Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Preparaty pionowe są dobrze znane do badania obwodów i transmisji sygnałów w siatkówce dorosłego ssaka. Płaszczyzna przekroju w tych preparatach jest prostopadła do powierzchni siatkówki, dzięki czemu idealnie nadaje się do badania neuronów zorientowanych promieniowo, takich jak fotoreceptory i komórki dwubiegunowe. Jednak duże dendrytyczne altany komórek poziomych, szerokokątnych komórek amakrynowych i komórek zwojowych są w większości obcięte, pozostawiając znacznie zmniejszoną aktywność synaptyczną w tych komórkach. Podczas gdy komórki zwojowe i przemieszczone komórki amakrynowe można badać w całościowym preparowaniu siatkówki, komórki poziome i komórki amakrynowe znajdujące się w wewnętrznej warstwie jądrowej są słabo dostępne dla elektrod w całej tkance siatkówki.
Aby osiągnąć maksymalną dostępność i integralność synaptyczną, opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki myszy i badaliśmy transmisję sygnału w synapsie między fotoreceptorami a komórkami poziomymi. Podział poziomy pozwala (1) na łatwą i jednoznaczną identyfikację wizualną poziomych ciał komórek w celu namierzenia elektrod oraz (2) zachowanie rozszerzonych horyzontalnych pól dendrytycznych komórek, jako warunek wstępny dla nienaruszonego i funkcjonalnego wejścia synaptycznego stożka do poziomych dendrytów komórkowych.
Poziome komórki z poziomych warstw wykazywały toniczną aktywność synaptyczną w ciemności, a na krótkie błyski światła reagowały zmniejszeniem prądu wewnętrznego i zmniejszoną aktywnością synaptyczną. Dowody immunocytochemiczne wskazują, że prawie wszystkie czopki w polu dendrytycznym komórki poziomej tworzą synapsy z jej dendrytami obwodowymi. Preparat warstwowy doskonale nadaje się zatem do badania właściwości fizjologicznych poziomo wydłużonych neuronów siatkówki, a także transmisji sygnałów sensorycznych i integracji między wybranymi synapsami.
Wprowadzenie
Informacje wizualne są kodowane jako dynamiczny czasoprzestrzenny wzorzec aktywacji fotoreceptorów, a synapsa wstęgowa między fotoreceptorami a neuronami drugiego rzędu decyduje o dalszym przekazywaniu informacji wizualnej. Pionowe przygotowanie warstwy siatkówki ssaków jest bardzo cennym narzędziem do badania przetwarzania sygnałów w szlakach pionowych, tj. między fotoreceptorami a komórkami dwubiegunowymi oraz między komórkami dwubiegunowymi a niektórymi typami komórek amakrynowych1,2,3,4.
Jednak pionowe cięcie zawsze powoduje poważne obcięcie pól dendrytycznych wielu neuronów siatkówkowych, prowadząc do znacznej utraty kontaktów synaptycznych. Szczególnie w zewnętrznej siatkówce, komórki poziome są dotknięte ze względu na ich bocznie rozciągnięte pola dendrytyczne i systemy końcowe aksonów5. W pionowym przygotowaniu plasterków wejście synaptyczne setek końcówek fotoreceptorów stożków do dendrytów komórki poziomej jest w ten sposób zredukowane do kilku rzadkich kontaktów. To może wystarczyć do zbadania właściwości poszczególnych synaps, ale w żadnym wypadku nie reprezentuje możliwości przetwarzania sygnału leżących u podstaw zsynchronizowanej aktywacji synaps wstęgowych fotoreceptorów.
Dlatego opracowaliśmy preparat do poziomego warstwowania, który pozostawia prawie wszystkie wejścia synaptyczne fotoreceptora stożka do dendrytów komórek poziomych nienaruszone i funkcjonalne. Płaszczyzna przekroju przebiega równolegle do powierzchni siatkówki, idealnie przecinając wewnętrzną warstwę jądrową między komórkami poziomymi a komórkami amakrynowymi. W ten sposób powstają poziome wycinki siatkówki zewnętrznej zawierające w miejscu presynaptycznym fotoreceptory z segmentami wewnętrznymi i zewnętrznymi oraz zakończeniami synaptycznymi oraz komórki poziome i komórki dwubiegunowe w miejscu postsynaptycznym. Preparat ten doskonale nadaje się do badania skoordynowanych wejść synaptycznych do poziomych dendrytów komórkowych przez wszystkie fotoreceptory czopków w ich polu dendrytycznym. W związku z tym może okazać się przydatne do lepszego zrozumienia działania synapsy wstęgowej fotoreceptora, która ma kluczowe znaczenie dla transferu informacji wizualnych z macierzy aktywacji fotoreceptorów do odpowiedzi postsynaptycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach wydanymi przez Republikę Federalną Niemiec.
