Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywych komórek jest używane do jednoczesnego przechwytywania obrazów poklatkowych receptorów angiotensyny typu 1a (AT1aR) i wewnątrzkomórkowych przedziałów w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerki-293 (HEK) po stymulacji angiotensyną II (Ang II). Komórki HEK są przejściowo transfekowane plazmidowym DNA zawierającym AT1aR znakowane wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP). Lizosomy identyfikuje się za pomocą czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Obrazy żywych komórek są rejestrowane na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym po stymulacji Ang II i analizowane przez oprogramowanie w trzech wymiarach (3D, woksele) w czasie. Obrazowanie żywych komórek umożliwia prowadzenie badań nad transportem receptorów i pozwala uniknąć zakłóceń związanych z fiksacją, a w szczególności utraty lub artefaktowego przemieszczenia receptorów błonowych znakowanych EGFP. W ten sposób, gdy poszczególne komórki są śledzone w czasie, można obrazować i mierzyć subkomórkową lokalizację receptorów. Obrazy muszą być uzyskiwane wystarczająco szybko, aby uchwycić szybki ruch pęcherzyków. Jednak przy większych prędkościach obrazowania liczba zbieranych fotonów jest zmniejszona. Należy również pójść na kompromis w doborze parametrów obrazowania, takich jak rozmiar woksela, aby zwiększyć szybkość obrazowania. Znaczące zastosowania obrazowania żywych komórek to między innymi badanie transportu białek, migracji, proliferacji, cyklu komórkowego, apoptozy, autofagii oraz interakcji i dynamiki białko-białko.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem jest uzyskanie ilościowych dowodów w czasie i przestrzeni kolokalizacji receptora z określonymi organellami subkomórkowymi po leczeniu agonistą receptora. W związku z tym bezpośrednim celem jest uchwycenie poklatkowych obrazów konfokalnych lizosomów i transbłonowego receptora obejmującego całą błonę w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK) po transfekcji, a następnie zebranie i przeanalizowanie danych obrazowania w 3D w celu ilościowego pomiaru dostarczania receptora do lizosomów. Badanie jednoczesnego transportu receptora transbłonowego z lizosomami lub innymi organellami podczas endocytozy, gdy jest aktywowany przez ligand receptora, może pomóc w ustaleniu, w jaki sposób receptor transbłonowy jest regulowany w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

AT1aR przypuszcza się, że ulega degradacji w lizosomach po leczeniu Ang II w modelowych systemach komórkowych, głównie HEK293 1, chociaż większość receptorów jest przede wszystkim zlokalizowana w endosomach recyklingu wielopęcherzykowego w celu późniejszego recyklingu do błony plazmatycznej, podczas gdy większość liganda, Ang II, jest degradowana w lizosomie 2,3, 4,5. Niedawno Li i in. wykazali, używając technik rezonansowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET) i mikroskopii obrazowania fluorescencji czasu życia (FLIM), że AT1aR kolokalizuje się (w skali ~10 nm) z LAMP1, lizosomalnym białkiem błonowym, co sugeruje, że przynajmniej część receptora jest ukierunkowana i degradowana przez lizosomy 6. Autorzy ci zauważyli, że inhibitor lizosomalny chlorochina blokował asocjację AT1aR-LAMP1, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że efektem chlorochiny jest blokowanie fuzji późnych endosomów lub autofagosomów z lizosomami. Inne pośrednie podejścia do określania lokalizacji AT1aR w lizosomach wykorzystywały bafilomycynę, inhibitor lizosomów do wnioskowania o obecności AT1aR w lizosomach 3,4,5,6,7,8.

