Artykuł metodologiczny

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

DOI:

10.3791/55181

⸱

8 lutego 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biomolecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2Optical Sciences Division, Naval Research Laboratory, 3Sotera Defense Solutions

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanonośnik ciekłokrystalicznej nanocząstki (LCNP) jest wykorzystywany jako narzędzie do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego ładunku do błony komórkowej żywych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrolowane dostarczanie leków/środków obrazujących do komórek jest kluczowe dla rozwoju terapii i badania procesów sygnalizacji komórkowej. W ostatnim czasie nanocząstki (NP) okazały się bardzo obiecujące w rozwoju takich systemów dostarczania. W tym przypadku zastosowano system dostarczania oparty na ciekłokrystalicznym NP (LCNP) do kontrolowanego dostarczania nierozpuszczalnego w wodzie barwnika, nadchloranu 3,3′-dioctadecyloksakarbocyjaniny (DiO), z wnętrza rdzenia NP do hydrofobowego obszaru dwuwarstwy błony plazmatycznej. Podczas syntezy nanocząsteczek barwnik został skutecznie wkomponowany w hydrofobowy rdzeń LCNP, co potwierdziły liczne analizy spektroskopowe. Koniugacja pegylowanej pochodnej cholesterolu z powierzchnią NP (DiO-LCNP-PEG-Chol) umożliwiła wiązanie naładowanych barwnikiem nanocząsteczek z błoną plazmatyczną w komórkach HEK 293T/17. Czasowo-rozdzielcza laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna i obrazowanie rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) potwierdziły bierny wypływ DiO z rdzenia LCNP i jego wprowadzenie do dwuwarstwy błony plazmatycznej. Wreszcie, dostarczenie DiO w postaci LCNP-PEG-Chol osłabiło cytotoksyczność DiO; forma NP DiO wykazywała ~ 30-40% mniejszą toksyczność w porównaniu doDiO free dostarczanego z roztworu luzem. Podejście to demonstruje użyteczność platformy LCNP jako wydajnej metody specyficznego dla błony dostarczania i modulacji hydrofobowych ładunków molekularnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu pojawienia się łączących nanomateriały (materiały ≤100 nm w co najmniej jednym wymiarze) z żywymi komórkami, nieustającym celem było wykorzystanie unikalnych właściwości nanocząstek (NP) zależnych od wielkości do różnych zastosowań. Zastosowania te obejmują znakowanie/obrazowanie komórek i tkanek (zarówno in vitro, jak i in vivo), wykrywanie w czasie rzeczywistym oraz kontrolowane dostarczanie leków i innych ładunków1. Przykładami takich istotnych właściwości nanocząsteczek są: zależna od wielkości emisja nanokryształów półprzewodnikowych (kropek kwantowych, QD); właściwości fototermiczne nanocząstek złota; duża nośność wodnego rdzenia liposomów; oraz przewodność balistyczna alotropów węgla, takich jak jednościenne nanorurki węglowe i grafen.

Ostatnio pojawiło się duże zainteresowanie wykorzystaniem NP do kontrolowanej modulacji leków i innych ładunków, takich jak środki kontrastowe/obrazujące. W tym przypadku uzasadnieniem jest znaczne zwiększenie/optymalizacja ogólnej rozpuszczalności, dostarczonej dawki, czasu krążenia i ostatecznej odprawy ładunku leku poprzez dostarczenie go jako preparatu NP. Stało się to znane jako dostarczanie leków za pośrednictwem NP (NMDD), a obecnie istnieje siedem zatwierdzonych przez FDA preparatów leków NP do stosowania w klinice w leczeniu różnych nowotworów i setki innych na różnych etapach badań klinicznych. Zasadniczo celem jest "osiągnięcie więcej za mniej; ", to znaczy wykorzystanie NP jako rusztowania do dostarczania większej ilości leku przy mniejszej liczbie dawek, wykorzystując dużą powierzchnię: objętość (np. twarde cząstki, takie jak QD i tlenki metali) NP lub ich dużą objętość wewnętrzną do załadunku dużych ładunków (np. liposomów lub miceli). Celem jest zmniejszenie konieczności stosowania wielu schematów dawkowania podawanych ogólnoustrojowo, przy jednoczesnym promowaniu stabilności wodnej i poprawie krążenia, szczególnie w przypadku trudnych hydrofobowych ładunków leków, które, choć wysoce skuteczne, są trudno rozpuszczalne w środowisku wodnym.

