Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55183

⸱

9 lutego 2017

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Tulane University

W tym artykule

Podsumowanie

Angiogeneza obejmuje interakcje wielokomórkowe, wielosystemowe, które muszą być badane w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Celem tego badania jest wykazanie zdolności modelu hodowli krezki szczurów do dokonywania poklatkowych porównań nienaruszonych sieci mikronaczyniowych podczas angiogenezy.

Streszczenie

Angiogeneza, definiowana jako wzrost nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń, obejmuje komórki śródbłonka, perycyty, komórki mięśni gładkich, komórki odpornościowe oraz koordynację z naczyniami limfatycznymi i nerwami. Wielokomórkowe, wieloukładowe interakcje wymagają badania angiogenezy w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Tak więc, chociaż zastosowanie modeli hodowli komórkowych in vitro dostarczyło mechanistycznych spostrzeżeń, powszechną krytyką jest to, że nie podsumowują one złożoności związanej z siecią mikronaczyniową. Celem tego protokołu jest wykazanie zdolności do dokonywania porównań poklatkowych nienaruszonych sieci mikronaczyniowych przed i po stymulacji angiogenezy w hodowanych tkankach krezki szczurów. Hodowane tkanki zawierają sieci mikronaczyniowe, które utrzymują swoją hierarchię. Znakowanie immunohistochemiczne potwierdza obecność komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich, perycytów, naczyń krwionośnych i naczyń limfatycznych. Ponadto znakowanie tkanek za pomocą BSI-lektyny umożliwia poklatkowe porównanie lokalnych regionów sieci przed i po stymulacji surowicy lub czynnika wzrostu, charakteryzujących się zwiększonym kiełkowaniem naczyń włosowatych i gęstością naczyń. W porównaniu z popularnymi modelami hodowli komórkowych, metoda ta stanowi narzędzie do badań linii komórek śródbłonka i oceny specyficznych dla tkanek leków angiogennych w fizjologicznie istotnych sieciach mikronaczyniowych.

Wprowadzenie

Wzrost i przebudowa sieci mikronaczyniowej są wspólnymi mianownikami dla funkcji tkanek, gojenia się ran i wielu patologii, a kluczowym procesem jest angiogeneza, zdefiniowana jako wzrost nowych naczyń krwionośnych z istniejących1,2. W przypadku inżynierii tkankowej nowych naczyń krwionośnych lub projektowania terapii opartych na angiogenezie zrozumienie znaczenia dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę ma kluczowe znaczenie. Proces ten jest jednak złożony. Może zmieniać się w określonych miejscach w sieci mikronaczyniowej i obejmuje wiele typów komórek (tj. komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, perycyty, makrofagi, komórki macierzyste) i wiele układów (sieci limfatyczne i sieci neuronowe). Chociaż modele in vitro w ogromnym stopniu przyczyniły się do zbadania relacji między różnymi komórkami zaangażowanymi w angiogenezę3, ich znaczenie fizjologiczne może być podważone ze względu na ich ograniczoną złożoność i fakt, że nie odzwierciedlają one dokładnie scenariusza in vivo. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w ostatnich latach opracowano i wprowadzono trójwymiarowe systemy hodowli3, modele tkanek ex vivo4, systemy mikroprzepływowe5,6 oraz modele obliczeniowe7. Jednak nadal istnieje zapotrzebowanie na model z funkcją poklatkową do badania angiogenezy w nienaruszonych sieciach mikronaczyniowych ex vivo. Ustanowienie nowych modeli poklatkowych do badań angiogenezy o takim poziomie złożoności będzie stanowić nieocenione narzędzie do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw angiogenezy i udoskonalenia terapii.

Potencjalnym modelem, który umożliwia badanie ex vivo angiogenezy w nienaruszonej sieci mikronaczyniowej, jest model hodowli krezki szczura8. W ostatnich pracach wykazaliśmy, że sieci mikronaczyniowe krwi i limfy pozostają żywotne po hodowli. Co ważniejsze, model hodowli krezki szczurów może być wykorzystany do badania funkcjonalnych interakcji między komórkami perycytów i śródbłonka, połączeń komórek śródbłonka krwi i limfy oraz obrazowania poklatkowego. Celem tego artykułu jest przedstawienie naszego protokołu dla metody obrazowania poklatkowego. Nasze reprezentatywne wyniki dokumentują wiele typów komórek, które pozostają żywotne po stymulacji angiogenezy surowicą i oferują przykłady zastosowania tej metody do ilościowego określania specyficznych dla tkanek odpowiedzi angiogennych, a także badań śledzenia komórek śródbłonka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tulane (IACUC).