Obrazowanie żywych komórek pozwala uniknąć potencjalnego wpływu fiksacji na objętość komórki oraz utraty/ściemnienia/redystrybucji receptora chimerycznego GFP. Poprzednie badania opierały się na stałych komórkach w celu określenia kolokalizacji lub współwystępowania receptora z lizosomami lub przy użyciu żywych komórek znakowanych surogatami wiążącymi receptor, takimi jak β-arrestin 1,2,3,4,5,6. Obrazowanie żywych komórek innych GPCR za pomocą konfokalnych mikroskopów konfokalnych z wirującym dyskiem lub laserowym skaningiem punktowym wyposażonych w detektory GaASP lub HyD umożliwiło badaczom obserwację internalizacji i transportu receptorów w pojedynczych komórkach obrazowanych w stosach z w odstępach 30 s 9,10. Jednak nawet wtedy, gdy stosy z żywych komórek są szybko zbierane, analiza może nastąpić tylko po wybraniu pojedynczej płaszczyzny w każdym stosie, tj. w 2D 10. Chociaż może to być wystarczające do badania zinternalizowanego GPCR lub receptora kinazy tyrozynowej, o którym mowa, AT1aRs gromadzi się w pęcherzykach, które zmieniają rozmiar i położenie w czasie, a zatem są z natury trudniejsze do odpowiedniego pobrania próbki przy użyciu reprezentatywnego pojedynczego wycinka w każdym punkcie czasowym. Aby dokładnie określić drogę znakowanego AT1aR przez komórkę i wykryć każdą subpopulację pęcherzyków różniących się wielkością i położeniem, opracowaliśmy metodę obrazowania 3D i analizy 3D w celu śledzenia tych zmian i do stosowania w połączeniu z znakowaniem różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, takich jak lizosomy.

Badacze mogą korzystać z tego protokołu do obrazowania żywych komórek, aby bezpośrednio wizualizować ruch AT1aR do komórki i jego transfer do subkomórkowych przedziałów po stymulacji Ang II. Przedziały subkomórkowe są oznaczone fluorescencyjnymi chimerami białkowymi lub innymi markerami fluorescencyjnymi. Protokół ten może być również stosowany jako pierwsze podejście do lokalizacji receptorów w organellach subkomórkowych z minimalną rozdzielczością 200 nm w celu porównania receptorów zmutowanych i dzikich lub wykrycia zmian po leczeniu farmakologicznym. Technika ta jest dostępna, ponieważ można ją przeprowadzić na dowolnym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obrazowanie żywych komórek. Względna łatwość tego podejścia kontrastuje ze zwiększoną wiedzą specjalistyczną i sprzętem potrzebnym do przeprowadzania technik FRET/FLIM/BRET, które wykrywają interakcje molekularne 6,11. Pomiary te definiują interakcje białko-białko w wysokiej rozdzielczości (~10 nm) i można wywnioskować lokalizację w organellach subkomórkowych. Te bardziej zaawansowane techniki są wykorzystywane do śledzenia i dalszego definiowania interesujących interakcji molekularnych, a nie przechodzenia receptorów przez przedziały subkomórkowe, i bezpośrednio pokazują interakcje białko-białko w określonym czasie i miejscu w komórce 11. FLIM, technika FRET niezależna od stężenia akceptora, jest najczęściej wykonywana na stałych próbkach, ponieważ akwizycja obrazu jest wolniejsza. W przeciwieństwie do tego, stosunek FRET zapewnia szybkie obrazowanie i kolokalizację oddziałujących białek w wysokiej rozdzielczości. Wadą ratio FRET jest to, że obrazowanie wykorzystuje epi-fluorescencję szerokokątnego, aby zwiększyć szybkość obrazowania i objąć całą komórkę, co skutkuje zmniejszoną rozdzielczością i kontrastem organelli 12. Transfer energii rezonansu bioluminescencyjnego (BRET) to kolejna zaawansowana technika, która została zastosowana do GPCR do pomiaru nabycia bliskości molekularnej w czasie 11. W tej technice białko fluorofor jest dzielone molekularnie, a każda połowa jest połączona z jednym z dwóch badanych białek. Kiedy dwa interesujące białka wiążą się ze sobą, części znacznika chimerycznego łączą się ponownie, aby uzyskać fluorescencję i zwiększoną fluorescencję określoną ilościowo w czasie.

Tutaj prezentujemy prostą technikę obrazowania żywych komórek w połączeniu z kwantyfikacją obrazu do badania transportu AT1aR w komórce po stymulacji Ang II oraz potencjalnej zmiany w dostarczaniu zinternalizowanego AT1aR do lizosomów po stymulacji Ang II. Ostatecznym zastosowaniem tej techniki jest scharakteryzowanie różnic w transporcie błonowym, porównując receptory typu dzikiego i zmutowanego. Różnice te pomogą zidentyfikować mechanizm (mechanizmy), które wpływają na fizjologiczne działanie AT1aR, prowadząc do regulacji ciśnienia krwi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzień pierwszy

1. Sadzenie komórek

  1. Przygotuj kompletne zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml L-glutaminy do 450 ml DMEM, aby uzyskać 500 ml kompletnego DMEM uzupełnionego płodową surowicą bydlęcą (10%), penicyliną/streptomycyną (1%) i L-glutaminą (1%).
  2. Wysiewaj ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK), numer pasażu 6-11 przy 50 000 / dołku w systemie szkła nakrywkowego z 8 dołkami w kompletnym DMEM.
  3. Utrzymywać szkiełko w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 przez 24 godziny.