Tak więc, celem opisanej tutaj pracy było określenie opłacalności użycia nowego rusztowania NP do specyficznego i kontrolowanego dostarczania hydrofobowych ładunków do dwuwarstwy lipofilowej błony plazmatycznej. Motywacją do podjęcia prac była nieodłącznie ograniczona rozpuszczalność i trudność w dostarczaniu cząsteczek hydrofobowych do komórek z pożywki wodnej. Zazwyczaj dostarczenie takich hydrofobowych cząsteczek wymaga użycia rozpuszczalników organicznych (np. DMSO) lub amfifilowych środków powierzchniowo czynnych (np. Poloxamers), które mogą być toksyczne i zagrażać żywotności komórek i tkanek2, lub nośników micel, które mogą mieć ograniczoną zdolność ładowania wewnętrznego. Wybrany tutaj nośnik NP był nowym preparatem ciekłokrystalicznym NP (LCNP) opracowanym wcześniej3 i który, jak wykazano wcześniej, osiąga ~40-krotną poprawę skuteczności leku przeciwnowotworowego doksorubicyny w hodowanych komórkach4.

W pracy opisanej tutaj, reprezentatywnym wybranym ładunkiem był potencjometryczny barwnik membranowy, nadchloran 3,3'-dioctadecyloxacarbocyaniny (DiO). DiO to nierozpuszczalny w wodzie barwnik, który był używany do śledzenia następczego i wstecznego w żywych i utrwalonych neuronach, pomiarów potencjału błonowego oraz do ogólnego znakowania błony5,6,7,8,9. Ze względu na swoją hydrofobową naturę, DiO jest zwykle dodawany bezpośrednio do monowarstw komórek lub tkanek w postaci krystalicznej10, lub jest inkubowany w bardzo wysokich stężeniach (~1-20 μM) po rozcieńczeniu z roztworu podstawowego o stężeniu11,12.

Tutaj podejście zostało wykorzystane do platformy LCNP, wielofunkcyjnego NP, którego wewnętrzny rdzeń jest całkowicie hydrofobowy, a którego powierzchnia jest jednocześnie hydrofilowa i podatna na biokoniugację, jako nośnik dla DiO. DiO jest włączane do rdzenia LCNP podczas syntezy, a powierzchnia NP jest następnie funkcjonalizowana ugrupowaniem pegylowanym cholesterolem, aby promować wiązanie błonowe zespołu DiO-LCNP z błoną plazmatyczną. Podejście to zaowocowało systemem dostarczania, który podzielił DiO na błonę plazmatyczną z większą wiernością i czasem przebywania w błonie niż wolna forma DiO dostarczana z roztworu masowego (DiO free). Co więcej, metoda ta wykazała, że dostarczanie DiO za pośrednictwem LCNP znacznie moduluje i napędza szybkość specyficznego podziału barwnika na dwuwarstwę lipofilowej błony plazmatycznej. Osiąga się to przy jednoczesnym zmniejszeniu cytotoksyczności wolnego leku o ~40% poprzez dostarczanie go w postaci preparatu LCNP.

Przewiduje się, że opisana tutaj metodologia będzie potężną techniką umożliwiającą dla badaczy, których praca obejmuje lub wymaga komórkowego dostarczania wysoce hydrofobowych ładunków, które są trudno rozpuszczalne lub całkowicie nierozpuszczalne w roztworze wodnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie DiO-LCNP i DiO-LCNP-PEG-Chol

