Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Podsumowanie

Prosta metoda lizy czerwonych krwinek do tworzenia B-LCL została opracowana z wysoką efektywnością nieśmiertelności, wymagając niewielkiej ilości krwi i oszczędzając czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Streszczenie

Istnieje wiele metod przekształcania limfocytów B przez wirusa Epsteina-Barra in vitro w unieśmiertelnione linie komórkowe. Opracowaliśmy nową metodę z potężną i prostą strategią tworzenia B-LCL, metody lizy czerwonych krwinek. Metoda ta uprościła procedurę separacji PBMC z usunięciem czerwonych krwinek i wykorzystała zaledwie 0,5 ml krwi pełnej do ustanowienia linii komórkowych unieśmiertelnionych przez EBV, które mogą rozmnażać się do dużej liczby komórek w stosunkowo krótkim czasie ze 100% skutecznością. Metoda jest prosta, niezawodna, oszczędza czas i ma zastosowanie do leczenia dużej liczby próbek klinicznych.

Wprowadzenie

Spoczynkowe limfocyty B mogą zostać przekształcone przez wirusa Epsteina-Barr (EBV) in vitro w aktywnie proliferujące linie komórkowe limfoblastoidalne B (B-LCL). B-LCL są podobne do komórek rozrodczych pod względem różnicowania i rozwoju, a wskaźnik mutacji somatycznych B-LCL wynosił tylko 0,3%¹, przy znikomych zmianach genetycznych i fenotypowych. W związku z tym B-LCL, jako substytuty komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), znacznie przyspieszyły postęp badań genomiki, transkryptomiki i proteomiki chorób związanych z EBV^2,3. Co więcej, B-LCL mają również ważne zastosowanie w badaniach przesiewowych przeciwciał monoklonalnych^4,5.

Opracowano kilka metod unieśmiertelniania limfocytów B przez EBV. Do najczęstszych procedur należy izolacja limfocytów B i wykorzystanie linii komórkowych B95-8 do produkcji zakaźnego EBV. Od izolacji do transformacji, metody te dzielą się na trzy strategie. Limfocyty są oddzielane od świeżej krwi przez wirowanie w gradiencie gęstości i transformację EBV bezpośrednio^6-8, co w tym badaniu nazywa się metodą separacji gradientu gęstości. Jednak inne techniki pokonują trudności związane z transportem świeżej krwi i wykorzystują procedurę zamrażania oczyszczonych limfocytów, a następnie rozmrażania i zakażenia EBV^9-11. Kriokonserwowana krew pełna może być również wykorzystana do izolacji limfocytów B i transformacji^12,13. Oprócz wirowania w gradiencie gęstości w celu oddzielenia limfocytów B, niektórzy badacze używają magnetycznego sortera komórek do selekcji limfocytów B¹². Jednak separacja magnetyczna jest kosztownym, złożonym i czasochłonnym procesem. Chociaż metody te są przydatne do unieśmiertelniania limfocytów B z wysokim wskaźnikiem sukcesu, konieczność leczenia dużej liczby próbek klinicznych i stosunkowo mała objętość krwi wymagają prostszej metody ustanowienia trwałej linii komórkowej.

Inną rzadziej używaną metodą jest użycie pełnej krwi jako źródła komórek jądrzastych do zakażenia EBV i tworzenia B-LCL. Metody te upraszczają technikę, pomijając procedurę separacji. Tylko niewielka ilość krwi pełnej, zarówno świeżej¹⁴, jak i mrożonej^15,16, jest wystarczająca do uzyskania linii komórkowych. Niestety, istnieje duża zmienność w sukcesie w porównaniu z dokumentami^{15, 16} i kilkoma naszymi testami walidacyjnymi. Co więcej, przekształcone kolonie są prawie nie do rozpoznania pod mikroskopem ze względu na duże zanieczyszczenia zanieczyszczające. W związku z tym potrzebna jest bardziej niezawodna metoda transformacji.