Dzień drugi

2. Transfekcja liposomów

  1. Świeżo przygotować roztwory plazmidu i liposomów AT1aR-GFP w sterylnych warunkach w komorze o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
  2. Rozcieńczyć 2 μl plazmidowego DNA w roztworze podstawowym o stężeniu 900 ng/μl w 178 μl zredukowanej pożywki surowicy, aby uzyskać stężenie plazmidowego DNA około 10 ng/μl.
  3. Rozcieńczyć 4,5 μl roztworu podstawowego liposomu w 175,5 μl zredukowanej pożywki surowicy, aby uzyskać rozcieńczenie podstawowego w stosunku 1:40.
  4. Dodaj roztwór liposomu do roztworu plazmidu i wymieszaj za pomocą pipetora o pojemności 1 ml do pipetowania w górę iw dół 20 razy, aby wymieszać roztwór do transfekcji.
  5. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej (25–27 °C).
  6. Podczas inkubacji mieszaniny należy powoli usunąć pożywkę za pomocą pipetora o pojemności 1 ml i powoli dodać 400 μl 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), która jest wstępnie ogrzana do temperatury 37 °C.
  7. Delikatnie usunąć PBS i zastąpić 200 μl/studzienkę zredukowanej pożywki surowicy wstępnie podgrzanej do 37 °C.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność na wszystkich etapach mycia komórek, aby uniknąć oderwania się komórek od szkiełka nakrywkowego z powodu naprężeń wywołanych pipetowaniem.
  8. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 przez 30 minut.
  9. Po zakończeniu okresu inkubacji dodać 80 μl mieszanki transfekcyjnej do każdego dołka i inkubować komórki przez 4,0–4,5 godziny, ale nie dłużej niż 5 godzin w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 .
  10. Po zakończeniu okresu inkubacji transfekcji powoli usunąć pożywkę z komór za pomocą pipetora o pojemności 1 ml i delikatnie zastąpić 300 μl/studzienkę kompletnego DMEM i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 .

Dzień trzeci

3. Głód surowicy

  1. Delikatnie usuń pożywkę za pomocą pipetora o pojemności 1 ml i powoli zastąp 300 μl DMEM bez surowicy bez czerwieni fenolowej.
  2. Utrzymuj komorę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 przez 10-12 godzin.

