Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55192

⸱

14 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

W tym artykule

Podsumowanie

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Metoda ta opisuje izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej, a także identyfikację ich potencjału migracyjnego w próbkach surowicy pacjentów kardiochirurgicznych.

Streszczenie

Komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) są rekrutowane ze szpiku kostnego w warunkach patologicznych, takich jak niedotlenienie, i są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Pochodzenie, klasyfikacja i charakterystyka świadectw charakterystyki energetycznej są złożone; niezależnie od tego ustanowiono dwa główne podtypy świadectw charakterystyki energetycznej: tak zwane "wczesne" świadectwa charakterystyki charakterystyki energetycznej (zwane później wczesnymi świadectwami charakterystyki energetycznej) i późne świadectwa charakterystyki charakterystyki energetycznej (późne świadectwa charakterystyki energetycznej). Można je sklasyfikować ze względu na właściwości biologiczne, a także ze względu na ich pojawienie się podczas hodowli in vitro. Podczas gdy "wczesne" EPC pojawiają się w czasie krótszym niż tydzień po posiewie komórek jednojądrzastych pochodzących z krwi obwodowej w pożywkach specyficznych dla EC, późne EPC wzrostu można znaleźć po 2-3 tygodniach. Uznano, że EPC późnego wzrostu są bezpośrednio zaangażowane w neowaskularyzację, głównie poprzez ich zdolność do różnicowania się w dojrzałe komórki śródbłonka, podczas gdy "wczesne" EPC wyrażają różne czynniki angiogenne jako ładunek endogenny w celu promowania angiogenezy w sposób parakrynny. Podczas niedokrwienia/reperfuzji mięśnia sercowego (I/R) różne czynniki kontrolują naprowadzanie EPC do regionów tworzenia naczyń krwionośnych.

Czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF) jest chemokiną prozapalną i powszechnie eksprymowaną cytokiną, a ostatnio opisano ją jako kluczowy regulator migracji EPC w stężeniach fizjologicznych1. Co ciekawe, MIF jest przechowywany w pulach wewnątrzkomórkowych i może być szybko uwalniany do krwiobiegu po kilku bodźcach (np. zawale mięśnia sercowego).
Protokół ten opisuje metodę wiarygodnej izolacji i hodowli wczesnych EPC z krwi obwodowej dorosłego człowieka w oparciu o selekcję CD34-dodatnią z późniejszą hodowlą w pożywce zawierającej śródbłonkowe czynniki wzrostu na płytkach pokrytych fibronektyną do stosowania w testach migracji in vitro przeciwko próbkom surowicy pacjentów kardiochirurgicznych. Ponadto wykazano migracyjny wpływ MIF na chemotaksję EPC w porównaniu z innymi dobrze znanymi cytokinami stymulującymi angiogenezę.

Wprowadzenie

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) krążą w ludzkiej krwi i mają zdolność różnicowania się w komórki śródbłonka2. Uczestniczą w unaczynieniu i są w stanie zminimalizować uszkodzenia spowodowane stanem zapalnym i urazami niedokrwiennymi/reperfuzyjnymi (I/R) na różne sposoby3,4. Na przykład EPC wykazują podwyższony poziom wewnątrzkomórkowych enzymów przeciwutleniających, takich jak katalaza, peroksydaza glutationowa lub dysmutazy ponadtlenkowe manganu (MnSOD)5. Podwyższona odporność na stres oksydacyjny pozwala EPC funkcjonować w mikrośrodowiskach z podwyższonymi reaktywnymi formami tlenu (ROS) po urazie niedokrwiennym6. Wcześniejsze badania wykazały również, że liczba EPC może być skorelowana z naprawą naczyń krwionośnych i że zmniejszona liczba krążących EPC przewiduje wystąpienie zdarzeń sercowo-naczyniowych7,8. Nie znaleziono jednak jeszcze jasnej definicji świadectwa charakterystyki energetycznej. Do tej pory nie ma specyficznego markera powierzchni komórki ani spójnego fenotypu dla EPC, a komórki te są bardzo rzadkie w krwi obwodowej 9. Ludzkie EPC należy traktować jako krążącą komórkę posiadającą zdolność do przyczyniania się do odbudowy uszkodzonego śródbłonka i nowych struktur naczyniowych.