1. Konfiguracja procedury chirurgicznej

  1. Instrumenty autoklawowe, materiały chirurgiczne i materiały do hodowli przed operacją. Materiały chirurgiczne dla każdego szczura obejmują: 1 serwetę, 1 serwetkę z wyciętym otworem (0,5 cala x 1,5 cala) pośrodku, gaziki i 1 chłonny podkład. Narzędzia chirurgiczne obejmują: 1 skalpel z ostrzem numer 10, 2 pary pęset i parę cienkich nożyczek. Materiały do hodowli obejmują: 1 serwetkę, 1 parę pęsety oraz przygotowane wkłady 6-dołkowe z filtrami poliwęglanowymi.
  2. Wysterylizuj platformę z pleksi, scenę chirurgiczną i stół chirurgiczny za pomocą 70% etanolu. Etap chirurgiczny należy przechowywać w sterylnej misce do czasu użycia.
    1. Utwórz etap chirurgiczny, wiercąc otwór o wymiarach około 2 na 1 cal w środku naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Następnie użyj papieru ściernego, aby wygładzić ostre krawędzie i dodaj warstwę kleju silikonowego do krawędzi otworu, aby stworzyć podniesioną powierzchnię dla tkanek.
    2. Alternatywnie, zaprojektuj etap chirurgiczny za pomocą oprogramowania CAD i wykonaj go za pomocą druku 3D (rysunek 1).
  3. Umieść sterylny chłonny podkład i połóż na nim platformę z pleksiglasu. Umieść serwetę, bez wstępnie wyciętego otworu, na podgrzewanej podkładce obok chłonnego podkładu.
  4. Wstępnie podgrzać sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pożywkę i sól fizjologiczną do temperatury 37 °C. Umieścić pożywkę i PBS w oddzielnych naczyniach hodowlanych na poduszce grzewczej i umieścić sól fizjologiczną w stożkowej probówce o pojemności 50 ml obok zestawu chirurgicznego.
  5. Upewnij się, że wszystkie opakowania zostały otwarte przed rozpoczęciem zabiegu, aby zapewnić sterylne obchodzenie się ze wszystkimi materiałami. Pełna lista popularnych narzędzi używanych w tej procedurze znajduje się w Tabeli określonych materiałów i narzędzi chirurgicznych.