Dzień czwarty

4. Obrazowanie żywych komórek

  1. Zabarwić przedziały wewnątrzkomórkowe (w tym przypadku lizosomy).
    1. Około 30 minut przed obrazowaniem lizosomów w komórkach dodaj 22,5 μl z 1 μM roztworu podstawowego barwnika fluorescencyjnego (0,5 μl 1 mM barwnika fluorescencyjnego rozcieńczonego w 499,5 μl DMEM bez surowicy bez czerwieni fenolowej) do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 75 nM.
    2. Inkubować przez 25-30 minut w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 , a następnie delikatnie usunąć barwnik i powoli dodać 300 μl świeżego DMEM bez surowicy bez czerwieni fenolowej.
  2. Przygotuj mikroskop do obrazowania.
    1. Ustaw stolik w dół, aby uniknąć uszkodzenia soczewki podczas uruchamiania mikroskopu automatycznego.
    2. Włącz moc mikroskopu, moc skanera, moc lasera, a następnie emisję lasera, a na końcu lampę metalohalogenkową do obserwacji wizualnej (patrz instrukcje producenta mikroskopu konfokalnego).
    3. Otwórz program do obrazowania i w oprogramowaniu włącz laser argonowy (488 nm) i moc do 30-50%. Należy pamiętać, że moc zależy od wieku lasera. W eksperymentach kluczowe jest zachowanie stałych ustawień.
    4. Włącz laser emitujący czerwień (np. 568 nm lub 594 nm).
    5. Ustaw format obrazowania na 12-bitową głębię.
    6. Ustaw otwór dla linii lasera argonowego 488 nm i dla lasera 568 nm lub 594 nm na 1 jednostkę dyskową Airy. Jeśli GFP jest bardzo słaby, użyj ustawienia 2 jednostek dyskowych Airy, ale odpowiednio dopasuj kanały.
    7. W przypadku korzystania z zestawów filtrów dichroicznych należy wybrać odpowiednie długości fal emisji dla GFP i barwnika fluorescencyjnego. Lub ustaw długość fali emisji (Em) na 499-580 nm dla GFP i Em 599 - 680 nm dla barwnika fluorescencyjnego emitującego czerwień.
    8. Sprawdź, czy nie dochodzi do przesprzedaży i skrzyżowania. Wyłącz każdy laser po kolei i sprawdź oba kanały emisji dla każdego z nich. Gdy laser argonowy jest wyłączony, zielona emisja powinna wynosić zero. Gdy zielony laser emitujący jest wyłączony, czerwony kanał emisji powinien wynosić zero.
      UWAGA: Najbezpieczniejszą metodą jest zobrazowanie każdej z nich w osobnych ścieżkach (sekwencyjnie).
    9. W razie potrzeby dołącz kanał jasnego pola. Należy unikać różnicowego obrazowania z kontrastem (DIC), ponieważ może ono zniekształcić pomiary kolokalizacji.
    10. W przypadku obrazowania na żywo wybierz sekwencję linii, a nie sekwencję klatek.
  3. Wybierz komórki do obrazowania.
    1. Do obrazowania komórek należy użyć obiektywu z aperturą numeryczną 1,4 (NA), takiego jak obiektyw olejowy 63X/1,4 NA). Wyśrodkuj obiektyw i dodaj na niego kroplę olejku immersyjnego o wysokiej lepkości i niskiej autofluorescencji.
    2. Przenieść komorę z transfekowanymi komórkami z inkubatora do stolika mikroskopu. Uważaj, aby szkiełka były płaskie i upewnij się, że komora jest dobrze osadzona i zabezpieczona przed ruchem.
    3. Przesuń obiektyw w górę, aż kropla oleju dotknie dolnej części zamka; prawa płaszczyzna ogniskowej znajduje się blisko tej pozycji. W mikroskopach automatycznych należy zapisać tę pozycję, jak również pozycję obniżoną, aby użyć jej do końca eksperymentu obrazowania, aby ułatwić zmianę próbek.