  1. W 2 ml chloroformu rozpuścić ciekłokrystaliczny środek sieciujący diakrylan (DACTP11, 45 mg), nadchloran 3,3′-dioktadecyloksakarbocyjaniny (DiO, 2 mg) i inicjator wolnych rodników (azobisisobutyronitryl) do polimeryzacji w 2 ml chloroformu. Dodać go do wodnego roztworu środka powierzchniowo czynnego funkcjonalizowanego akrylanem (AC10COONa, 13 mg w 7 ml).
  2. Mieszaj mieszaninę przez 1 godzinę i sonikuj przy amplitudzie 80% przez 5 minut, aby wytworzyć miniemulsję składającą się z małych kropelek materiału organicznego otoczonych polimeryzowalnym środkiem powierzchniowo czynnym w wodzie.
  3. Podgrzej mieszaninę do temperatury 64 °C w kąpieli olejowej, aby zainicjować polimeryzację zarówno środka sieciującego, jak i środka powierzchniowo czynnego, gdy chloroform powoli odparowuje, pozostawiając zawiesinę NP zawierającą DiO, która jest stabilizowana przez środek powierzchniowo czynny.
  4. Przefiltrować zawiesinę NP (3 razy) przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, aby usunąć agregację. Przefiltrowany roztwór NP przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  5. Koniugacja PEG-Chol do DiO-LCNP poprzez sprzężenie EDC.
    1. Rozpuścić Chol-PEG-NH2·HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) w 25 mM buforze HEPES (pH 7,0).
    2. Przygotować roztwór roboczy zawierający sól sodową N-hydroksysulfosukcynimidu (NHSS, 40 mM) i chlorowodorek 1-etylo-3-(3-(dimetyloamino)-propylo)karbodimidu (EDC, 400 mM) w buforze HEPES ze stężonych roztworów podstawowych.
    3. Natychmiast dodać 20 μl świeżo przygotowanego roztworu roboczego NHSS/EDC do 1,0 ml DiO-LCNP w buforze HEPES i mieszać przez 5 minut.
    4. Do tej mieszaniny dodać 20 μl roztworu podstawowego Chol-PEG-NH2·HCl i mieszać przez 2 godziny.
    5. Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną z maksymalną prędkością (~2,000 x g) przez 30 sekund za pomocą mini wirówki stołowej i przepuścić supernatant przez kolumnę chromatografii wykluczającej o wielkości PD-1013 zrównoważoną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS, 0,1x).

2. Charakterystyka DiO-LCNP i DiO-LCNP-PEG-Chol

  1. Potwierdź udane sprzężenie kowalencyjne PEG-Chol z powierzchnią DiO-LCNP za pomocą elektroforezy żelowej.
    1. Rozpuścić 0,5 g agarozy w 50 ml (1x) buforze do elektroforezy tris-boranowej (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM kwasu borowego i 2 mM EDTA). Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Poczekaj, aż roztwór lekko ostygnie i wlej zawartość do płytki żelowej w pudełku do elektroforezy. Włóż grzebień żelowy, aby utworzyć dołki na próbki.
    2. Gdy żel zastygnie, dodaj wymaganą ilość (wystarczającą do zanurzenia żelu w komorze) buforu do pracy TBE do komory.
    3. Dodać 35 μl próbki DiO-LCNP (zmodyfikowanej glicerolem, 5% v/v) do studzienek żelu i pracować przez 20 minut pod napięciem 110 V.
    4. Zobrazuj żel za pomocą systemu obrazowania żelu z filtrami wzbudzenia i emisji odpowiednio przy 488 nm i 500-550 nm.
  2. Oceń wielkość i rozkład cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), rozcieńczając roztwór DiO-LCNP (~200-krotne rozcieńczenie) w PBS (pH ~8, 0,1x) i mierząc na przyrządzie DLS14. Zmierzyć potencjał zeta DiO-LCNP za pomocą odpowiedniego przyrządu do pomiaru potencjału zeta.

3. Przygotowanie naczyń z kultur komórkowych do eksperymentów z dostarczeniem i obrazowania

UWAGA: Znakowanie DiO-LCNP jest wykonywane na ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych HEK 293T/17 (między przejściami 5 i 15), które są hodowane zgodnie z wcześniejszym opisem4. Wykonaj eksperymenty z dostarczaniem i późniejsze obrazowanie komórek, jak opisano poniżej.