2. Pobieranie tkanek krezki

  1. Stosować dorosłe samce szczurów rasy Wistar (350 ± 25 g; w wieku 6-8 tygodni). Można zastąpić inne szczepy i wiek szczurów.
  2. Znieczulić szczura poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (8 mg/kg masy ciała). Upewnij się, że szczur jest pod narkozą, ściskając między palcami, aby sprawdzić, czy nie ma reakcji odruchowej; Nie powinno być żadnego. Analgezja prewencyjna w przypadku tej procedury terminalnej nie jest konieczna.
  3. Ogol okolice brzucha i usuń pozostałe włosy za pomocą kremu do depilacji. Przetrzyj skórę brzucha dwukrotnie 70% alkoholem izopropylowym, a następnie jodowidonem. W przypadku chusteczek chirurg powinien zacząć od środka pola operacyjnego i przesuwać się na zewnątrz przygotowanego obszaru w sposób okrężny, aby nie nachodzić na obszary, które zostały wcześniej wyszorowane tym samym kawałkiem sterylnej gazy lub sterylnego wacika. Następnie przenieś zwierzę do sterylnego zestawu chirurgicznego i umieść na platformie z pleksiglasu.
  4. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o nacięciu 0,75 cala - 1,25 cala w jelitie, zaczynając 1 cal poniżej mostka. Uważaj, aby nie przebić jelita lub krezki (1 warstwa skóry, 1 warstwa tkanki łącznej i 1 warstwa mięśni).
  5. Umieść serwetę z wyciętym otworem nad nacięciem i umieść sterylną stację chirurgiczną na wierzchu serwety. Upewnij się, że otwór jest wyrównany z nacięciem. Użyj sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby zlokalizować i wyciągnąć jelito kręte przez otwór etapu chirurgicznego.
  6. Przeciągnij 6-8 okien krezkowych przez scenę za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką i uważaj, aby nie dotknąć okien (Rysunek 1). Tkanki są zwykle pobierane z okolicy jelita krętego jelita cienkiego, zaczynając w pobliżu jelita ślepego. W razie potrzeby utrzymuj odsłonięte tkanki wilgotne podgrzaną sterylną solą fizjologiczną, używając sterylnej strzykawki do ociekania roztworu.
  7. Poddaj szczura eutanazji poprzez dosercowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (0,2 ml na szczura). Przed usunięciem okien krezkowych upewnij się, że szczur został poddany eutanazji poprzez badanie palpacyjne serca; Nie powinno być pulsu.
  8. Usuń pożądane tkanki krezki za pomocą pęsety, aby chwycić poduszeczkę tłuszczową i cienkich nożyczek, aby przeciąć okno. Zostaw obwódkę tłuszczu (2 mm) wokół okna. Umyj chusteczki raz w podgrzanym sterylnym PBS, a raz w pożywce.
  9. Zwróć zewnętrzną część jelita krętego do jamy brzusznej i zutylizuj zwierzę zgodnie z wytycznymi instytucji.

3. Hodowla tkanki krezki do badań poklatkowych

  1. Przenieść autoklawowane materiały do hodowli (patrz sekcja 1.1) i tkanki do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.
  2. Użyj pęsety, aby przenieść każdą tkankę na poliwęglanową membranę filtracyjną. Chwyć tkanki za poduszkę tłuszczową, aby uniknąć uszkodzenia układu krwionośnego.
  3. Szybko rozprowadź tkankę za pomocą poduszki tłuszczowej, uważając, aby nie dotknąć okienka. Odwróć wkładkę z tkanką na dno płytki 6-dołkowej i przykryj 3 ml pożywki (ryc. 1). Typowe podłoża stosowane w tej procedurze obejmują minimalną ilość pożywek niezbędnych (MEM) z 1% penicyliną, streptomycyną (PenStrep) i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Pożywki mogą być uzupełniane innymi surowicami i/lub czynnikami wzrostu w celu stymulacji angiogenezy.
  4. Powtórzyć kroki 3.2 - 3.3 dla każdej tkanki i kultury w standardowych warunkach inkubatora (5% CO2, 37 °C) przez okres do 5 dni.

4. Obrazowanie poklatkowe tkanki krezki

  1. W dniu obrazowania uzupełnić pożywkę w każdym dołku sprzężoną lektyną BSI i inkubować w standardowych warunkach hodowli przez 30 minut. Umyć tkanki dwukrotnie pożywką bez lektyn. Barwienie BSI-Lektyna pozostanie widoczne na tkance krezki przez okres do 3 dni w hodowli.
  2. Przenieś płytkę do stolika mikroskopowego. Zidentyfikuj naczynia krwionośne i limfatyczne na podstawie ich morfologii i struktury sieci.
  3. Zlokalizuj żądany obszar sieci na każdej tkance i zrób zdjęcia. Zanotuj lokalizację obrazowania, aby upewnić się, że ten sam obszar zostanie uchwycony dla kolejnych obrazów. Jeśli używasz zmotoryzowanego stolika, udokumentuj współrzędne.
  4. Zwróć tkanki do inkubatora i kontynuuj hodowlę do pożądanego punktu końcowego. W razie potrzeby powtórz kroki 4.1 - 4.3 w zależności od żądanych punktów czasowych eksperymentu.