Na podstawie powyższych rozważań, opracowaliśmy nową metodę ustalania B-LCL bez uprzedniego oczyszczania limfocytów, nazwaną metodą lizy czerwonych krwinek. Ta metoda jest wygodna, oszczędza czas i ma zastosowanie do dużej liczby próbek. Wystarczyło zaledwie 0,5 ml krwi pełnej, aby uzyskać B-LCL, które są łatwo dostępne u niemowląt i osób starszych bez znaczącego uszczerbku na ich zdrowiu.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Instytutu Genetyki i Biologii Rozwoju, a protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.

1. Przygotowanie wirusa EB

1. W pierwszym dniu rozmrozić komórki B95-8 i wyhodować je w 6 ml kompletnej pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i antybiotykami (100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny) w kolbie hodowlanej T25. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
2. W 2 dniu obserwuj morfologię komórki pod mikroskopem. Komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe. Dodaj 10 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.
3. W 4 dniu dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki RPMI 1640, a następnie przenieść do kolby hodowlanej T75.
4. W dniu 8 dodaj 20 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.
5. Utrzymuj komórki przez 8 dni bez dodawania świeżej pożywki, tj. głodu.
6. W 16 dniu obserwuj komórki obserwowane pod mikroskopem. Zebrać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, 12 ml / probówkę.
7. Kriokonserwować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, a następnie szybko rozmrażać w temperaturze 37 °C. Powtarzać 3 razy, aż cząsteczki wirusa zostaną uwolnione z komórek.
8. Wirować przy 240 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
9. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność, 12 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Leczenie krwi pełnej buforem do lizy czerwonych krwinek

1. Dodać 0,5 ml krwi pełnej antykoagulowanej przez EDTA·K₂ do probówki o pojemności 15 ml.
2. Umieść 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (przefiltrowanego przez filtr 0,22 μm i rozmrożonego do temperatury pokojowej przed użyciem) do pełnej krwi i dobrze wymieszaj. Umieść mieszaninę w temperaturze pokojowej na 4 minuty. Następnie szybko dodaj 5 - 7 ml 1x PBS do zatrzymania reakcji.
3. Wirować przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Białe krwinki wytrącą się na dnie probówki.
4. Odrzucić sklarowany osad i przepłukać osad, dodając 7 ml pożywki zasadowej o objętości 1640. Wirować przez 5 minut przy 240 x g w temperaturze pokojowej. Powtórz dwa razy.
5. Zawiesić osad komórkowy w pożywce transformacyjnej o pojemności 300 μl (pożywka RPMI 1640, zawierająca 20% płodowej surowicy bydlęcej i 10 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA)).

3. Zakażenie EBV

1. Dodać 60 μl 20 μg/ml cyklosporyny A (CsA) do zawiesiny komórek.
2. Szybko rozmrozić podwielokrotność EBV w temperaturze 37 °C. Dodać 240 μl EBV do zawiesiny komórek.
3. Dobrze wymieszać i umieścić zawiesinę komórek na 96-dołkowej płytce, 200 μl na studzienkę. Aby uniknąć parowania, dodaj 200 μl 1x PBS do każdego dołka wokół 96-dołkowej płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.

4. Ekspansja i kriokonserwacja B-LCL

1. Zmieniaj połowę pożywki raz w tygodniu przez pierwszy miesiąc po zakażeniu EBV. Tylko gruba warstwa fragmentów komórek jest widoczna pod mikroskopem w 7 dniu (ryc. 2). Po miesiącu od zakażenia EBV skupiska komórek limfoblastoidalnych są widoczne pod grubą warstwą fragmentów komórek pod mikroskopem (ryc. 2).
2. Zmieniaj połowę pożywki co 3 dni, aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem (ryc. 2). Zazwyczaj proces ten trwa od 10 do 20 dni.
3. Po wymieszaniu odpipetować komórki i przenieść do płytki 24-dołkowej. Podwój objętość pożywki hodowlanej za pomocą pełnego RPMI 1640, gdy zmienia kolor na żółty. Proces ten zależy od tempa wzrostu komórek.
4. Następnie przenieść komórki do kolby hodowlanej T25. Podwój objętość pożywki hodowlanej, gdy zmieni kolor na żółty, aż objętość pożywki rozszerzy się do 10 - 15 ml.
5. Zmień podłoże 24 godziny przed zamrożeniem. Zawiesinę komórek wirowych przez 5 minut przy 240 x g. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zamroź w gęstości 5 - 10 x 10⁶/ml w zamrożonym roztworze podstawowym zawierającym 90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrażać w tempie od 1 °C na minutę do -80 °C, a następnie przenieść bezpośrednio do ciekłego azotu.