  1. Przygotować szalki do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm (wyposażone w wkładki ze szkła nakrywkowego nr 1 o średnicy 14 mm), pokrywając je fibronektyną bydlęcą (~100 μl o stężeniu 20 μg/ml) w DPBS przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Usuń roztwór powlekający fibronektynę z naczynia hodowlanego. Pobrać komórki HEK 293 T1/7 z kolby T-25, najpierw przemłukując monowarstwę komórek 3 ml DPBS, a następnie dodając 2 ml trypsyny-EDTA (0,5% trypsyny-0,25% EDTA).
  3. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez ~3 min. Usunąć trypsynę-EDTA i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Po odłączeniu komórek od kolby należy zneutralizować trypsynę, dodając 4 ml kompletnej pożywki (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM; zmodyfikowana tak, aby zawierała 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% pirogronianu sodu i 5% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku) do kolby. Określić stężenie komórek w zawiesinie, licząc je w liczniku komórek.
  4. Dostosuj stężenie komórek do ~ 8 x 104 komórek / ml za pomocą pożywki wzrostowej. Dodać 3 ml zawiesiny komórkowej do naczynia i hodować w inkubatorze przez noc; Następnego dnia ogniwa powinny osiągnąć ~70% konfluencji i powinny być gotowe do użycia. Odpowiednia gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla solidnego i wydajnego znakowania dużego odsetka komórek.

4. Komórkowe dostarczanie DiO i DiO-LCNP oraz obrazowanie stałych komórek

  1. Przygotować 1 ml roztworów DiO, DiO-LCNP i DiO-LCNP-PEG-Chol w pożywce (HEPES-DMEM; DMEM zawierający 25 mM HEPES) przez rozcieńczanie roztworów podstawowychDiO Free i DiO-LCNP; odpowiednie stężenia DiO do inkubacji na komórkach wynoszą ~1-10 μM (wyrażone jako stężenieDiO free lub DiO w postaci DiO-LCNP).
  2. Usunąć pożywkę wzrostową z szalek hodowlanych za pomocą pipety serologicznej i przemyć monowarstwy komórek (patrz krok 3) dwa razy za pomocą HEPES-DMEM (2 ml każde przemycie). Wykonuj mycie, delikatnie dodając i usuwając HEPES-DMEM za pomocą pipety do/od krawędzi naczyń.
  3. Dodać 0,2 ml przygotowanych roztworówdo dostarczania DiO Free lub DiO-LCNP do środka szalek hodowlanych i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze na odpowiedni okres czasu (zwykle 15 lub 30 minut, w zależności od potrzeb eksperymentu). Dłuższe czasy inkubacji przyczyniają się do bardziej niespecyficznego znakowania komórkowego obszarów niebłoniastych (np. cytozolu).
  4. Po okresie inkubacji usunąć roztwory doprowadzające za pomocą pipety serologicznej. Umyj monowarstwy komórek dwa razy DPBS (2 ml każde płukanie). Wykonuj mycie, delikatnie dodając i usuwając DPBS do/od krawędzi naczynia.
  5. Utrwalić monowarstwy komórek za pomocą 4% paraformaldehydu (przygotowanego w DPBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest łatwopalny, działa drażniąco na drogi oddechowe i podejrzewa się, że jest rakotwórczy.
  6. Usunąć roztwór paraformaldehydu za pomocą pipety i delikatnie umyć komórki 1 raz DPBS (2 ml), dodając i usuwając DPBS za pomocą pipety do/od krawędzi szalek.
  7. Utrwalone komórki są gotowe do zobrazowania pod kątem obecności błoniastego sygnału fluorescencyjnego za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Obrazowanie należy wykonać natychmiast lub, alternatywnie, zastąpić pożywkę DPBS zawierającą 0,05% NaN3i przechowywać szalki w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: NaN3jest toksyczny; zachować szczególną ostrożność podczas korzystania z NaN3.
    UWAGA: Utrwalone próbki przechowywane w ten sposób powinny zostać zobrazowane w ciągu 48 godzin, aby uzyskać optymalne wyniki.

5. Komórkowe dostarczanie DiO i DiO-LCNP oraz obrazowanie FRET w żywych komórkach

UWAGA: W tej metodzie, komórki są koznakowane 6 μM każdy DiO-LCNP-PEG-Chol (gdzie DiO jest donorem FRET) i nadchloranem 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (wolny od DiI, gdzie DiI jest akceptorem FRET). Uwolnienie DiO z DiO-LCNP-PEG-Chol i jego wbudowanie w błonę plazmatyczną potwierdza obserwowany wzrost transferu energii od dawcy DiO do akceptora DiI.