    4. Wybierz przyciemnione komórki. Komórki z nadekspresją AT1aR-GFP będą nieprawidłowo kierować receptor w komórce i zakłócać normalne funkcjonowanie.
    5. Upewnij się, że kontur komórki, wyznaczony przez błonę plazmatyczną, jest widoczny i najlepiej nie nakłada się na inne komórki.
    6. Ustaw ostrość i wyśrodkuj komórkę w polu view.
    7. Przełącz na tryb konfokalny.
    8. Wybierz tryb szybkiego obrazowania. Trzymając jedną rękę na kontrolce ostrości, a drugą na stoliku sterującym XY, ustaw ostrość i wyśrodkuj komórkę zainteresowania wizualizowaną na monitorze.
    9. Upewnij się, że komórka będąca przedmiotem zainteresowania jest dobrze rozsiana, a jej dolna lub brzuszna strona ściśle przylega do szkiełka nakrywkowego, skupiając się w górę iw dół przez komórkę.
  4. Ustaw parametry stołu montażowego z tak, aby zobrazować komórkę w 3D.
    1. Wybierz przycisk Włącz dla górnego i dolnego okna dialogowego stosu Z (lub jego odpowiednika) i skoncentruj się na dole komórki, a następnie naciśnij "rozpocznij". Następnie ustaw ostrość na górze komórki i naciśnij "end". Sprawdź ponownie, czy cała komórka jest uwzględniona w stosie z.
    2. Ustaw rozmiar kroku Z na 1,0 μm.
  5. Skonfiguruj ustawienia obrazowania.
    1. Wybierz Zoom 2, w zależności od obiektywu, tak aby ostateczny rozmiar piksela wynosił od około 0,279 μm x 0,279 μm do 0,14 μm x 0,14 μm w wymiarze XY.
    2. W przypadku komórek HEK w tym eksperymencie ustaw prędkość skanowania na około 1 μs na woksel i wybierz 2 uśrednienia lub 2 akumulacje według linii, w zależności od jasności komórek.
    3. Dostosuj intensywność i wzmocnienie lasera do obrazowania GFP i barwnika fluorescencyjnego. Ogólnie rzecz biorąc, przeciwbarwienia będą znacznie jaśniejsze, dlatego dla tego drugiego kanału kolorów należy stosować detektor fotopowielacza (PMT), a nie detektory siarczku galu (GaASP) lub detektory hybrydowe (HyD), podczas gdy detektory GaSP i HyD są niezbędne dla kanału GFP. Jeśli detektory HyD lub GaASP są używane do barwnika fluorescencyjnego, należy zachować ostrożność i zacząć od lasera o bardzo niskiej mocy.
    4. Ustaw czas skanowania i częstotliwość skanowania, na przykład co 30-60 s przez 25 minut lub dłużej, aby zobaczyć kierowanie AT1aR-GFP do lizosomów.
    5. Ustaw autofokus tak, aby zachować stabilność płaszczyzny ogniskowej w czasie.
  6. Rozpocznij eksperyment z obrazowaniem.
    1. Przygotuj wcześniej 100x Ang II w ilości 5 μg/μL (4,7793 mM) i dodaj 2,1 μl tego do 998 μl pożywki (10 μM).
    2. Stymulację liganda należy rozpocząć od dodania 3 μl 100-krotnego roztworu podstawowego liganda (Ang II) do studzienki zawierającej 300 μl bezpośrednio przed obrazowaniem (stężenie końcowe 100 nM).
    3. Kliknij start i obraz w 3D, aby ustawić żądany czas i częstotliwość.
    4. Przed zakończeniem pracy przy mikroskopie należy zebrać stos z do późniejszego wykorzystania w odejmowaniu tła podczas analizy. W trybie zliczania fotonów nie jest to konieczne, ponieważ tło jest zasadniczo równe 0. Przy włączonym oświetleniu i wszystkich innych warunkach obrazowania są takie same, ale bez próbki należy wykonać próbny obraz. Zobacz Odejmowanie tła (poniżej) w sekcji analiza.