5. Test bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT)¹⁷

1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową B-LCL z pożywką 1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej. Wysiewaj 3 x 10⁴ komórki na studzienkę na 96-dołkową płytkę, 100 μl na dołek.
2. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C na 12 - 16 godzin.
3. Dodać MTT (5 mg/ml) do studzienek, w których rosną komórki, i trzymać z dala od światła przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
4. Odwirować płytkę komórkową przez 10 minut przy 168 x g.
5. Usunąć supernatant i dodać 100 μl DMSO na dołek.
   UWAGA: Bądź ostrożny. Nie dotykaj kryształków barwnika w kształcie igieł.
6. Potrząsaj płytką przez 10 minut na niskich obrotach, aby całkowicie rozpuścić kryształy.
7. Zmierzyć absorpcję przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami.

Wyniki

Podczas procesu transformacji, zmiany morfologiczne komórek są wizualizowane za pomocą mikroskopii świetlnej (Rysunek 2). Małe skupiska komórek były wyraźnie widoczne metodą separacji gradientu gęstości po 7 dniach od zakażenia, podczas gdy metoda lizy czerwonych krwinek widoczna jest tylko gruba warstwa fragmentów komórek. Jednak skupiska komórek limfoblastoidalnych są widoczne pod grubą warstwą fragmentów komórek 30 dni po zakażeniu. Przy częstszej zmianie pożywki szczą...

Dyskusja

Informujemy o opracowaniu nowatorskiej metody unieśmiertelniania ludzkich limfocytów B z krwi pełnej poprzez lizę czerwonych krwinek, a jej żywotność komórkową ustalonych B-LCL oceniono za pomocą testu MTT. Wyniki wykazały, że żywotność komórek B-LCL ustalona metodą lizy krwinek czerwonych jest znacznie wyższa niż w przypadku metody separacji w gradieniu gęstości. Główną zaletą metody lizy krwinek czerwonych jest to, że jest prosta i wymaga niewielkiej objętości (zaledwie 0,5 ml) krwi w celu ustanowienia trwałej linii ko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka	Techcomp	CT6T	Wirowanie
Automatyczny licznik komórek	Hrabia	IC 1000	Do zliczania komórek
Spektrofotometr Epoch	Microplate BioTek Instruments	SN263839	Do pomiaru absorbancji
96-dołkowy klaster kultur komórkowych	Corning Incorporated	3599	Płytki polistyrenowe
24-dołkowy klaster kultur komórkowych	Corning Incorporated	3524	Płytki polistyrenowe
25 cm2 kolba do hodowli komórkowych	Gniazdo	707001	Polistyren& nbsp;
FBS	Gibco	10270	Składnik B-LCL medium
RPMI Medium 1640	Gibco	31800-022	Dla B-LCL medium
L-glutamina	Amresco	0374	Składnik pożywki B-LCL
100x streptomycyna roztwór penicyliny BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Składnik B-LCL medium
Ficoll paque plus	GE  Opieka zdrowotna	17-1440-03	Do izolacji in vitro limfocytów
PHA-M	Sigma	L8902	Do stymulacji proliferacji limfocytów
Cyklosporyna A	Cayman  Chemiczny	12088	Do hamowania efektu cytotoksyczności limfocytów T
Bufor do lizy krwinek czerwonych	Tiangen	RT122-01	Do lizy czerwonych krwinek
MTT	Amresco	0793	Do wykrywania żywotności komórek
DMSO	Sigma	D2650	Do zamrażania komórek