5. Znakowanie immunologiczne tkanek

  1. Oznakowanie BSI-Lektyna
    1. Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze 37 °C z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w pożywce (2,5 ml roztworu przeciwciała na basenie na płytce 6-dołkowej), a następnie dwukrotnie płukać pożywką. W przypadku płukania dodaj pożywkę, a następnie natychmiast wymień.
  2. Etykietowanie żywych/martwych
    1. Inkubować tkanki przez 10 minut w temperaturze 37 °C z 1:500 2 mM homodimeru etydyny-1 i 1:500 1 mM kalceiny AM w pożywce (2,5 ml roztworu przeciwciała na basenie na płytce 6-dołkowej), a następnie dwukrotnie przepłukać pożywką.
  3. Oznakowanie BSI-Lectin/NG2
    1. Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.
    2. Utrwalić chusteczki w zimnym metanolu na 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS (3 x 10 min).
    3. W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z poliklonalnym przeciwciałem NG2 w skali 1:100 królika i 5% normalną surowicą kozią (NGS). Umyj chusteczki PBS (3 x 10 min).
    4. W celu znakowania przeciwciałami wtórnymi inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 koziego przeciwciała anty-króliczego CY2 sprzężonego (GAR-CY2) i 5% NGS. Umyj chusteczki PBS (3 x 10 min).
    5. Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w PBS, a następnie dwukrotnie płukać PBS. W przypadku płukania dodaj PBS, a następnie natychmiast wymień.
    6. Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.
  4. Oznakowanie LYVE-1/PECAM
    1. Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.
    2. Utrwalić tkanki w zimnym metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS + 0,1% saponiną (3 x 10 min).
    3. W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mysim monoklonalnym biotynylowanym przeciwciałem CD31 w skali 1:200 i poliklonalnym przeciwciałem LYVE-1 w skali 1:100 królika w PBS + 0,1% saponiny + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    4. W celu wtórnego znakowania przeciwciał inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:500 przeciwciałem streptawidyny sprzężonym z CY3 i 1:100 GAR-CY2 w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    5. Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.
  5. Oznakowanie BrdU/BSI-Lectin
    1. Dodać 1 mg/ml BrdU do pożywki i zastąpić pożywkę tkankową roztworem BrdU. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.
    3. Utrwalić chusteczki w zimnym metanolu na 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS (3 x 10 min).
    4. Denaturować DNA tkankowe w 2 M HCl przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umyć tkanki w PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    5. W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z monoklonalnym mysim anty-BrdU w proporcji 1:100 w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    6. W celu wtórnego znakowania przeciwciał inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 koziego przeciwciała anty-mysiego Cy3 sprzężonego (GAM-Cy3) w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    7. Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w PBS, a następnie dwukrotnie płukać PBS.
    8. Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.
  6. Oznakowanie BSI-Lectin/CD11b
    1. Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.
    2. Utrwalić tkanki w zimnym metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS + 0,1% saponiną (3 x 10 min).
    3. W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 mysim antyszczurem CD11b w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    4. Do wtórnego znakowania przeciwciał inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 GAM-Cy3 w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).
    5. Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w PBS, a następnie dwukrotnie płukać PBS.
    6. Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po 3 dniach hodowli tkanki zostały oznakowane zestawem do oceny żywotności/cytotoksyczności (live/dead), aby wykazać żywotność mikronaczyniowości w modelu hodowli krezu szczura (Rysunek 2A). Większość komórek obecnych w krezie pozostała żywotna w hodowli, przy czym komórki śródbłonkowe zidentyfikowano na podstawie ich lokalizacji w segmentach mikronaczyniowych. Proliferację komórek śródbłonka potwierdzono również za pomocą znakowania lektyną/BrdU (Rysunek 2D