UWAGA: Ponieważ tkanka siatkówki będzie pozbawiona tlenu podczas dłuższych części tej procedury, wszystkie kroki powinny być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Myszy powinny być przystosowane do ciemności co najmniej 3 godziny przed preparacją. Aby uniknąć adaptacji siatkówki do światła, przygotowanie i krojenie należy przeprowadzać w słabym czerwonym świetle.
1. Przygotowanie pożywek i innych chemikaliów
- Przygotuj klasę Medium6. Po rozwarstwieniu należy przez cały czas zanurzać tkankę siatkówki w pożywce Amesa.
- Rozpuścić 2,2 g pożywki Amesa i 298 mg HEPES w 250 ml wody destylowanej. Stężenie HEPES wyniesie 5 mM. Mieszaj delikatnie, aż wszystkie cząstki się rozpuszczą.
- Pęcherzyk Podłoże Amesa w temperaturze pokojowej z karbogenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 5 minut. Dostarczyć karbogen szklaną pipetą Pasteura do roztworu. Podłącz pipetę Pasteura za pomocą odpowiedniego przewodu do wylotu reduktora gazu.
- Do roztworu dodać 475 mg wodorowęglanu sodu. Dodanie wodorowęglanu po bulgotaniu zapobiega wytrącaniu się węglanu wapnia.
- Przygotuj agarozę o niskiej temperaturze żelowania. Agaroza jest niezbędna do osadzania tkanki siatkówki podczas cięcia wibratomem.
- Rozpuścić 180 mg agarozy w 9 ml pożywki Amesa i 1 ml wody destylowanej. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby powoli podgrzać roztwór agarozy, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. Podgrzewaj w odstępach co 5 - 10 sekund, aby uniknąć przelania. Rozwiązanie powinno być jasne i przejrzyste.
- Rozpuszczoną agarozę przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na czas trwania zabiegu.
2. Konfiguracja Vibratome
UWAGA: Wszystkie przekroje zostały przeprowadzone za pomocą wibratomu wymienionego w Tabeli Materiałów. Podane ustawienia odnoszą się tylko do tego typu wibratomu. Więcej informacji na temat wibratomu w sekcji tkanki nerwowej można znaleźć w odnośniku7.
- Umieść ostrze wtryskiwacza wibratomu w uchwycie ostrza.
- Zmierz odchylenie pionowe ostrza za pomocą urządzenia "vibrocheck". Użyj regulacyjnej na uchwycie ostrza, aby przechylić ostrze, aż będzie równoległe do płaszczyzny cięcia. Dokładne ustawienie ostrza jest konieczne, aby zapobiec efektom żaluzji weneckich na powierzchni przekroju i wytworzyć płaski przekrój, który zawiera żywe komórki na swojej powierzchni.
- Ustaw wibratom na następujące ustawienia: amplituda, 1.00; prędkość, 0.20; grubość, 180 - 200 μm.
3. Sekcja siatkówki myszy
- Dorosłą mysz C57BL/6 należy znieczulić poprzez odparowanie około 1 ml izofluranu w hermetycznym pojemniku. Po zakończeniu znieczulenia należy poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Mysz nie powinna być starsza niż 3 miesiące, w przeciwnym razie jakość plastrów ulegnie pogorszeniu.
- Usuń gałkę oczną, umieszczając zakrzywione kleszcze pod okiem. Delikatne uniesienie gałki ocznej odsłoni nerw wzrokowy. Przeciąć nerw wzrokowy nożyczkami sprężynowymi i przenieść gałkę oczną na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml pożywki Amesa.
- Wykonaj wszystkie kolejne kroki na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Dostosuj powiększenie do wartości, która umożliwia optymalną kontrolę wzrokową następujących procedur (kroki 3.4 - 3.9).
- Nakłuć rogówkę w miejscu przejścia do twardówki za pomocą spiczastych kleszczy lub igły 20 G. Podczas tego kroku ustabilizuj gałkę oczną za pomocą innych kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić siatkówki za pomocą urządzenia do nakłuwania.