Jednym ze sposobów izolowania i charakteryzowania EPC jest adhezja do fibronektyny. W ten sposób pojemność tych komórek jest wykorzystywana do wykazywania lepszej przyczepności do naczyń pokrytych fibronektyną w porównaniu z kolagenem typu 1, na przykład3,10,11. Jednak inni odkryli, że posiewanie komórek jednojądrzastych na naczyniach pokrytych fibronektyną bez wcześniejszego lub dalszego etapu oczyszczania prowadzi do powstania kolonii, w tym mieloidalnych komórek progenitorowych, monocytów i limfocytów T12,13,14. Co więcej, w tym przypadku płytki krwi mogą zanieczyścić frakcję komórki jednojądrzastej (MNC), a tym samym przenieść białka błony komórkowej do dowolnych przylegających komórek15.

Oprócz charakterystyki za pomocą testów adhezyjnych in vitro, kombinacja różnych markerów powierzchni komórki jest używana do opisania typu komórki uważanego za EPC. W tym przypadku, po adhezji za pośrednictwem fibronektyny, komórki są analizowane pod kątem ich cech podobnych do śródbłonka. W tym procesie rolę odgrywają dwa markery związane z komórkami śródbłonka, lipoproteina acetylowana o niskiej gęstości (acLDL) i receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR-2, KDR). Wykazano, że komórki śródbłonka i makrofagi specyficznie pobierają acLDL w procesie zwanym "szlakiem komórek zmiatających"16. Innym białkiem markerowym jest KDR jako główny receptor VEGF na komórkach śródbłonka17. Jednakże, ponieważ EPC na ogół są hodowane w pożywkach uzupełnionych śródbłonkowymi czynnikami wzrostu i płodową surowicą cielęcą, możliwe jest, że makrofagi, które również mogły zostać błędnie wyizolowane, wykazują profil markerowy podobny do śródbłonka. Jak wykazano wcześniej, makrofagi hodowane w pożywce kondycjonowanej śródbłonkiem wykazują ekspresję białek "specyficznych dla śródbłonka"18.

Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie kategorie EPC w ramach większej liczby podtypów, które można znaleźć we krwi lub hodować in vitro. Późne EPC (późne EPC) pojawiają się po 2-3 tygodniach hodowli. Komórki te są szybciej integrowane z monowarstwą ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej i mogą tworzyć rurki kapilarne19. Poza tym tak zwane "wczesne EPC" krążą we krwi przez około tydzień i działają w bardziej pasywny sposób poprzez dostarczanie cząsteczek angiogennych, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) lub CXCL819. Pacjenci z chorobą wieńcową (CAD) wykazywali znacznie mniejszą ilość wczesnych EPC w porównaniu z grupą kontrolną bez CAD20. Co ciekawe, ta sama grupa wykazała większą ilość późnych EPC w porównaniu z grupą kontrolną. Inne badanie wykazało, że wczesne EPC chronią zróżnicowane EPC przed apoptozą w warunkach utleniania w sposób parakrynny6. W związku z tym wczesne EPC mogą zapewniać odpowiednie efekty ochronne poprzez migrację innych komórek w sposób auto- lub parakrynny we krwi obwodowej.

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania wczesnych EPC poprzez najpierw izolację frakcji PBMC z ludzkiej krwi obwodowej, a następnie izolację komórek CD34+ od frakcji PBMC, aby usunąć tę zawiesinę komórek z niechcianych komórek. CD34 jest markerem, który jest używany do izolacji ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych9. Następnie komórki CD34 + są hodowane na powierzchniach hodowli tkankowych pokrytych fibronektyną. Po trzech dniach podłoże jest zmieniane, tracąc w ten sposób wszystkie nieprzylegające komórki. Na koniec izolowane EPC są barwione w celu zweryfikowania wychwytu acLDL i obecności KDR jako markera komórek śródbłonka za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Jako dodatkowy marker przeanalizowaliśmy cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka płytek krwi (PECAM-1, CD31), która występuje również na komórkach śródbłonka.

