Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55204

⸱

24 lutego 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Streszczenie

Kardiomiocyty są podatne na zmiany cyklu komórkowego, takie jak endoreduplikacja (ciągłe rundy syntezy DNA bez kariokinezy i cytokinezy) i mitoza acytokinetyczna (kariokineza, ale bez cytokinezy). Takie nietypowe zmiany cyklu komórkowego skutkują powstawaniem komórek poliploidalnych i wielojądrowych, a nie podziałem komórkowym. Dlatego, aby określić obrót i regenerację serca, kluczowe znaczenie ma prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów, liczby jąder w komórce i stanu ich cyklu komórkowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego, takich jak analogi tymidyny Ki-67, PCNA lub pHH3. W tym miejscu przedstawiamy metody rozpoznawania kardiomiocytów i ich jądrowości oraz określania ich aktywności cyklu komórkowego. Używamy dwóch opublikowanych systemów transgenicznych: transgenicznej linii myszy Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz linii myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego. Połączone razem, te dwa systemy ułatwiają badanie regeneracji i plastyczności serca.

Wprowadzenie

Prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów i stanu cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla określenia obrotu i regeneracji mięśnia sercowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych, takich jak pHH3, Ki-67 lub analogi tymidyny, do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego. Ponieważ zdolność proliferacyjna kardiomiocytów dorosłych ssaków jest bardzo mała1, fałszywa identyfikacja jądra dodatniego dla markera proliferacji jądra kardiomiocytów może mieć decydujące znaczenie dla wyniku testu proliferacji. Co więcej, kardiomiocyty są podatne na zmiany w cyklu komórkowym, takie jak endoreduplikacja i mitoza acytokinetyczna, które skutkują powstawaniem komórek poliploidalnych i wielojądrowych, a nie podziałem komórkowym. W tym celu interpretacja barwienia przeciwciałami przeciwko powszechnym markerom cyklu komórkowego nie jest rozstrzygająca we wszystkich przypadkach.

Tutaj prezentujemy metody prostego rozpoznawania mysich kardiomiocytów i ich nujawności w natywnych izolowanych komórkach i grubych skrawkach tkanek w stadium postnatalnym i dorosłym poprzez jednoznaczną identyfikację ich jąder. W tym celu wykorzystano transgeniczną linię myszy z ekspresją białka fuzyjnego składającego się z ludzkiego histonu H2B i mCherry specyficznej dla kardiomiocytów pod kontrolą promotora Myh6 (Myh6-H2B-mCh)2. Krzyżowanie tej linii myszy z linią myszy o wskaźniku proliferacji transgenicznej, w której ekspresja białka fuzyjnego eGFP-aniliny jest pod kontrolą wszechobecnego promotora aktyny kurczaka ze wzmacniaczem CMV (anilina CAG-eGFP), pozwala na określenie stanu cyklu komórkowego. Białko rusztowania anilina ulega specyficznej ekspresji w aktywnych komórkach cyklu komórkowego3, a jego różnicowa lokalizacja subkomórkowa podczas cyklu komórkowego pozwala na śledzenie na żywo postępu cyklu komórkowego z wysoką rozdzielczością M-Phase4. Dlatego podwójnie transgeniczne myszy mogą być używane do rozróżniania proliferujących kardiomiocytów od tych, które ulegają zmianom cyklu komórkowego. Okazuje się to szczególnie przydatne w badaniach przesiewowych in vitro pod kątem substancji indukujących proliferację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury tego protokołu dotyczące zwierząt były zgodne ze standardami etycznymi Uniwersytetu w Bonn i zgodne z wytycznymi z Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

1. Wizualizacja in vitro aktywności cyklu komórkowego w kardiomiocytach poporodowych

  1. Poporodowa dysocjacja kardiomiocytów
    1. Preparaty przedeksperymentalne
      1. Przygotować pożywki hodowlane (IMDM, 1% penicylina/streptomycyna, 1% aminokwasy endogenne, 0,1% β-merkaptoetanol); podłoże 1: dodać FCS do 2%; podłoże 2: dodać FCS do 20%.