Dzień piąty

5. Analiza obrazu

  1. Eksportuj obrazy do formatu tiff.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę pliku obrazu, aby wyświetlić menu i wybierz Eksportuj lub kliknij Plik | Eksport | import.
    2. Eksportuj do formatu tiff w celu późniejszych analiz, upewniając się, że eksportujesz 12-bitowe dane w formacie RAW, [a nie konwersję "czerwono-niebiesko-zieloną" (RGB) używaną do obrazów o jakości publikacji]. Nie eksportuj do formatu jpeg.
    3. Zanotuj wymiary woksela X, Y, Z i rozmiar kroku Z do późniejszego wykorzystania podczas analizy obrazu. Na przykład przy użyciu 40X/1.4. Obiektyw N.A. Wartości te mogą wynosić 0,138 μm x 0,138 μm przy rozmiarze kroku Z 1 μm (patrz dane w sekcji Reprezentatywne wyniki).
  2. Utwórz stos obrazów do analizy.
    1. Otwórz oprogramowanie do kwantyfikacji obrazu (rysunek 2)
    2. Za pomocą opcji "Akcja | Utwórz nowy | Obrazy z wybranej sekwencji", aby wygenerować pojedynczy obraz pliku z zaimportowanych pojedynczych sekwencji (Rysunek 2, strzałka #1).
    3. Wprowadź liczbę kanałów, liczbę sekcji Z i liczbę punktów czasowych.
    4. W zależności od struktury plików *.tiff należy wybrać na przykład kanały, płaszczyznę z i punkty czasowe jako kolejność płaszczyzn obrazu. Sprawdź, czy końcowy stos obrazów poprawnie reprezentuje kanały kolorów, stos z i punkty czasowe oryginalnego obrazu.
    5. Wybierz nazwę obrazu (Rysunek 2, podświetlona nazwa pliku po lewej stronie, strzałka #2). Kliknij prawym przyciskiem myszy obraz i/lub pole obrazu, a następnie z opcji na dole listy wybierz "Właściwości". W pikselu μm dla rozmiarów (X) (Y) i (Z) wprowadź poprawne właściwości obrazu wymienione powyżej.
  3. Odejmij tło przed analizą obrazu. Korekcję tła można wykonać w dowolnym oprogramowaniu do analizy obrazu. Odejmij tło, korzystając z jednej z dwóch opcji.
    1. Opcja 1: Wybierz "Akcja | Utwórz nowy | Odejmowanie tła" (Rysunek 2, strzałka #1). Użyj uzyskanego obrazu tła uzyskanego pod koniec sesji obrazowania opisanej powyżej jako "Ciemny obraz odniesienia" w sekcji "Narzędzia | Odejmij tło".
    2. Opcja 2: Sprawdź najciemniejsze obszary na obrazach, w których nie ma próbki, znajdź średnią lub maksymalną jasność pikseli w tym obszarze, ignorując wszelkie niezwykle jasne piksele, które mogą być fałszywym fluoroforem, losowo jasnym pikselem lub innym zjawiskiem. Wybierz "Akcje | Utwórz nowy | Odejmowanie tła". Użyj tej jasności pikseli (ujemnej) jako przesunięcia.
  4. Sprawdź rejestrację koloru i popraw w razie potrzeby.
    1. Korzystając z kontroli pozytywnej, takiej jak zobrazowane mikrogranulki lub kolokalizowane pęcherzyki zawierające GFP i barwnik fluorescencyjny (ryc. 3), oceń potrzebę korekty, wyłączając i włączając kanał koloru czerwonego lub zielonego. Wizualnie, jeśli rejestracja jest przesunięta nawet o 1 piksel, jest to widoczne dla oka.
    2. Wygeneruj korektę rejestracji, wybierając punkt menu "Akcje | Utwórz nowy | Korekta pasowania" (Rysunek 2, strzałka #1) i użyj okna dialogowego, aby dokonać regulacji. Po zakończeniu pojawi się nowy element folderu zatytułowany "Korekta rejestracji".
    3. Zastosuj rejestrację do jednego lub więcej interesujących obrazów, klikając nazwę obrazu (Rysunek 2, podświetlona nazwa pliku po lewej stronie, strzałka #2), a następnie wybierając "Narzędzia | Poprawna rejestracja" (przycisk Narzędzie obok opcji Działania).
  5. Utwórz sekwencję pomiarową, aby przeanalizować pęcherzyk R-GFP AT1ai intensywność całych komórek po leczeniu Ang II.
    1. Wybierz obraz (Rysunek 2, podświetlona nazwa pliku po lewej stronie, strzałka #2) i narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół pojedynczej komórki za pomocą narzędzia regionu freestyle (Rysunek 2, strzałka #3). Użyj trybu rozszerzonego ostrości (2D, menu rozwijane w lewym górnym rogu), aby obserwować komórkę, ponieważ narzędzie do przycinania działa tylko w wizualizacji 2D.
    2. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przytnij do zaznaczenia", a zostanie wygenerowany nowy element obrazu.
    3. Wybierz przyciętą komórkę, klikając jej nazwę, a następnie wybierz zakładkę "Pomiar" powyżej (Rysunek 2, strzałka #4).
    4. Aby zdefiniować i zmierzyć zinternalizowane pęcherzyki dla GFP, przeciągnij "Znajdź obiekty" w sekcji "Znajdowanie" (Rysunek 2, strzałka #5) do pola sekwencji (Rysunek 2, strzałka #6).
    5. Ustaw kanał "Znajdź obiekty" na kanał GFP.
    6. Otwórz ustawienia (ikona kółka w oknie dialogowym, strzałka #6) i ustaw "Próg za pomocą:" na SD i "dolny limit" na 6. Ustaw "Minimalny rozmiar obiektu" na 0 μm3.