Odbudowa uszkodzonej lub zawałowej tkanki mięśnia sercowego poprzez zwiększoną rekrutację EPC należy do intensywnie badanych strategii leczenia chorób sercowo-naczyniowych. Jednak przełożenie wyników eksperymentalnych na praktykę kliniczną jest nadal trudne, biorąc pod uwagę złożone interakcje komórkowe w ludzkim ciele w różnych stanach patofizjologicznych. Co więcej, urazy I/R mięśnia sercowego wywołują nadmierne wydzielanie różnych cytokin, hormonów i czynników wzrostu, które kontrolują naprowadzanie EPC do regionów tworzenia naczyń krwionośnych13. Jak już pokazano, CXCL8, czynnik 1α pochodzący z komórek zrębu (SDF-1α, CXCL12), VEGF i czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF) są znacznie zwiększone w próbkach surowicy po uszkodzeniu mięśnia sercowego I/R1. Wśród tych czynników MIF jest plejotropową cytokiną podobną do chemokiny o przeważających cechach prozapalnych. W przeciwieństwie do swojej historycznej nazwy, MIF pełni funkcje promigracyjne, działając jak prawdziwa chemokina na różne typy komórek1,21,22. Procesy rekrutacji komórek za pośrednictwem MIF zostały powiązane z receptorami chemokiny CXCR2 i CXCR4, z którymi MIF wiąże się i aktywuje w sposób niepokrewny21. Warto zauważyć, że EPC wyrażają oba te receptory na swojej powierzchni, które dodatkowo stają się regulowane w górę w warunkach niedotlenienia23,24. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że MIF ma ogólne działanie kardioprotekcyjne podczas uszkodzenia I/R serca22,25,26. W tym kontekście wykazano ponadto, że MIF może wspierać neowaskularyzację podczas stresu hipoksyjnego, co ma szczególne znaczenie, biorąc pod uwagę ograniczone mechanizmy rekonwalescencji uszkodzonego mięśnia sercowego27. Wcześniejsze badania in vitro i eksperymenty na przedklinicznych modelach mysich dostarczyły pierwszych dowodów na rolę MIF w rekrutacji EPCs4. Warto zauważyć, że MIF jest również znaczącym białkiem ładunkowym EPC, które może być uwalniane podczas rekrutacji EPC w miejscach niedokrwiennych28. Jednak badania w warunkach klinicznych, w szczególności w porównaniu z innymi (angiogennymi) cytokinami surowicy, pozostają nieuchwytne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Krew do izolacji EPC pozyskano od zdrowych ochotników po uzyskaniu świadomej zgody, zgodnie z wytycznymi lokalnego komitetu etyki. Próbki surowicy wykorzystane w testach migracyjnych pobrano od pacjentów poddanych konwencjonalnej operacji kardiochirurgicznej z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego (CPB). Kryteria wykluczenia obejmowały operacje w trybie nagłym, stwierdzoną lub podejrzewaną ciążę, wiek pacjenta poniżej 18 lat oraz brak uzyskania świadomej zgody. Próbki surowicy pobierano dodatkowo do rutynowych pomiarów klinicznych (bezpośrednio przed operacją i bezpośrednio po reperfuzji mięśnia sercowego/otwarciu zacisku aorty), a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu końcowej analizy. Badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną (Komitet Etyki Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie). Średni wiek pacjentów wynosił 68,6 lat, a średnia masa ciała 81,7 kg. Choroby współistniejące obejmowały: nadciśnienie tętnicze (65%), przewlekłą chorobę płuc (19%), pozasercową arteriopatię (16%), dysfunkcję mózgu (6%), niestabilną dławicę piersiową (3%), niedawny zawał mięśnia sercowego (28% w ciągu 90 d), przewlekłą chorobę nerek (14%), choroby wątroby (2%) oraz cukrzycę (34%).