  1. Oznacz komórki sekwencyjnie za pomocą DiO-LCNP-PEG-Chol i DiIfree, stosując metodę opisaną w kroku 4.
  2. Po barwieniu przemyć komórki 1 raz DPBS (2 ml) za pomocą pipety serologicznej i zastąpić bufor płuczący 2 ml roztworu do obrazowania żywych komórek (LCIS).
  3. Na stoliku mikroskopowym wyposażonym w podgrzewaną komorę inkubacyjną zobrazuj żywą próbkę komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw 60X) z konfiguracją obrazowania FRET w odstępach 30-minutowych przez okres 4 godzin, wzbudzając donor DiO przy 488 nm i zbierając pełne widma emisyjne zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI od 490-700 nm za pomocą 32-kanałowego detektora spektralnego.
  4. UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania FRET, patrz odniesienie15.
  5. Określ czasowo-rozdzielczą intensywność emisji zarówno donora DiO, jak i akceptora DiI z komórek barwionych DiO-LCNP-PEG-Chol i DiI. Oblicz czasowo rozdzielczy stosunek FRET akceptora/dawcy (DiIemi/DiOemi) dla obrazów, który będzie stale wzrastał i ostatecznie ustabilizuje się, gdy ilość donora DiO podzielonego na membranę osiągnie maksimum16.

6. Test cytotoksyczności DiO i DiO-LCNP dla komórek HEK 293T/17

UWAGA: Cytotoksyczność materiałów DiO-LCNP jest oceniana za pomocą testu proliferacji na bazie barwnika tetrazoliowego17. Komórki są hodowane na płytce wielodołkowej w obecności różnych stężeń materiałów w warunkach naśladujących dostarczanie/etykietowanie. Komórki są następnie hodowane przez 72 godziny, aby umożliwić proliferację. Barwnik (MTS, (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium) jest następnie dodawany do studzienek, a metabolicznie aktywne komórki przekształcają barwnik w niebieski produkt formazanu. Ilość tworzenia się koloru jest wprost proporcjonalna do liczby żywotnych komórek.

  1. Pobrać komórki HEK 293 T1/7 z kolby T-25, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.2.Wysiewać komórki HEK 293T/17 (5 000 komórek/100 μl/basenik) do dołków na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych i hodować przez 24 godziny.
  2. Całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną z dołków za pomocą mikropipety i dodać 50 μl HEPES-DMEM zawierającegoDiO free, DiO-LCNPs lub DiO-LCNP-PEG-Chol w rosnących stężeniach, aby powtórzyć studzienki. Inkubować na komórkach w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    UWAGA: Zazwyczaj powtórzenia wykonane w trzech lub czterech powtórzeniach są wystarczające do uzyskania statystycznie wiarygodnych danych.
    1. Po inkubacji usunąć pożywkę zawierającą materiały za pomocą mikropipety i zastąpić ją 100 μl pożywki wzrostowej. Hoduj komórki przez 72 godziny.
  3. Dodać 20 μl substratu tetrazolowego do każdej studzienki, umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i pozostawić do tworzenia koloru w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Odczytać absorbancję (abs) produktu formazanu przy 570 nm (minima absorpcji dla DiO-LCNP użytych w tym badaniu) i 650 nm (dla odjęcia niespecyficznej absorbancji tła) za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania.
  4. Wykreślić różnicową wartość absorbancji (abs570 - abs650) w stosunku do stężenia materiału i podać wyniki jako procent proliferacji komórek kontrolnych (stopień proliferacji komórek tylko w pożywce do hodowli komórkowych).