      2. Pokryj 96-dołkową naczynie hodowlane (połowa obszaru wzrostu: 15 mm2) 0,1% żelatyny w roztworze PBS.
    2. Rozwarstwienie serca
      1. Przygotuj szalkę Petriego z 15 ml PBS i przechowuj ją na lodzie. Wysterylizuj dwie pęsety i małe nożyczki, umieszczając je w suchym sterylizatorze szklanych kulek.
      2. Ofiarowanie nowonarodzonych myszy transgenicznych (CAG-eGFP-anilina/Myh6-H2B-mCh) przez dekapitację. Otwórz klatkę piersiową, wypreparuj serce, jak opisano w Ehler i wsp., 2013 (J Vis Exp.; (79):50154. doi:10.3791/50154) i przenieść go do lodowatego PBS. Przejdź do następnej myszy.
      3. Jeśli używasz niehomozygotycznych par hodowlanych, zidentyfikuj transgeniczne serca za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Umieść serca w PBS pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sprawdzić ekspresję eGFP-aniliny (np.: 488 nm; Em.: 509 nm) i ekspresja H2B-mCh (Np.: 587 nm; Em.: 610 nm) z odpowiednimi zestawami filtrów.
    3. Izolacja kardiomiocytów
      1. Oddziel wybrane serca za pomocą zestawu do dysocjacji serca u noworodków. Inkubować mieszaninę enzymów 1 w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Aby uzyskać 1 ml końcowej mieszaniny enzymów, dodaj 945 μl mieszanki enzymów od 1 do 55 μl mieszanki enzymów 2.
      2. Przenieś do 4 serc od myszy P1 - P3 lub do 2 serc od myszy P4 - P6 do 1,5 ml probówki reakcyjnej zawierającej 1 ml mieszanki enzymów i pokrój serce na małe kawałki nożyczkami. Przenieść roztwór do probówek reakcyjnych o pojemności 15 ml.
      3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Aby zmaksymalizować kontakt między tkanką a enzymami, umieść probówkę o pojemności 15 ml prawie poziomo w inkubatorze. Wymieszać, pipetując 5–10 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Powtórz ten krok trzy razy.
      4. Dodać 7,5 ml pożywki 2 (20% FCS), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm. Przepłucz sitko do komórek 3 ml pożywki 2.
      5. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 × g przez 15 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 μl pożywki 1; Liza krwinek czerwonych nie jest wymagana do dalszych eksperymentów. Odpipetować 10 μl zawiesiny komórek do komory zliczania komórek i określić liczbę komórek.
      6. W przypadku płytki 96-dołkowej: wysiewać 10 000 komórek na studzienkę w 120 μl pożywki 1 (2% FCS). Umieścić komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) i natychmiast przejść do transfekcji.
  2. Transfekcja kardiomiocytów noworodków za pomocą siRNA lub miRNA
    1. Przetrzyj ławkę roztworem do odkażania RNazy, aby usunąć RNazy. Roztworem do odkażania RNazy należy oczyścić następujący materiał: pipety o pojemności 10 μl, 100 μl i 200 μl oraz pojemnik na lód. Rozmrozić podwielokrotności podstawowe siRNA (100 μM) na lodzie.
    2. Przygotować 2 μM zapasy robocze si/miRNA w zredukowanym podłożu surowicy (98 μl zredukowanej pożywki surowicy + 2 μL zapasu siRNA 100 μM). Zapas roboczy powinien być wykorzystany tego samego dnia. Zamrażanie nie jest zalecane.
    3. Dodać 4 μl 2 μM podstawowego do 6 μL zredukowanej pożywki surowicy do 0,5 ml probówki reakcyjnej (ilość na jedną 96-dołkową; końcowe stężenie si/miRNA w 140 μL: ~ 57 nM). Wybierz odpowiednią objętość dla liczby studzienek, które mają być transfekowane określonym si/miRNA.
    4. Przygotować mieszankę wzorcową odczynnika do transfekcji. Użyj 10 μl (0,6 μl odczynnika do transfekcji + 9,4 μl zredukowanej pożywki surowicy) dla każdej studzienki (łącznie 96 dołków).