1. Powlekanie kolby T75:

  1. Przygotować 5 mL roztworu fibronektyny (1 mg ludzkiej fibronektyny rozpuszczonej w 15 mL wody ultraczystej) na każdą kolbę T75.
  2. Dodać roztwór do kolby T75 i odczekać do odparowania wody. Aby uniknąć niepotrzebnych przerw w procesie izolacji spowodowanych odparowaniem, należy przeprowadzić ten etap z wyprzedzeniem (np. przez noc) w temperaturze pokojowej. Roztwór ten zapewnia stężenie 4,4 µg fibronektyny/cm2.
  3. Przygotować pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka MV2, uzupełniając podstawową pożywkę MV2 dodatkami czynników wzrostu dostarczonymi przez producenta.

2. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka (EPCs) z 60 mL krwi:

UWAGA: Ponieważ koktajl do selekcji pozytywnej CD34 oraz kulki magnetyczne są dostępne komercyjnie w formie połączonego zestawu do selekcji, producent nie podaje ich stężeń. Jednakże, około 100 µL przeciwciała są wystarczające do przetworzenia do 5 x 108 komórki. Kuleczki magnetyczne są rozcieńczone w wodzie, powleczone dekstranem i około 50 razy mniejsze w porównaniu do innych dostępnych w handlu kuleczek. Dalsze informacje znajdują się w instrukcji producenta.

  1. Zmieszać krew (z przeciwkrzepliwymi lub bez nich) w stosunku 1:1 z PBS wolnym od Ca2+-Mg2+.
  2. Do każdej probówki 50 mL dodać 15 mL roztworu gradientu gęstości. Więcej informacji znajduje się w instrukcji producenta.
  3. Powoli nanieść rozcieńczoną krew na powierzchnię roztworu gradientu gęstości.
  4. Wirować próbki przy 2,50 x g przez 30 min z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania.
  5. Ostrożnie zebrać warstwę leukocytarną (buffy coat) z każdej probówki (Rysunek 1) za pomocą sterylnej plastikowej pipety i przenieść ją do innej probówki. Należy unikać pobierania roztworu gradientu gęstości. Przewidywana wydajność PBMC wynosi około 3-4 x 106 komórek/mL krwi.

Schemat izolacji warstwy leukocytarnej (buffy coat) z opisami: plazma, PBMC, Ficoll, granulocyty, erytrocyty.
Rysunek 1: Wirowanie w gradiencie gęstości warstwy leukocytarnej (buffy coat) na roztworze Ficoll. Przedstawiono wynik wirowania w gradiencie gęstości przy 250 x g przez 30 min w roztworze gradientu gęstości. Widoczne są erytrocyty i granulocyty (kolor czerwony), frakcja mononuklearnych komórek krwi (warstwa biała), osocze (kolor żółty) oraz roztwór gradientu gęstości (kolor białawy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Rozcieńczyć frakcję mononuklearnych komórek krwi obwodowej co najmniej 3 objętościami PBS i wymieszać. Odwirować w temperaturze pokojowej przez 15 min przy 20 x g.
  2. Powtórzyć krok 2.6 dwukrotnie.
  3. Odssać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 5 mL pożywki MV2.
  4. Dodać 10 µL przeciwciała anty-CD34 człowieka (ilość wystarczająca do przetworzenia do 5 x 108 komórek) na każdą wykorzystaną warstwę leukocytarną i inkubować w rotatorze przez 15 min w 37 °C przy 5% CO2.
  5. Dodać 50 µL magnetycznych kulek pokrytych dekstranem na każdą wykorzystaną warstwę leukocytarną i inkubować w rotatorze przez 10 min w 37 °C przy 5% CO2.
  6. Po inkubacji przenieść zawiesinę do probówek FACS, wlewając maksymalnie 3 mL do każdej probówki. Większe objętości nie będą możliwe do zastosowania z magnesem.
  7. Włożyć probówki FACS do magnesów i odczekać 5 min.
  8. Usunąć nadsącz, nie wyjmując probówek FACS z magnesów.
  9. Resuspender komórki w każdej probówce FACS w 3 mL pożywki MV2 poza magnesem.
  10. Powtórzyć kroki 2.12-2.14 dwukrotnie.
  11. Wyjąć probówki FACS z magnesów i resuspender komórki w 3 mL pożywki MV2.
  12. Przenieść zawiesinę komórkową do uprzednio pokrytych kolb T75 i dodać 17 mL pożywki MV2 na każdą kolbę.
    UWAGA: Pożywkę należy wymienić po 3 dniach. Po jednym tygodniu komórki wykazują struktury wrzecionowate (Rycina 2) i są gotowe do użycia. Przegląd procesu izolacji przedstawia Rycina 3.