- Włóż nożyczki sprężynowe do małego otworu wykonanego w kroku 3.3 i wytnij okrąg wokół rogówki. Ponownie ustabilizuj gałkę oczną kleszczami podczas cięcia. Nacięcie należy trzymać bardzo blisko powierzchni, aby nie wciąć się w siatkówkę.
- Ostrożnie usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy. Ciało szkliste składa się tylko z cienkiej przezroczystej warstwy w tylnej części oka. Jednak do sekcji wibratomu ważne jest, aby ciało szkliste zostało całkowicie usunięte.
- Na szalce Petriego umieść muszlę oczną w taki sposób, aby patrzyło się przez otwór w dół na siatkówkę. Brzeg otworu powinien składać się wyłącznie z tkanki twardówki. Jeśli okrągłe cięcie (krok 3.4) zostało wykonane zbyt blisko równika muszli ocznej, tkanka siatkówki będzie również obecna w pobliżu nacięcia. Uważaj więc, aby nie uszkodzić siatkówki w kroku 3.8.
- Chwyć twardówkę kleszczami i ostrożnie rozerwij tkankę. Ważne jest, aby na tym etapie nie pęknąć siatkówki. W razie potrzeby odłącz siatkówkę od ora serrata, stabilizując twardówkową część tkanki kleszczami i ostrożnie odklejając siatkówkę innymi kleszkami. Trzymaj kleszcze zamknięte; Nigdy nie dotykaj siatkówki kleszczami, ponieważ tkanka jest bardzo miękka i natychmiast ustąpi.
UWAGA: Na tym etapie siatkówka i reszta muszli ocznej zostaną połączone tylko na głowie nerwu wzrokowego. - Wytnij miejsce mocowania na głowie nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek sprężynowych. Siatkówka powinna teraz swobodnie unosić się w powietrzu jako pojedynczy fragment tkanki w pożywce Amesa.
- Pokrój siatkówkę na 4 - 6 małych prostokątów o długości około 23 mm za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela, przytrzymując siatkówkę wzdłuż krawędzi kleszczykami, aby manipulować nią na miejscu. Unikaj szczypania tkanki siatkówki w prostokątach. Weź fragmenty z centralnych części siatkówki, a nie z dalekich obrzeży.
- Przenieść kawałki siatkówki za pomocą plastikowej pipety Pasteura o dużej średnicy na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm, której spód został zastąpiony siatką o rozmiarze siatki mniejszym niż 1 mm. Zamocować szalkę Petriego w górnej jednej trzeciej zlewki lub kolby stożkowej i zanurzyć kawałki siatkówki w pożywce Amesa z pęcherzykami karbogenu.
4. Osadzanie kawałków siatkówki w agarozie
- Ostrożnie przenieś 2-3 kawałki siatkówki na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm razem z odrobiną pożywki Amesa. Do przenoszenia najwygodniej jest używać plastikowej pipety Pasteura o dużej średnicy. Na tym etapie dokładna orientacja części siatkówki nie ma znaczenia.
- Usuń jak najwięcej pozostałej pożywki Amesa za pomocą szklanej pipety Pasteura. Jak tylko płyn zostanie usunięty, przejdź do kroku 4.3. Nie dopuścić do wyschnięcia tkanki siatkówki.
- Natychmiast przykryj kawałki siatkówki 2 ml rozpuszczonej agarozy (37 °C). Biorąc pod uwagę rozmiar wymieniony w kroku 3.10, kawałki nie zwiną się w agarozie.
- W płynnej agarozie delikatnie wepchnij kawałki siatkówki na dno szalki Petriego. Warstwa komórek zwojowych powinna być skierowana w dół. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić dokładną pozycję. Do pozycjonowania należy obchodzić się z kawałkami siatkówki za pomocą małej szpatułki. Ustaw siatkówkę tak szybko i precyzyjnie, jak to możliwe, ponieważ agaroza szybko się zestala.
- Ułóż kawałki siatkówki równolegle do dna szklanego naczynia, w przeciwnym razie sekcje będą styczne lub ukośne. Poszczególne elementy nie powinny się ze sobą stykać, ale też nie powinny być zbyt daleko od siebie. Staraj się umieszczać kawałki siatkówki mniej więcej na tym samym poziomie poziomym.
- Szklaną szalkę Petriego z zatopionymi kawałkami siatkówki włożyć do lodówki (4 - 6 °C) na co najmniej 2 minuty. To szybko utwardzi agarozę do dalszego przetwarzania. Jak tylko agaroza spolimeryzuje się, przejdź do następnego kroku.