    5. Dodaj mieszaninę si/miRNA do mieszaniny odczynników do transfekcji. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Odpipetować 20 μl do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , a następnie zastąpić pożywkę w każdym dołku 120 μl pożywki 1. Po 24 godzinach lub dłużej przystąp do utrwalenia i barwienia immunofluorescencyjnego.
  3. Utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne
    1. Usuń pożywkę i umyj komórki raz za pomocą PBS. Przykryj komórki 4% roztworem formaldehydu na 20 minut. Zdjąć roztwór formaldehydu i raz umyć komórki PBS, a następnie przykryć je PBS do przechowywania lub przystąpić do barwienia immunologicznego.
    2. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (stężenie zgodne z instrukcjami producenta) w 0,2% Triton-X i 5% surowicy osła przez co najmniej 2 godziny. W przypadku barwienia na α-aktyninę (rozcieńczenie 1:400; monoklonalna anty-α-aktynina), barwić przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj 3 razy PBS. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze Hoechsta w stosunku 1:400 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Usunąć przeciwciało, przemyć PBS 3 razy i przykryć komórki PBS do przechowywania w temperaturze 4 °C.
  4. Wideomikroskopia konfokalna
    1. Do akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu konfokalnego. Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Otwórz "Ustawienia A1plus" i zaznacz pola Ch1, Ch2 i Ch3. Ustaw Ch1 na DAPI, Ch2 na eGFP, Ch3 na Cy3 i Ch4 na Cy4, klikając menu rozwijane.
      1. Dla każdego kanału kliknij HV i ustaw go na 80 za pomocą suwaka. Ustaw przesunięcie na 0 za pomocą suwaków i kliknij przycisk "Strona główna", aby ustawić otwór w pozycji wyjściowej. Ustaw rozmiar skanowania na 1,024 x 1,024, klikając menu rozwijane.
      2. Kliknij optymalizuj, aby otworzyć okno "Ustawienia rozmiaru XYZ". Zaznacz pole "Idealny woksel" w sekcji "Sugerowany krok (z)". Zwiększaj intensywność lasera, aż obraz nie będzie ani niedoświetlony, ani prześwietlony.
        UWAGA: Na przykład; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Ustaw Przesunięcie dla wszystkich kanałów na 0.
    2. Rób zdjęcia za pomocą obiektywu 20X (200-krotne powiększenie). Zeskanuj duży obraz składający się z obrazów kafelków (np. 3 x 3).
      1. W oprogramowaniu do obrazowania przejdź do "Pobierz" i wybierz "Skanuj duży obraz" z menu rozwijanego. W sekcji "Obszar" wybierz "bieżąca pozycja znajduje się w lewym górnym rogu" z menu rozwijanego i ustaw "Liczba pól w X i Y" na 3 x 3. Kliknij "Skanuj".
  5. Analiza obrazu
    1. Zdefiniuj liczbę jąder kardiomiocytów, zliczając sygnały H2B-Ch i liczbę kardiomiocytów, zliczając sygnały α-aktyniny.
      1. Kliknij "Pomiar" i wybierz "Pomiar ręczny" z menu rozwijanego. Wybierz "Liczby" z następnego menu rozwijanego. Klikaj na jądra z sygnałami H2B-mCH, oznaczając je w ten sposób i zliczając. Zrób to samo dla komórek α-aktyninowo-dodatnich, aby uzyskać liczbę kardiomiocytów.
    2. Policz kardiomiocyty fazy S / G2 z jądrowymi sygnałami eGFP-aniliny (jądra eGFP-aniliny + / H2BmCh+). Kliknij "Pomiar" i wybierz "Pomiar ręczny" z menu rozwijanego. Wybierz "Liczby" z następnego menu rozwijanego. Oznacz jądra sygnałami eGFP-aniliny i sygnałami H2B-mCH, klikając na nie.