Obraz mikroskopowy morfologii komórek; pasek skali 40 µm; analiza struktury komórkowej.
Rycina 2: Obraz mikroskopowy wyizolowanych EPC. Przedstawiono reprezentatywny obraz izolowanych wczesnych EPC w kolbie T75 przed odczepieniem. Widoczna jest wrzecionowata struktura EPC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat procesu frakcjonowania krwi, przedstawiający etapy wirowania i izolacji PBMC w celu uzyskania komórek progenitorowych.
Rycina 3: Schemat blokowy przedstawiający procedurę izolacji EPC. Przedstawiono schemat obrazujący poszczególne etapy protokołu izolacji EPC. Bardziej szczegółowy protokół znajduje się w sekcji 2 w części dotyczącej protokołu.

3. Test migracji

  1. Usunąć medium z EPC w kolbie T75.
  2. Przemyć 5 mL PBS, ostrożnie wstrząsając kolbą.
  3. Usunąć PBS i dodać 5 mL komercyjnego roztworu do odrywania komórek. Odczekać do momentu odrycia się komórek (sprawdzić pod mikroskopem). Przyspieszyć proces odrywania, delikatnie opukując dno kolby.
  4. Po odryciu komórek szybko dodać 5 mL kompletnego medium MV2 i przenieść zawiesinę komórkową do innej probówki.
  5. Wirować przy 2,0 x g przez 5 min.
  6. Resuspendować komórki w 5-10 mL PBS i ponownie wirować przy 2,0 x g przez 5 min.
  7. Powtórzyć krok 3.6.
  8. Resuspendować osad komórkowy w medium MV2 z ograniczeniem podaży składników odżywczych (wymagane jest 50,0 komórek w 75 µL na studzienkę transmigracyjną).
    UWAGA: Wybór systemu migracyjnego zależy od typu komórek i rodzaju analizy. Dostępne są różne średnice porów i rozmiary płytek (liczba studzienek). Dla EPC optymalny jest rozmiar porów 5 µm w systemie 96-dołkowym.
  9. Przygotować płytkę migracyjną, dodając 235 µL próbki surowicy (surowica rozcieńczona 1:5 w medium MV2 z ograniczeniem podaży składników odżywczych) do dolnej komory (Rysunek 4).

Schemat eksperymentu migracji komórek, symbol Δt, EPC przechodzące przez system filtracyjny, komory górna/dolna.
Rysunek 4: Test migracji w zmodyfikowanej komorze Boydena. Przedstawiono ogólny schemat zmodyfikowanej komory Boydena. Wkładki do hodowli komórkowej (= komora górna) są zaznaczone kolorem ciemnoniebieskim i zostały umieszczone w komorze dolnej. Dno (ale nie ścianki) tych wkładek stanowi system filtracyjny zawierający pory.a) Przedstawia układ w punkcie czasowym zero. (bPo upływie wybranego punktu czasowego komórki migrują przez filtr w kierunku bodźca. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Włóż wkład krótko przed dodaniem zawiesiny komórkowej.
  2. Do górnej komory dodaj 75 µL zawiesiny komórkowej (= 50 00 komórek).
  3. Pozostaw EPC do migracji przez 3 h w temperaturze 37 °C i przy 5 % CO2 (czas migracji zależy od typu komórek i systemu).
    1. Aby uniknąć artefaktów autofluorescencji surowicy, ilościowo określ zmigrowane komórki, wykonując zdjęcia studni pod mikroskopem, a następnie policz komórki przy użyciu półautomatycznego oprogramowania „ImageJ”.
  4. Usuń górną komorę (zawierającą wszystkie komórki, które nie zmigrowały).
  5. Dodaj 70 µL 3,6% roztworu paraformaldehydu z dodatkiem barwnika Hoechst (rozcieńczonego 1:1 0). Płytkę można przechowywać przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  6. Krótko odwiruj płytkę przy 2 0 x g przez 1-2 min, aby wszystkie komórki znalazły się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania.
  7. Wykonaj 5 zdjęć na studnię (Rysunki 5 oraz 6) przy powiększeniu 10x.