5. Montaż części siatkówki
- Ostrożnie usuń blok agarozy zawierający kawałki siatkówki z szalki Petriego. Użyj szpatułki lub podobnego urządzenia, aby podnieść blok agarozy ze szkła. Ze względu na siły adhezyjne może się to okazać dość trudne. Unikaj jednak rozbijania bloku agarozy. Wykonaj ten i wszystkie kolejne kroki w temperaturze pokojowej.
- Umieść blok agarozy na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj jego rozmiar za pomocą ostrza skalpela. Pozostaw 1 - 2 mm agarozy z każdej strony kawałków siatkówki. Ostateczny rozmiar bloku powinien wynosić około 1 066 mm (10 mm odnosi się do wysokości bloku, 6 mm do długości jego krawędzi).
- Przyklej blok agarozy do uchwytu próbki wibratomu za pomocą kleju błyskawicznego. Części siatkówki powinny znajdować się w górnej części bloku o wysokości 10 mm i być zorientowane równolegle do jego powierzchni, podczas gdy spód jest przymocowany do uchwytu.
- Natychmiast przykryj blok, wlewając wcześniej bąbelkowaną pożywkę Amesa do tacki buforowej wibratomu.
6. Przygotowanie poziomych sekcji wibratomu
- Rozpocznij dzielenie na sekcje. Na początku należy ręcznie ustawić grubość krojenia, aż w plastrze pojawią się fragmenty tkanki siatkówki. Następnie przejdź do ustawień w kroku 2.3. Ponieważ siatkówka myszy ma tylko około 200 μm grubości, na blok agarozy nie będzie więcej niż 2-3 plasterki.
- Wyjąć skrawki z tacki buforowej za pomocą szklanej pałeczki i przenieść je do 2 ml pożywki Amesa na szalce Petriego o średnicy 35 mm.
- Skrawki należy natychmiast przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C (5% CO2 / 55% O2 ). Agaroza otaczająca skrawki pozostanie stała w inkubatorze i może być używana do przenoszenia skrawków bez uszkadzania siatkówki. Lepszą jakość plastrów uzyskuje się przy przechowywaniu w temperaturze 37 °C w danej atmosferze w porównaniu z natlenionym podłożem Amesa w temperaturze pokojowej. Sekcje można zużyć natychmiast lub można je przechowywać do 4 godzin w inkubatorze z dobrymi wynikami fizjologicznymi.
- Zanurz kolejne kawałki siatkówki w agarozie i powtórz sekcje 4 - 6.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poziomych skrawkach siatkówki myszy ciała komórek poziomych można było łatwo zidentyfikować na podstawie ich charakterystycznej morfologii, z kilkoma dendrytami pierwotnymi wychodzącymi z wielobocznego ciała komórki (Rycina 1A). Ciała komórek poziomych znajdujące się blisko powierzchni skrawka były rutynowo dostępne dla elektrod do techniki patch-clamp. Podczas rejestracji komórki wypełniano barwnikiem fluorescencyjnym, co ujawniło ich złożone arboryzacje dendrytyczne, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przeciwieństwie do pionowych warstw, morfologia dendrytyczna neuronów zorientowanych promieniowo, takich jak komórki poziome i komórki amakrynowe, jest dobrze zachowana. W porównaniu z preparatami całej siatkówki, te typy komórek są łatwo dostępne dla mikroelektrod i mogą być badane zarówno za pomocą technik elektrofizjologicznych, jak i obrazowania. Tutaj skupiliśmy się na zewnętrznej siatkówce; Jednak podobne podejście zostało zgłoszone szczególnie w przypadku komórek amakrynowych wewnętrznej siatkówki
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 i FE464/11-1 do A.F. Autorzy pragną podziękować Andrei Nerzowi za doskonałą pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agaroza | Sigma | A9045 | |
| 35 mm szalka Petriego (plastikowa) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri naczynie | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Ambulatorium | Isoflurane | ||
| Ostrze wtryskiwacza Vibratome | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Mikrofalowa | |||
| łaźnia wodna | |||
| Kleszcze | |||
| 20 G Igły | |||
| Nożyczki | |||
| Zakrzywione ostrza skalpela | |||
| Mikroskop stereoskopowy | |||
| Plastikowa pipeta | |||
| Szklana pipeta | Pasteura |
Bibliografia
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , Plenum Press. New York. (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108(2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
