W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W sercu, badania sygnalizacji molekularnej są zwykle wykonywane w izolowanych miocytach. Jednak wiele patologicznych sytuacji, takich jak niedokrwienie i arytmie, można w pełni zrozumieć tylko na poziomie całego narządu. W tym miejscu przedstawiamy technikę spektroskopową mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego (LFFM), która pozwala na pomiar sygnałów komórkowych w nienaruszonym sercu. Technika ta opiera się na połączeniu perfundowanego serca Langendorffa i światłowodów do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych. LFFM ma różne zastosowania w dziedzinie fizjologii układu krążenia do badania serca w normalnych i patologicznych warunkach. Wiele zmiennych sercowych może być monitorowanych za pomocą różnych wskaźników fluorescencyjnych. Należą do nich cytozolowy [Ca2+], retikulum wewnątrzsarkoplazmatyczne [Ca2+] i potencjały błonowe. Egzogenne sondy fluorescencyjne są wzbudzane, a emitowana fluorescencja wykrywana za pomocą trzech różnych układów technik epifluorescencji LFFM przedstawionych w tym artykule. Główne różnice między tymi technikami to rodzaj źródła światła używanego do wzbudzenia oraz sposób modulacji światła wzbudzenia. Impulsowy LFFM (PLFFM) wykorzystuje impulsy światła laserowego, podczas gdy LFFM o fali ciągłej (CLFFM) wykorzystuje ciągłe światło laserowe do wzbudzenia. Wreszcie jako trzecie źródło światła zastosowano diody elektroluminescencyjne (LED). Ten niekoherentny układ nazywa się pulsacyjną mikroskopią fluorescencyjną LED (PLEDFM).
Wprowadzenie
Serce jest centralnym organem układu sercowo-naczyniowego. Skurcz serca jest inicjowany przez wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2+]. Związek między pobudliwością elektryczną a zmianami w wewnątrzkomórkowym uwalnianiu Ca2+ był historycznie badany w komórkach zdysocjowanych enzymatycznie1,2. Jednak komórki serca są sprzężone elektrycznie, metabolicznie i mechanicznie3,4. Po wyizolowaniu miocyty są nie tylko fizycznie rozłączone, ale miocyty z różnych warstw są mieszane podczas dysocjacji5. Ponadto, pomimo ogromny....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół i sposób postępowania z myszami został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UC Merced Institutional Animal Care and Use Committee (nr 2008-201). Eksperymenty z papugami przeprowadzono w 1999 r. zgodnie z ogólnymi zasadami dotyczącymi wykorzystywania zwierząt ustanowionymi przez komisję naukową Wenezuelskiego Instytutu Badań Naukowych (IVIC).
1. Langendorff Przygotowanie do konfiguracji
- Przygotować roztwór Tyrode zawierający następujące stężenia substancji rozpuszczonej w mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na2HPO4, 10 glukozy, 10 HEPES. Do....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przejściowe zmiany AP i Ca2+ w endokardium i epikardium
Aby porównać sygnały z całej ściany komory, jedno światłowody umieszcza się w endokardium, a drugie w epikardium. Porównanie morfologii potencjału czynnościowego (AP) zarejestrowanego z endokardium z potencjałem z epikardium jest najlepszym sposobem oceny funkcji transmuralnej. Ściana komory jest silnie heterogenna,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsza praca koncentruje się na opisie technik fluorescencji pola lokalnego w celu oceny funkcji miocytów serca ex vivo. Badanie tych komórek w sprzężonym środowisku jest nie tylko bardziej fizjologiczne, ale jest również wysoce odpowiednie do oceny patologii na poziomie narządów. Zdarzenia komórkowe leżące u podstaw sprzężenia pobudzenia-skurczu (ECC) mogą być oceniane na poziomie całego narządu za pomocą sond molekularnych, które monitorują wewnątrzkomórkową dynamikę Ca2 + (Rhod 2 cytozol Ca.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy dr Alicii Mattiazzi za krytyczną dyskusję na temat prezentowanej pracy. Praca ta została wsparta grantem z NIH (R01 HL-084487) dla ALE.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glukoza | Sigma | 50-99-7 | |
| Chlorek potasu | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Fosforan sodu | Sigma | 10049-21-5 | |
| Roztwór chlorku wapnia | Sigma | 10043-52-4 | |
| Roztwór chlorku magnezu | Sigma | 7786-30-3 | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma | S-8045 | |
| 0,2 μ m Filtr membranowy | nylonowy Whatman | 7402-004 | |
| Rozdzielacz MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precyzyjna igła ślizgowa | BD | 305167 | |
| pleciony jedwabny sznurek (niewchłanialny szew chirurgiczny) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparyna sodowa do wstrzykiwań 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% roztwór | Biotium | 59004 | |
| Pompa perystaltyczna Materflex C/L | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Stymulator izostymu | World Precision Instruments | A320RC | |
| Generator przebiegów | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Myjka ultradźwiękowa FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Rurka Tygon ID: 1/32 " OD: 3/32 " Ściana 1/32 " | Zasilanie komponentów | TET-031A Średnica wewnętrzna rurki | |
| Tygon: 3/32 " OD: 5/32 " Ściana 1/32 " | Dostawa komponentów | TET-094A | |
| Adapter luer lock do zaworu 3-drogowego | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Adaptery trójnikowe i złączki z tworzywa sztucznego | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Zacisk plastikowy | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Igły do akupunktury | LHASA | TC1.20x13 | |
| Strzykawka 60 ml BD z luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Cyfrowy obwód przetwarzania sygnału DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Lustro dichroiczne 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Obiektyw 10X NA 0,25 DIN AchromatycznyFinite Intl Standard Obiektyw | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Obiektyw 20X NA 0,40 DIN Achromatyczny skończony Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass kolorowy filtr szklany 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Zielony laser Nd-YAG 532 nm, 500 mW | |||
| Mikromanipulator do lasera | Siskiyou | MX130R | |
| Światłowód wielomodowy 200 µ m NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LED niebieskie | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| Diody LED zielone | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Rozdzielacz wiązki Cube niepolaryzacyjny | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Długość, jaskółczy ogon Szyna optyczna | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Szerokość, Nośnik na jaskółczy ogon | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0,75" Podróż, stolik mikrometryczny | Edmund Optics | 37-983 | |
| Szyna optyczna na jaskółczy ogon 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Uchwyt szyny na jaskółczy ogon 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Fotodioda lawinowa Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Uchwyt obiektywu XY Translator& nbsp; | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminiowa płytka stykowa 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus stół otwarty 4' x | 6'ThorLabs | T46HK | |
| z walcowym ze stali nierdzewnej | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Arkusz akrylowy | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Zestaw elastomerów silikonowych | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Żel epoksydowy | Walmart / Home Depot | 2-częściowy 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precyzyjna igła ślizgowa | B-D | 305167 | |
| 23G Precyzyjna igła ślizgowa | B-D | 305145 | |
| Podstawa montażowa, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Półki druciane 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Półki druciane | Alera | ALESW582424SR | |
| Zacisk słupkowy i kątowy | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Szklana strzykawka do komory barwienia | Wheaton | W851020 | |
| Gumowy korek | Strona główna Narzędzia naukowe | CE-STOP01C |
Bibliografia
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