    3. Policz kardiomiocyty z specyficznymi dla mitozy sygnałami eGFP-aniliny (np. Figura 1F i G), takimi jak sygnały cytoplazmatyczne, pierścienie kurczliwe i ciała środkowe. Kliknij "Pomiar" i wybierz "Pomiar ręczny" z menu rozwijanego. Wybierz "Liczby" z następnego menu rozwijanego. Oznacz kardiomiocyty specyficznymi dla mitozy sygnałami eGFP-aniliny (np. Figura 1F i G), sygnałami cytoplazmatycznymi, pierścieniami kurczliwymi i ciałami środkowymi, klikając je.

2. Oznaczanie zarodkowania u dorosłych kardiomiocytów przez dysocjację Langendorffa i grube skrawki tkanek

  1. Izolacja dorosłych kardiomiocytów przez dysocjację Langendorffa
    1. Przygotowania przed wyorowaniem serca
      1. Napełnij strzykawkę insulinową (igła 30G) heparyną (20 jednostek/g masy ciała). Chwyć mysz za kark. Podnieś i obróć mysz do tyłu, aby odsłonić brzuch do wstrzyknięcia.
      2. Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe. Umieść heparynową mysz z powrotem w klatce i odczekaj co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem sekcji serca. Przepłukać i przewietrzyć aparat Langendorffa 5 - 10 ml buforu perfuzyjnego (bufor perfuzyjny: 135 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,5 mM HEPES, 5 mM glukozy i 25 mM BDM w ddH2O, dostosować do pH 7,4 za pomocą NaOH).
    2. Rozwarstwienie serca
      1. Przygotować 10-centymetrową szalkę Petriego ze schłodzonym (4 °C) PBS i umieścić ją na lodzie. Napełnij i przewietrz strzykawkę o pojemności 1 ml podłączoną do kaniuli (rozmiar 20) za pomocą PBS. Przymocuj kaniulę za pomocą plasteliny na granicy szalki Petriego. Umieść końcówkę kaniuli nieco poniżej powierzchni PBS.
      2. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Przetrzyj brzuch 70% roztworem etanolu. Wykonaj nacięcie od połowy brzucha do mostka za pomocą nożyczek chirurgicznych. Zdejmij przeponę i obustronnie przetnij klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi.
      3. Podnieś i zamocuj mostek za pomocą igły o rozmiarze 20, otwórz klatkę piersiową i delikatnie chwyć serce anatomicznymi kleszczami. Podnieś serce i usuń je z płuc i naczyń krwionośnych, przecinając naczynia drogi odpływu.
        UWAGA: Aby zidentyfikować aortę, ustaw serce brzuszną stroną do góry. Zmniejsza to odległość między oboma przedsionkami, więc aorta wraz z jej gałęziami znajduje się między przedsionkami. W zależności od indywidualnej architektury serca, gałęzie można usunąć, jeśli główna gałąź aorty jest nadal wystarczająco długa.
      4. Przenieść serce na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą schłodzony PBS (patrz krok 2.1.2.1). Kankanuluj serce, pociągając aortę wstępującą na kaniuli iniekcyjnej G20x1 1/2, która została stępiona za pomocą oscylującego narzędzia wielofunkcyjnego, aby uniknąć uszkodzenia tkanki. Zamocuj aortę za pomocą gwintu na kaniuli. Delikatnie przepłukać serce PBS, aby usunąć nadmiar krwi, naciskając tłok strzykawki. Powinno być widoczne niewielkie powiększenie serca.
    3. Dysocjacja serca Langendorffa
      1. Szybko podłącz kaniulowane serce do adaptera Luer lock w aparacie perfuzyjnym Langendorffa. Ukrwić serce 30 ml natlenionego buforu perfuzyjnego w temperaturze 37 °C przez 5 minut z natężeniem przepływu 1 kropli/s. Natężenie przepływu można regulować, regulując przepływO2 w aparacie Langendorffa za pomocą zaworu redukcyjnego (ciśnienie od 0 do 200 mbar).
      2. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj bufor do wytrawiania: bufor perfuzyjny z 6 U kolagenazą B, 10 000 jednostek trypsyny i 50 μM CaCl2. Usunąć bufor perfuzyjny i rozpocząć trawienie enzymatyczne, dodając 30 ml ciepłego (37 °C) i natlenionego buforu do wytrawiania.