7. Analiza danych

  1. Statystyczna analiza danych za pomocą jednowymiarowej analizy wariancji (ANOVA). W przypadku wielokrotnych porównań należy zastosować test post hoc Bonferroniego. Podać wszystkie wartości średnie ± wartości standardowe błędu średniej (SEM), chyba że zaznaczono inaczej.
    UWAGA: Dopuszczalne prawdopodobieństwo istotności wynosiło p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowano LCNP, w których hydrofobowy rdzeń nanocząsteczki (NP) został obciążony reprezentatywną sondą do znakowania błon, aby zademonstrować użyteczność LCNP jako efektywnego nośnika dla ładunków hydrofobowych. W tym celu wybrano jako ładunek DiO, wysoce nierozpuszczalny w wodzie potencjometryczny barwnik do znakowania błon. LCNP obciążone DiO (DiO-LCNPs) zsyntetyzowano przy użyciu techniki miniemulsji dwufazowej z wykorzystaniem komponentów chemicznych DACTP11, AC10COONa oraz DiO, jak pokazano na rycinie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stałym celem NMDD jest kontrolowane celowanie i dostarczanie preparatów leczniczych do komórek i tkanek, w połączeniu z jednoczesną poprawą skuteczności leków. Jedną ze specyficznych klas cząsteczek leków, dla których stanowi to poważne wyzwanie, są leki hydrofobowe/środki do obrazowania, które mają niewielką lub żadną rozpuszczalność w środowisku wodnym. Problem ten był plagą w procesie przechodzenia silnych leków z systemów hodowli komórkowych in vitro do warunków klinicznych i spowodował, że wiele obiecującyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Finansowania Bazy NRL (Jednostka Robocza MA041-06-41-4943). ON jest wspierany przez National Research Council Postdoctoral Research Associateship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-(dimetyloamino)-propylo)karbodimidu (EDCA)ThermoFisherE2247
3,3&-dioctadecyloxacarbocyanina nadchloran (DiO)Sigma AldrichD4292-20MGNiebezpieczne; zrobić roztwór podstawowy w DMSO
Chlorowodorek poli(glikolu etylenowego) aminyNanocs, Inc.PG2-AMCS-2k
Hrabina automatyczny licznik komórekThermoFisherC10227
Dioctadecyl-3,3,3′ ⁠,3′-tetrametyloindokarbocyjaniny nadchloran (DiI)Sigma Aldrich468495-100MGNiebezpieczne; zrobić roztwór podstawowy w DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ThermoFisher21063045Warm w 37 stopniach; C przed użyciem
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermoFisher14040182Ciepła w 37 stopniach; C przed użyciem
Przyrząd do dynamicznego rozpraszania światłaZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Wielka Brytania)
Fibronektyna Białko bydlęce, PlazmaThermoFisher33010018Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml za pomocą DPBS. Użyj 20-30 i mikro; g/ml do powlekania naczynia MetTek, 2 godz. w 37 stopniach; C
Formaldehyd (16%, w/v)ThermoFisher28906Niebezpieczny; rozcieńczyć do 4% przy użyciu DPBS
Ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK 293T/17)American Type Culture CollectionATCC® CRL-11268 i handel;
Rozwiązanie do obrazowania żywych komórek (LCIS)ThermoFisherA14291DJWarm w 37 stopniach; C przed użyciem
MatTek 14 mm # 1.0 wkładka do hodowli komórkowychMatTek corporationP35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) zawierające 25 mM HEPESThermoFisher21063045Warm w 37 stopniach; C przed użyciem
N-sól sodowa hydroksysulfosukcynimidu (NHSS)ThermoFisher24510
Mikroskop spektralny konfokalny Nikon A1siNikon Instruments Trypan Blue
Stain (0,4%) ThermoFisherT10282mieszać jako 50% do zawiesiny komórek przed zliczeniem komórek
Instrument potencjałuZeta ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Wielka Brytania)
Procesor ultradźwiękowySonics and Materials IncGEX 600-5
Mini CetntrifugeBenchmarkMini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 MediumGE Healthcare17-0851-01
System obrazowania Bio-Rad ChemiDoc XRSBio-RAD76S/07434
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermoFisher25200056

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie adunku hydrofobowegocelowanie w b on plazmatycznobrazowanie mikroskopowe konfokalneanaliza FRETkoniugacja PEG cholesteroluchromatografia elowakom rki HEK 293Tredukcja cytotoksyczno ciinsercja w dwuwarstw b onow

Powiązane artykuły