, 5 μg/ml (w/v) Fluo-4, AM i 0,005% środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak Pluronic F-127 w RS.
   UWAGA: Ten środek powierzchniowo czynny jest niejonowym poliolem, który ułatwia solubilizację Fluo-4, AM. Uwaga: 10 μM Werapamilu można również dodać w celu zahamowania eksportu TMRM przez wielolekowy transporter błony komórkowej, jeśli ulega on ekspresji w analizowanym typie komórki.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek za pomocą pipety i przemyć 100 μl 1x PBS.
3. Usunąć 1x PBS za pomocą pipety i inkubować komórki w 250 μl roztworu barwiącego RS przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Gdy Fluo-4, AM dostanie się do komórki, ester AM jest rozszczepiany przez esterazy komórkowe. Inkubacja w temperaturze pokojowej hamuje aktywność esterazy, umożliwiając Fluo-4, AM wejście do mitochondriów.
4. Usunąć roztwór barwiący RS za pomocą pipety i umyć komórki w 100 μl Ca²⁺ wolnego od HBSS, aby usunąć nadmiar Fluo-4, AM i TMRM.
5. Przygotować roztwór do obrazowania domięśniowego z 25 μg/ml (w/v) digitoniny, 200 nM TMRM i 1 μM thapsigarginą w IM.
   UWAGA: Może być konieczne dostosowanie stężenia digitoniny, aby zapewnić, że nie dojdzie do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej. Można to określić empirycznie, oceniając intensywność sygnału TMRM przy różnych stężeniach digitoniny.
6. Usunąć pipetą HBSS wolny od Ca²⁺ i dodać 300 μl roztworu do obrazowania IM do komórek. Pozostaw komórki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej na 10 minut. Komórki są teraz gotowe do obrazowania z dodatkami CaCl₂.

4. Obrazowanie komórek

1. Umieścić naczynie lub szkiełko nakrywkowe z komórkami w roztworze do obrazowania IM na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.
2. Użyj ustawień na laserach mikroskopowych dla widm wzbudzenia i emisji TMRM i Fluo-4. Na przykład użyj linii laserowych He-Ne i argonu o długości fali 543 nm, aby wzbudzić odpowiednio TMRM i Fluo-4. Użyj niskiej mocy lasera wynoszącej około 5%, aby zminimalizować wszelkie fotouszkodzenia komórek.
3. Ustaw mikroskop tak, aby skanował obrazy co 25 sekund. Skanuj komórki przez 10 minut, aby ustalić odczyty linii bazowej dla sygnałów TMRM i Fluo-4.
   UWAGA: Sygnał Fluo-4 może być słaby lub niewykrywalny przy spoczynkowych stężeniach wapnia.
4. Dodać 3 μl 40 mM roztworu podstawowego CaCl₂ bezpośrednio do komórek w 300 μl roztworu do obrazowania IM (rozcieńczenie 1:100) i delikatnie wymieszać pipetą. W razie potrzeby wstrzymaj skanowanie obrazu podczas dodawania i mieszania CaCl₂.
   UWAGA: Końcowe stężenie wolnych jonów Ca²⁺ [Ca²⁺] w roztworze do obrazowania IM można obliczyć za pomocą oprogramowania takiego jak Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html) lub Chelator¹¹. Szczegółowy opis sposobu obliczania końcowego stężenia wolnych jonów Ca²⁺ [Ca²⁺] opisano w sekcji 6 poniżej.
5. Kontynuuj skanowanie obrazu przez około 4 minuty, a następnie powtarzaj dodawanie CaCl₂ co 4 minuty, aż do osiągnięcia pożądanych sygnałów TMRM lub Fluo-4, zwykle około 8 do 10 dodatków.
6. Za pomocą pipety dodać rozcieńczenie 1:100 1 mM FCCP (końcowe stężenie 10 μM) bezpośrednio do komórek, aby rozproszyć ΔΨ_m. Obrazuj komórki przez kolejne 5 minut. Eksperyment został już zakończony.