        UWAGA: Ilość kolagenazy B należy miareczkować w zależności od aktywności różnych partii.
      3. Dostosuj przepływ do szybkości 1 kropli/s i traw serce przez 10 - 13 minut. Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie używaj ponownie wypływu. Przenieś serce na 10-centymetrową szalkę Petriego z 5 ml buforu wytrawiającego. Wypreparuj tkankę ręcznie za pomocą kleszczy, przytrzymując serce jedną parą kleszczy i używając drugiej pary do rozerwania serca na małe kawałki.
        UWAGA: Na tym etapie przedsionki można rozdzielić, pokroić na małe kawałki (nożyczkami do tęczówki) i trawić przez 30 minut w 750 μl buforu do wytrawiania w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu uzyskania izolowanych komórek przedsionkowych. Aby uzyskać czyste kardiomiocyty przedsionkowe, należy kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 750 μl roztworu zatrzymującego.
      4. Zatrzymaj trawienie, dodając 5 ml roztworu zatrzymującego (bufor perfuzyjny z 5% FBS i 50 μM CaCl2). Za pomocą pipety serologicznej przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 100 μm i zbierz komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 80 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
      5. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 10 ml roztworu zatrzymującego za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 80 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
      6. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej (IMDM z 20% FCS, 0,1 mM aminokwasów endogennych, po 50 μg/ml penicyliny i streptomycyny oraz 0,1 mM β-merkaptoetanolu) w celu hodowli. Alternatywnie przejdź do kroku 2.2, "barwienie immunofluorescencyjne" i napraw komórki.
      7. W celu utrwalenia na płytkach 24-dołkowych, należy umieścić 10 000 wyizolowanych komórek na baseniku na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą o stężeniu 8 μg/ml na płytkach 24-dołkowych z 500 μl pożywki hodowlanej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 3 godziny.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne na kardiomiocytach izolowanych przez Langendorffa w zawiesinie
    1. Utrwalić kardiomiocyty izolowane przez Langendorffa w 1 ml 4% PFA w PBS, pH 7,4, przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
    2. Ponownie zawiesić utrwalone kardiomiocyty w 1 ml PBS i albo przystąpić do barwienia immunofluorescencyjnego, albo przechowywać je w 500 μl PBS na studzienkę na 24-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C. Przenieść część zawiesiny komórek (~ 100 - 200 μL) do probówki mikrowirówkowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    3. Permeabilizować, blokować i barwić komórki pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko α-aktyninie, dodając 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w stosunku 1:400 w PBS 0,2% Triton X-100 i 5% surowicy osła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Wirować przy 800 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Przemyć osad komórkowy PBS i odwirować przy 800 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i inkubować w 200 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa-Fluorem (anty-mysia IgG1) rozcieńczonego w stosunku 1:400 w barwniku Hoechst (roztwór roboczy: 1 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    5. Wirować przy 800 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok. Chronić próbkę przed światłem. Ponownie zawiesić komórki w 200 - 500 μl PBS i przenieść 100 - 300 μl zawiesiny komórek do studzienki komory mikroskopowej. Zamknąć pokrywę komory i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania. Chronić przed światłem.
  3. Analiza jądrowości kardiomiocytów izolowanych metodą Langendorffa
    1. Rób zdjęcia z kardiomiocytów barwionych α-aktyniną za pomocą obiektywu 25X, odpowiadającego powiększeniu 250X. Policz liczbę jąder H2B-mCh+ tylko w tych kardiomiocytach, które są regularnie barwione przez α-aktyninę i wykazują typową morfologię w kształcie pręcika, a zatem zakłada się, że są nienaruszone.
    2. Policz co najmniej 100 kardiomiocytów z trzech różnych serc. Obliczać procentową zawartość kardiomiocytów jednojądrowych, obujądrowych i trójjądrowych.