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten dokumentuje metodę wykorzystania modelu hodowli krezki szczura jako narzędzia ex vivo do obrazowania poklatkowego wzrostu sieci mikronaczyniowej. Wcześniejsze prace w naszym laboratorium ustaliły zastosowanie naszego modelu do 1) angiogenezy8, 2) limfangiogenezy8, 3) interakcji komórek perycyta-śródbłonka8 i 4) antyangiogennych testów leków9. Możliwość obrazowania hodowanych tkanek krezki szczura w wielu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 dla WLM i Tulane Center for Aging. Chcielibyśmy podziękować Matthew Nice'owi za pomoc w redagowaniu tekstu protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SerwetaCardinal Health401212" x 12" Bio-Shield Regularne owijki sterylizacyjne
Uchwyt skalpelaRoboz Instrument chirurgicznyRS-9843Uchwyt skalpela, #3; Bryła;
Sterylne ostrze chirurgiczneCincinnati Surgical0110ze stali nierdzewnej; Rozmiar 10
Naczynie hodowlane (60 mm)Thermo Scientific13018110/rękaw
Graefe Forcep (zakrzywiona pęseta)Narzędzie chirurgiczneRoboz RS-5135Mikrokleszcze preparacyjne; Ząbkowane; Niewielka krzywa; 0.8 mm Szerokość końcówki; Kleszcz
(pęseta prosta)Narzędzie chirurgiczne Roboz RS-5130Mikrokleszcze preparacyjne; Ząbkowane, proste; 0.8 mm Szerokość końcówki; Długość 4 "
Noyes Micro ScissorRoboz Instrument chirurgicznyRS-5677Noyes Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania;
Proste, ostro-końcówki; 13 mm Krawędź tnąca; 0,25 mm Szerokość końcówki, 4 1/2" Długość całkowita
GazikiFisherBrand13-761-52Niesterylne bawełniane gąbki z gazy; 4" x 4" 12-warstwowe
aplikatory z końcówką bawełnianąFisherBrand23-400-1246" Długość; Drewniany wał; Jednorazowa
płytka 6-dołkowaFisher Scientific08-772-49Płaskie dno z pokrywką o niskim parowaniu; Polistyren; Niepirogenna
sterylna strzykawka 5 mlFisher Scientific14-829-45Luer-Lok Tip
Medical Action Industries Inc.0123232 uncje woreczek na skórkę; Niebieski; Sterylne
jednorazowe wkładki do płytek 6-dołkowych (wkładki CellCrown)6-dołkowych SIGMAZ681792-3EA; Niesterylna
membrana filtracyjna z poliwęglanuSIGMATMTP04700Filtr membranowy izoporowy; Poliwęglan; Hydrofilowy; 5.0  &mikro; m, 47  mm, White Plain
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
BeuthanasiaSchering-Plough Animal Health Corp. Union (zamówione w MWI Veterinary Supply)MWI #: 011168Składnik aktywny: na 100 ml, 390 mg pentobarbitalu sodu, 50 mg fenytoiny sodu 
KetaminaFort Dodge Animal Health (zamówiona w MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Kateset 100 mg / ml
XylazineLLOYD. Inc. (Zamówione w MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Anased 100 mg / ml
SalineBaxter2F7122
PBSInvitrogen14040-133
MEMInvitrogen11095080
PenStrepInvitrogen15140-122
FBSInvitrogen16000-044
BSAJackson ImmunoResearch001-000-162
Saponina SIGMAS7900-100G
Alkohol izopropylowyFisher ScientificS25372
Operandpowidonowo-jodowy82-226
Kwas solnySIGMA320331
MetanolFisher Scientific67-56-1
GlicerolFisher Scientific56-81-5
Sprzężony z FITC LektynaSIGMAL9381-2MG
Przeciwciało anty-NG2 Siarczan chondroityny Przeciwciało proteoglikanuSIGMAAB5320
PECAM (CD31) PrzeciwciałoBD Biosciences555026
Przeciwciało LYVE-1AngioBio Co.11-034
Kozie przeciwciało anty-królicze Cy2-sprzężoneJackson ImmunoResearch111-585-144
Kozie przeciwciało anty-mysie Cy3-sprzężoneJackson ImmunoResearch115-227-003
Streptawidyna Cy3-sprzężone przeciwciałoJackson ImmunoResearch016-160-084
Zestaw żywy/martwy żywotność/cytotoksycznośćInvitrogenL3224
Normalna surowica kozia Jackson ImmunoResearch005-000-121
5-bromo-2'-deoksyurydynaSIGMAB5002
Monoklonalna mysia anty-bromodeoksyurydyna                                              Klon Bu20aDakoM074401-8
Mysz Anty-Szczur CD11b AbD SerotecMCA275R
o długości 4 cali Graefe o długości 4 " Sterylna miska Wkładki do płytek

Bibliografia

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582(2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108(2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7(2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla ex vivotkanka krezki szczurakie kowanie naczy w osowatychproliferacja kom rek r db onkaznakowanie lektyn BSIobrazowanie naczy limfatycznychodpowied angiogennamikroskopia fluorescencyjna
Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.