5. Analiza obrazu

1. Po zakończeniu obrazowania określ intensywność sygnałów Fluo-4 i TMRM za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, na przykład oprogramowania ImageJ z wtyczką Bio-Formats (pobierz http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/ "bioformats_package.jar" i zapisz go w folderze "C:\Program Files\ImageJ\plugins").
2. Otwórz plik obrazowania (na przykład plik .oif) w ImageJ. Kliknij narzędzie do zaznaczania i wybierz obszar zainteresowania (ROI), który zawiera mitochondria. Użyj początkowego sygnału TMRM, aby wybrać zwrot z inwestycji.
3. Otwórz "Analyze>Tools>ROI Manager", kliknij "Dodaj", aby dołączyć wybrany ROI do pomiaru intensywności. Na jednym obrazie można wybrać wiele ROI do pomiaru. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie ROI zostaną dodane do Menedżera ROI.
4. Kliknij "Więcej>Multi Measure", upewnij się, że wybrana jest opcja "Zmierz wszystkie plasterki" i że opcja "Jeden wiersz na plasterek" jest odznaczona, a następnie kliknij "OK", aby uzyskać tabelę średniej intensywności fluorescencji sygnałów TMRM i Fluo-4 dla każdego ROI w każdym punkcie czasowym.
5. Wykorzystaj dane ze wszystkich ROI, aby obliczyć średnią intensywność i odchylenie standardowe dla sygnałów TMRM i Fluo-4.

6. Obliczanie końcowego stężenia wolnych jonów Ca²⁺ [Ca²⁺]

1. Stężenie wolnych jonów^Ca2+ [Ca²⁺] w roztworze do obrazowania IM można określić za pomocą oprogramowania takiego jak Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html) lub Chelator¹¹. Na przykład ustaw zmienne w WEBMAXC EXTENDED w następujący sposób: Temperatura = 24 °C, pH = 7,1, Siła jonowa = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca²⁺ = 0,0004 M i Mg²⁺ = 0,0078 M. Daje to końcowe stężenie wolnych jonów Ca²⁺ [Ca²⁺] 62 nM. Należy pamiętać, że programy te nie mogą uwzględniać wszystkich zmiennych, takich jak czystość odczynnika, dokładność pomiarów i oznaczanie pH. Najdokładniejszą metodą oznaczania stężenia wolnego Ca²⁺ jest użycie skalibrowanej elektrody selektywnej Ca²⁺.

Wyniki

Użyliśmy tego protokołu do zbadania wpływu mutacji MT-ND5 na zdolność mitochondriów komórek 143B do buforowania wzrostu wapnia¹². W pokazanym tutaj przykładzie komórki kontrolne 143B załadowano TMRM i Fluo-4, AM przed przepuszczalnością digitoniny. Po 5 minutach obrazowania wykonano osiem sekwencyjnych dodatków rozcieńczenia 40 mM egzogennego CaCl₂ w stosunku 1:100, z obliczonym końcowym stężeniem wolnego jonu Ca²⁺ [Ca²⁺].<...

Dyskusja

Wapń odgrywa kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w skurczach mięśni, sygnalizacji neuronalnej i proliferacji komórek¹³. Wzrost stężenia wapnia w komórkach jest często związany z zapotrzebowaniem na energię, przy czym wapń jest w stanie bezpośrednio stymulować mitochondrialną fosforylację oksydacyjną w celu podniesienia generacji^{ATP 3}. Dlatego tak ważne jest, abyśmy mieli możliwość skutecznego monitorowania akumulacji wapnia w mitochondriach i mogli porównać, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher	10566016
płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicylina/streptomycyna (p/s)	ThermoFisher	15140122
0,25% trypsyna/0,25% EDTA	ThermoFisher
Szkiełko nakrywkowe 8-dołkowe	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
jabłczan	Sigma-Aldrich	M1000
glutaminian	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ wolny Hank' s buforowany roztwór soli (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetrametylodamina, ester metylowy, nadchloran (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Ester acetoksymetylowy Fluo-4 (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimetylosulfotlenek (DMSO)	ThermoFisher	D12345
cyjanek karbonylu p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonina	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemytometr	VWR	631-0925
10 cm szalki do hodowli komórkowych	Corning	COR430167
75 cm2 kolby do hodowli komórkowych	Corning	COR430641