      UWAGA: Zazwyczaj komórki dwujądrzaste powinny stanowić około 80 - 90%, podczas gdy komórki trójjądrzaste i te z większą liczbą jąder są rzadkie (< 1% w kardiomiocytach izolowanych Langendorffem < 3% w grubych plastrach). Kardiomiocyty przedsionkowe są znacznie mniejsze niż kardiomiocyty komorowe. Zazwyczaj komórki jednojądrzaste stanowią 90% całej populacji.
  4. Izolacja, utrwalanie i kriokonserwacja dorosłych serc jako przygotowanie do grubych plastrów
    1. Zmontuj aparat perfuzyjny do utrwalenia, podłączając strzykawkę o pojemności 50 ml do 3-kierunkowego kranu z rurką przedłużającą Heidelbergera i drugim 3-drogowym kranem odcinającym. Zamocować strzykawkę w stojaku w taki sposób, aby grawitacyjnie umożliwił przepływ. Napełnij system 15 ml PBS.
    2. Postępuj zgodnie z krokami 2.1.2.1-2.1.2.4, "przygotowanie serca". Podłącz kaniulę iniekcyjną G20x1 1/2 z sercem do adaptera Luer lock aparatu perfuzyjnego wypełnionego PBS bez pęcherzyków powietrza i wykonaj perfuzję za pomocą PBS. Napełnij system 10 - 15 ml 4% formaldehydu w PBS, który jest następnie perfundowany przez serce. Zanurzenie: utrwal serce w 4% roztworze formaldehydu na noc.
    3. Zastąp 4% roztwór formaldehydu PBS i umyj serce w PBS na wytrząsarce poziomej z prędkością 150 obr./min przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Zamień PBS na 20% roztwór sacharozy, aby odwodnić serce przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Zamroź serce w podłożu do zatapiania w krioterapii w małej foremce.
      1. Ustaw zlewkę wypełnioną 2-metylobutanem i umieść ją w pudełku z suchym lodem. Włóż serce do formy do zamrażania, uprzednio wypełnionej do połowy podłożem do zatapiania krio, i całkowicie przykryj je podłożem do zatapiania krio. Ostrożnie umieść formę w zimnej zlewce, zapobiegając kontaktowi pożywki do zatapiania kriogenicznego z 2-metylobutanem. Zamrożoną chusteczkę przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  5. Przygotowanie grubych plastrów serca
    1. W kriotomie należy zastosować następującą konfigurację: temperatura obiektu od -18 do -20 °C, temperatura komory od -21 do -23 °C, kąt czyszczenia uchwytu noża 4° i ostrza mikrotomu Feather R35.
    2. Wyjmij kriokonserwowany narząd z pojemnika do zamrażania i przymocuj go do krążka z próbką za pomocą pożywki do kriogenizacji za pomocą półki do szybkiego zamrażania. Ustaw serce w taki sposób, aby cięcie zaczynało się na wierzchołku.
    3. Odetnij plastry o grubości 50 μm, aż uzyskasz równą płaszczyznę cięcia i narząd stanie się widoczny. Wytnij plastry tkanki o grubości 50 μM, używając kriotomu w trybie ręcznym z małą prędkością i z płytką zapobiegającą przetaczaniu się umieszczoną na nożu. Zamontuj plastry na szkiełkach mikroskopowych nasączonych solą fizjologiczną. Pozostaw plastry do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej i przechowuj je w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio zabejcuje.
  6. Barwienie grubych plastrów serca (jąder i błon komórkowych)
    1. Plastry serca należy traktować RNAza A (20 μg/ml) w buforze myjącym (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5 i 50 mM EDTA) w kuwecie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Inkubować plastry w 0,2% Triton-X w buforze myjącym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Plastry myć dwukrotnie przez 5 minut w buforze myjącym w kuwecie na poziomym wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
    2. Przez noc barwić 1 μM jodkiem TO-PRO3 (642/661) i aglutyniną z kiełków pszenicy sprzężoną z fluoresceiną (WGA, 1:100) w buforze do płukania w temperaturze 4 °C. Plastry myć trzykrotnie przez 5 minut każdy buforem myjącym w kuwetach na poziomej wytrząsarce i przykryć je podłożem mocującym z alkoholu poliwinylowego z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i szkiełkiem nakrywkowym.