Schemat szalki Petriego z koloniami bakterii; układ testu wrażliwości na antybiotyki.
Rysunek 5: Schemat przedstawiający rozmieszczenie wykonanych zdjęć. Schemat przedstawia położenie pięciu wykonanych zdjęć, niezbędnych do oznaczenia komórek migrujących, w odniesieniu do dołka. Zdjęcia wykonuje się w celu policzenia komórek i obliczenia wartości średniej dla każdego dołka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego, komórki barwione DAPI, wizualizacja jąder komórkowych, badanie z zakresu biologii komórki.
Rysunek 6: Obraz mikroskopowy do ilościowej oceny komórek. Przedstawiono reprezentatywny obraz, który został wykonany w celu kwantyfikacji komórek. Komórki barwiono i utrwalono przy użyciu barwnika Hoechst w 3,6% paraformaldehydzie. Kropki reprezentują utrwalone i zabarwione komórki progenitorowe śródbłonka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Policz migrujące komórki, korzystając z półautomatycznego oprogramowania „ImageJ” opracowanego przez National Institute of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka wyizolowanych komórek progenitorowych śródbłonka

Najpierw zweryfikowano wchłanianie acLDL oraz ekspresję KDR i CD31 na powierzchni wyizolowanej populacji komórek. Jak pokazano na ryc. 7a, 85,1% wyizolowanych EPC wykazywało wchłanianie acLDL i ekspresję CD31. Ryc. 7b i 7c dodatkowo przedstawiają jednorodny rozkład obu markerów, choć istnieje mniejsza populacja ujemna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwsza część tego badania obejmowała izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej zdrowych ochotników, aby umożliwić kompleksową ocenę krwi pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych. W związku z tym przeprowadzono wirowanie w gradiencie gęstości w celu oddzielenia frakcji PBMC od osocza, granulocytów i erytrocytów. Aby usunąć większość zanieczyszczających płytek krwi, tę frakcję komórkową poddano krótkim i powolnym etapom płukania 29,30. Następnie komórki CD34

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FibronektynaBiochrom AGL7117Powłoka kolb T-75
Aqua ad iniectabiliaFresenius Kabi
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV2Promo CellC-22221
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV2 SupplementMixPromo CellC-39226
Ficoll-Paque plusGE Healthcare17-1440-03Wirowanie gęstości
EasySep ludzki CD34 dodatni zestaw selekcyjnyStemcell Technologies18056Izolacja komórek CD34+
Magnes EasySepStemcell Technologies18000
AccutaseSigma-AldrichA6964-100MLOdwarstwienie komórek
Corning HTS transwell 96 dobrze przepuszczalne podporySigma-AldrichCLS3387-8EASystem migracji
Rozwiązanie HoechstThermoFisher33342Barwienie migrowanych komórek
ImageJNarodowe instytuty zdrowiaxxxLiczenie migrowanych komórek

Bibliografia

  1. Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
  2. Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  4. Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
  5. Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
  6. Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
  7. Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
  8. Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
  9. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692(2012).
  10. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  11. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  12. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  13. Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
  14. Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
  15. Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
  16. Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
  17. Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502(2012).
  18. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  19. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  20. Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015(2015).
  21. Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
  22. Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
  23. Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310(2013).
  24. Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
  25. Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
  26. Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
  27. Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
  28. Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
  29. Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
  30. Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
  31. Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
  32. Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
  33. Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
  34. Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
  35. Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
  36. Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
  37. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  38. Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
  39. Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
  40. Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
  41. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
  42. Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
  43. Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
  44. White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Selekcja pozytywna CD34mononuklearne komórki krwi obwodowejtest migracji komórekanaliza próbek surowicypłytki powlekane fibronektynąseparacja koralikami magnetycznymipożywka do wzrostu komórek śródbłonkaocena potencjału migracyjnegoanaliza cytokin w surowicy
Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.