      UWAGA: Dolny limit SD będzie zależał od indywidualnych eksperymentów. Wizualne potwierdzenie, że właściwe obiekty są progowe, jest dokonywane poprzez badanie różnych punktów czasowych (Rysunek 2, strzałka #7). Opcja "Pomiar | Opcje sprzężenia zwrotnego" służy do wyboru sposobu wizualizacji wybranych obiektów progowych (Rysunek 2, strzałka #8).
    7. Kliknij "Zmierz" w oknie dialogowym "Znajdź obiekty" (Rysunek 2, strzałka #6) i wybierz kanały i typ pomiarów. Zazwyczaj wybierz "Wszystkie kanały" i "Pomiary intensywności i głośności".
    8. Aby zdefiniować progi i filtry do identyfikacji całej komórki oraz zmierzyć całkowitą intensywność GFP, powtórz powyższe kroki (5.5.4 - 5.5.8), używając następujących parametrów: SD 0 i "Minimalny rozmiar obiektu" do 2 μm3 w drugim oknie dialogowym "Znajdź obiekty" w celu identyfikacji komórek za pomocą GFP (Rysunek 2, Strzałka #9)
    9. Przeciągnij "Filtruj populację" w sekcji "Filtrowanie" do pola sekwencji w sekcji populacja 2 (drugie pole "Znajdź obiekty", Rysunek 2, strzałka #9). Wybierz "Objętość (μm3 >100).
    10. Upewnij się wzrokowo, że zidentyfikowany jest tylko jeden obiekt. Cała komórka powinna być progowa, a wszystkie inne obiekty odfiltrowane. Parametr(y) "Filtr" może wymagać dostosowania, jeśli na przykład komórka jest mała.
    11. Po ustandaryzowaniu pomiaru zapisz protokół, klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zapisz protokół" w celu ponownego użycia ("Przywróć protokół"). Protokół można również wyeksportować, aby zapewnić rekord w tym samym podkatalogu co obraz.
    12. Przejdź do "Dokonaj pomiaru", wybierając "Pomiary | Dokonaj pomiaru przedmiotu" (Rysunek 2, strzałka #8) lub klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając "Dokonaj pomiaru" i "Wszystkie punkty czasowe".
    13. Wprowadź poprawną nazwę pomiaru (kopiowanie i wklejanie z obrazu jest wygodne) oraz kod analizy lub datę (pomocny dodatek do prowadzenia dokumentacji) i wybierz "Wszystkie punkty czasowe". Pod obrazem zostanie utworzony nowy element arkusza. Nazwy plików powinny być zwięzłe.
  6. Analizuj i eksportuj dane.
    1. Kliknij nazwę pliku arkusza roboczego i wybierz zakładkę "Analizuj". Określ, czy nasycone woksele są obecne, wybierając najpierw "Ogranicz analizę do:", wybierz Populacja 2 (komórka).
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole na karcie "Analizuj" i w oknie dialogowym w sekcji "Analizuj te dane:" wybierz "Maksimum ([Kanał koloru GFP])"; w sekcji "Podsumowane przez:" wybierz "Średnia ([Kanał koloru GFP]"; a następnie w sekcji "Uporządkuj dane według:" i "Wiersz" wybierz "Punkt czasowy" i kliknij "OK".
      UWAGA: Jeśli dane zawierają nasycone piksele (np. 65 536 dla 16-bitów lub 4 096 dla 12-bitów), analiza nie będzie dokładna (zaniży zawartość pęcherzyków). Pomiń tę komórkę do analizy. Jeśli nie jest nasycony, przejdź do następnego kroku.
    3. Następnie w zakładce "Raw", a następnie w zakładce "Analiza" i klikając dane prawym przyciskiem myszy znajdź "Ogranicz analizę do:", a następnie wybierz Populacja 1 dla pęcherzyków lub Populacja 2 dla całej komórki.
    4. W sekcji "Analizuj te dane:" wybierz "Suma" (kanał koloru GFP), w sekcji "Podsumowane przez:" wybierz "Suma"; a w sekcji "Uporządkuj dane według:" i "Wiersz" wybierz "Punkt czasowy" lub "Czas względny", a następnie kliknij "OK". Wybrane opcje analizy mogą być zapisywane i ponownie wykorzystywane.
    5. Wybierz i skopiuj/wklej bezpośrednio z oprogramowania do oceny ilości obrazów do pustego arkusza kalkulacyjnego lub wyeksportuj dane arkusza kalkulacyjnego, klikając dane prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Zapisz jako plik .csv. Pomiar intensywności całej komórki zostanie dołączony do pomiarów każdego pęcherzyka w populacji, więc pamiętaj, aby zidentyfikować i oddzielić go od pęcherzyków.
      UWAGA: Po wykreśleniu danych wzrost całkowitej fluorescencji GFP zawartej w pęcherzykach gwałtownie rośnie. Fotowybielanie, jeśli do niego dojdzie, jest wykrywane jako utrata całkowitej intensywności GFP komórek w czasie.
  7. Utwórz sekwencję pomiarową do analizy GFP obecnego w lizosomach.
    1. W Znajdź obiekty (populacja 1) ustaw kanał "Znajdź obiekty" na czerwony kanał, a w ikonie koła w tym oknie dialogowym wskazanym strzałką #6 (Rysunek 2) ustaw "Próg za pomocą:" na SD i "dolny limit" na 6. Ustaw "Minimalny rozmiar obiektu" na 0,017 μm3,