  7. Akwizycja obrazu
    1. Najlepiej użyć odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w obiektyw 40X/1,15 NA do zanurzania w wodzie. Wyszukaj na oko obszar w plasterku, który składa się z podłużnie wyłożonych kardiomiocytów; do tego celu najlepiej nadaje się kanał fluoresceiny-WGA (np.: 488 nm).
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny, ponieważ górne i dolne granice kardiomiocytów powinny być widoczne w stosie z do późniejszych analiz. Ponieważ głębokość obrazowania jest ograniczona do ~ 30 nm, a grubość wycinka wynosi 50 μm, nie jest możliwe zobrazowanie przekrojów tych komórek (długość komórki: ~ 120 μm).
    2. Dostosuj konfigurację w oprogramowaniu do obrazowania. Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Otwórz Ustawienia A1plus i zaznacz pola Ch2, Ch3 i Ch4. Ustaw Ch2 na EGFP, Ch3 na Alx546 i Ch4 na Alx647, klikając menu rozwijane.
      1. Dla każdego kanału kliknij HV i ustaw go na 80 za pomocą suwaka. Ustaw Przesunięcie na 0 za pomocą suwaków. Kliknij przycisk "Strona główna", aby ustawić otwór w pozycji wyjściowej. Ustaw rozmiar skanowania na 1,024 x 1,024, klikając menu rozwijane i kliknij optymalizuj, aby otworzyć okno "Ustawienia rozmiaru XYZ". Zaznacz pole "Idealny woksel" w sekcji "Sugerowany krok (z)".
    3. Kliknij "skanowanie na żywo" i dostosuj intensywność lasera, klikając suwaki na poszczególnych kanałach. Zaznacz pole "Seria Z" w oknie "Akwizycja ND" i kliknij pole "zdefiniowane przez górny przycisk". Zdefiniuj górną i przycisk stosu z, klikając odpowiednie przyciski po ustawieniu ostrości na mikroskopie. Ustaw szerokość kroku Z na 0,5 μm.
      UWAGA: Głębokość stosu z jest ograniczona przez penetrację optyczną w tkance i stosunek sygnału do szumu.
    4. Przejdź do "Ustawień A1plus" i ustaw Średnią/Całkę linii na 2-4, klikając menu rozwijane. Dostosuj intensywność lasera; Otwór otworkowy powinien być jak najmniejszy, aby można było obrazować w płaszczyźnie ogniskowej.
  8. Analiza zarodkowania
    1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i załaduj interesujący Cię stos z.
    2. Ręcznie określ zarodkowanie w stosach z, przewijając różne warstwy stosu w celu zidentyfikowania komórek, które leżą całkowicie w stosie; dzieje się tak, gdy barwienie WGA jest widoczne we wszystkich wymiarach. Policz liczbę jąder (większość z nich będzie obustronna) i zaznacz analizowaną komórkę adnotacją w oprogramowaniu.
    3. Określ liczbę jąder CM (H2B-mCh+) i całkowitych jąder (TO-PRO3+) w rekonstrukcjach 3D dla pojedynczych kanałów (ryc. 2D). W oprogramowaniu do obrazowania kliknij "Binarny" i wybierz "Zdefiniuj próg 3D" z menu rozwijanego. Z menu rozwijanego kanałów wybierz Alx546 dla liczby jąder CM lub Alx647 dla całkowitej liczby jąder. Klikając odpowiednie strzałki, ustaw program na "Smooth 4x", Clean 1x i Fill Holes ON. Zaznacz pole "Rozmiar" i ustaw go na 5 μm za pomocą suwaka. Ustaw próg za pomocą suwaka, aż pojawią się oddzielne obiekty.
      UWAGA: Po zastosowaniu fragmentacji w oknie wyników wyświetlana jest tabela zdarzeń kwantyfikowanych oraz kolorowa fragmentacja obrazu. Ponieważ niektóre jądra stykają się ze sobą bezpośrednio, należy ręcznie skorygować automatyczny wynik pomiaru dla dubletów, które mogą nie być prawidłowo rozdzielone przez oprogramowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu analizy wpływu siRNA/miRNA na aktywność cyklu komórkowego postnatalnych kardiomiocytów in vitro, kardiomiocyty myszy podwójnie transgenicznych Myh6-H2B-mCh/CAG-eGFP-anillin izolowano w 3. dniu postnatalnym (P3) i transfekowano indukującym aktywność cyklu komórkowego miR1995, siRNA p27 oraz siRNA Fzr1. W porównaniu z kontrolą negatywną (Rycina 1A), zdjęcia kardiomiocytów transfekowanych miR199- (Rycina 1B) oraz siRNA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kontrowersja co do tego, czy kardiomiocyty są w stanie ponownie wejść w cykl komórkowy i dzielić się po urazie i podczas homeostazy tkanek. Wartości obrotu podstawowego kardiomiocytów podano w zakresie od 1%1 do 80%7. Również po uszkodzeniu serca w strefie granicznej odnotowano indukcję aktywności cyklu komórkowego i wytwarzanie nowych kardiomiocytów, z wartościami od 0,0083%8 do 25 - 40%7. Rozbieżności te można częśc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy S. Grünbergowi (Bonn, Niemcy) i P. Freitagowi (Bonn, Niemcy) za ich pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 cm szalka PetriegoSarstedt821472
100 &mikro; m sitko komórkoweBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-butanodion, monoksym, (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ kaniula iniekcyjna, StericanBraun, Melsungen 4657519
igła o rozmiarze 20Becton Dickinson GmbH301300
Płytki 24-dołkoweBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-metylo-butanCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% roztwór formaldehyduAppliChem GmbH A0936,1000
3-drogowy kranB. Braun Medical Inc.16494C
Strzykawka 50 mlB. Braun Medical Inc.8728810F
70% etanolOtto Fischar GmbH27669
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa-FluoremJackson ImmunoResearch115-605-205
Alfa-aktinina EA-53, mysia IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 Well, Pół obszaruGreiner bio-one675986
Kolagenaza BRoche11088815001
mikroskop konfokalny Eclipse Ti-EKriostat Nikon
CM 3050SLeica
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
płodowa surowica cielęcaPromoCell, Heidelberg
Roztwór formaldehydu (4%)PanReac AppliChemA3697
Żelatyna ze skóry świni, typ ASigma-Aldrich, szkiełka nakrywkowe SteinheimG2500
VWR631-0146
GlukozaSigma-AldrichG7021
Rurka przedłużająca HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparyna-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
Szkiełka mikroskopowe HistoBondMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Strzykawka insulinowaBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mysia IgG Cy5 (osioł)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
probówka do mikrowirówekSarstedt72690
Mini wytrząsarkaVWR12620-940
mimik miRNA mirVana, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsja MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-dołkowy ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
ujemny kontrola (zakodowane RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Zestaw do dysocjacji serca noworodkówMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Aminokwasy endogenne, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Zredukowana pożywka w surowicyGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicylina/StreptomycynaGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Podłoże montażowe z polialkoholu winylowego z DABCO®, zapobiegające blaknięciuSigma-Aldrich10981
RNaza AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
pojemniki na próbkiVitlab80731
Pipeta serologicznaGreiner607180
oprogramowanie NIS Elements Nikon
SacharozaSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek OCT CompoundSakura Finetek / VWR25608-930
Jodek ToPro3 (642/661)Molekularny sondy/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsynaSigma-AldrichT1426
Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA) Fluoresceina oznaczonaVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&alfa;-aktyninaprzeciwciało Sigma-AldrichA7811
β-MerkaptoetanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
Serum osła

Bibliografia

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076(2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

jądra kardiomiocytówaktywność cyklu komórkowegotransgeniczne H2B-mCherrysygnały EGFP analinykonfokalna wideomikroskopiatrawienie tkanki sercawyznaczanie liczby kopii genomuwykrywanie endoreduplikacjiwizualizacja mitozyregeneracja serca
Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.