      UWAGA: Dolny limit SD będzie zależał od indywidualnych eksperymentów. Wizualne potwierdzenie, że właściwe obiekty są progowane, powinno być wykonane poprzez zbadanie różnych punktów czasowych. Opcja "Pomiar | Opcje sprzężenia zwrotnego" służy do wyboru sposobu wizualizacji wybranych obiektów progowych (Rysunek 2, strzałka #8).
    2. Kliknij "Zmierz" w oknie dialogowym "Znajdź "Obiekty" (Rysunek 2 strzałka # 6) i wybierz kanały i typy pomiarów. Zazwyczaj wybrane są "Wszystkie kanały" oraz "Pomiary intensywności i głośności".
    3. Dla populacji 2 należy użyć ustawień identycznych z tymi, które są używane do identyfikacji całej transfekowanej komórki wykazującej ekspresję AT1aR-GFP (5.5.9).
    4. Jeśli obecnych jest wiele komórek (w tym nietransfekowane komórki z fluorescencyjnymi pęcherzykami barwnikowo-dodatnimi), przycięcie komórki na pierwszym etapie analizy ma kluczowe znaczenie. Alternatywnie, należy zastosować "Compartmentalizację" w celu ograniczenia identyfikacji lizosomów w transfekowanej komórce wykazującej ekspresję AT1aR-GFP. Lizosomy muszą być identyfikowane tylko w komórce GFP, a nie w pobliskich, nietransfekowanych komórkach.
    5. Analizuj i eksportuj dane jak wyżej.
      UWAGA: Przykład komórek i pęcherzyków progowych pokazano na rysunku 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym reprezentatywnym zestawie eksperymentów, komórki HEK zostały przetransfekowane konstruktem receptora angiotensyny typu 1a (AT1aR-GFP) (E1,2,3-AT1aR) sklonowanym do plazmidu pEGFP-N213. Obrazy poklatkowe HEK zostały pozyskane i odtworzone jako film (patrz filmy Live Cell Imaging 1 i Live Cell Imaging 2). Filmy i zdjęcia pokazują, że po stymulacji ligandem, AT1aR-EGFP są zlokalizowane głównie w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj wstępne eksperymenty pokazują, że w dość krótkim czasie trwającym 24 minuty nie nastąpiła żadna znacząca zmiana w dostarczaniu AT1aR-GFP do lizosomów. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczenie zinternalizowanych receptorów do lizosomów może nastąpić już po 15-20 minutach. Eksperyment ten jest zgodny z hipotezą, że większość zinternalizowanego AT1aR jest ukierunkowana na duże, okołojądrowe endosomy. Dowody na to, że przynajmniej część AT1aR dociera do lizosomów, zostały wykaza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca badawcza przedstawiona w tym manuskrypcie została wsparta grantem R01 HL121456-01A1 dla Kathryn Sandberg. Prace te były dodatkowo wspierane przez dostępność Leica SP8 AOBS w Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR) w Georgetown University Medical Center, który jest częściowo finansowany przez P30-CA051008 z National Institutes of Health of the United States of America. Wyrażamy wdzięczność za pomoc w obrazowaniu Leica SP8 przez Petera Johnsona oraz za użycie Zeiss LSM880 w laboratorium Thomasa Coate'a z Wydziału Biologii Uniwersytetu Georgetown z pomocą w obrazowaniu zapewnioną przez Almę Arnold z Carl Zeiss Microscopy LLC. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Angiotensyna II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF2442Ciepła w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Penicylina Streptomycyna (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco (life technologies)25030-081Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Ludzka nerka embrionalna (HEK)-293 komórkiAmerican Type Culture Collection (ATCC) CRL-1573Przejście numer 5 - 12
Nunc Lab-Tek II komorowy 1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowegoSigma-Aldrich155409
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019Przechowywać pod kątem 4 stopni; C 
Opti-MEM, Zredukowana surowica MediumGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Sondy molekularneLysoTracker Red DND-99L7528Przechowywać porcjkwotowania w ciemności w temperaturze -20 & stopni; C . 
Volocity Ver. 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazuModuły wizualizacji i kwantyfikacjiPerkinElmerDo analizy obrazów 3D stosów obrazów
Leica SP8 AOBSLeica MicrosystemsLaserowy skaningowy mikroskop konfokalnyDo zbierania obrazów
Zeiss LSM 880Carl ZeissLaserowy skaningowy mikroskop konfokalnyDo zbierania obrazów
-ThermoFisher Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613(2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport receptor w angiotensynykom rki HEK 293receptory znakowane GFPkolokalizacja z lizosomamitr jwymiarowa analiza obrazuobrazowanie poklatkoweinternalizacja receptor wmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły