Method Article

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiomiocyty są podatne na zmiany cyklu komórkowego, takie jak endoreduplikacja (ciągłe rundy syntezy DNA bez kariokinezy i cytokinezy) i mitoza acytokinetyczna (kariokineza, ale bez cytokinezy). Takie nietypowe zmiany cyklu komórkowego skutkują powstawaniem komórek poliploidalnych i wielojądrowych, a nie podziałem komórkowym. Dlatego, aby określić obrót i regenerację serca, kluczowe znaczenie ma prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów, liczby jąder w komórce i stanu ich cyklu komórkowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego, takich jak analogi tymidyny Ki-67, PCNA lub pHH3. W tym miejscu przedstawiamy metody rozpoznawania kardiomiocytów i ich jądrowości oraz określania ich aktywności cyklu komórkowego. Używamy dwóch opublikowanych systemów transgenicznych: transgenicznej linii myszy Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz linii myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego. Połączone razem, te dwa systemy ułatwiają badanie regeneracji i plastyczności serca.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów i stanu cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla określenia obrotu i regeneracji mięśnia sercowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych, takich jak pHH3, Ki-67 lub analogi tymidyny, do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego. Ponieważ zdolność proliferacyjna kardiomiocytów dorosłych ssaków jest bardzo mała1, fałszywa identyfikacja jądra dodatniego dla markera proliferacji jądra kardiomiocytów może mieć decydujące znaczenie dla wyniku testu proliferacji. Co więcej, kardiomiocyty są podatne na zmiany w cyklu komórkowym, takie jak endoreduplikacja i mitoza acyt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury tego protokołu dotyczące zwierząt były zgodne ze standardami etycznymi Uniwersytetu w Bonn i zgodne z wytycznymi z Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

1. Wizualizacja in vitro aktywności cyklu komórkowego w kardiomiocytach poporodowych

  1. Poporodowa dysocjacja kardiomiocytów
    1. Preparaty przedeksperymentalne
      1. Przygotować pożywki hodowlane (IMDM, 1% penicylina/streptomycyna, 1% aminokwasy endogenne, 0,1% β-merkaptoetanol); podłoże 1: dodać FCS do 2%; podłoże 2: dodać FCS do 20%.
      2. Pokryj 96-dołkową n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu przeanalizowania wpływu siRNA/miRNA na aktywność cyklu komórkowego kardiomiocytów pourodzeniowych in vitro, kardiomiocyty podwójnie transgenicznych myszy Myh6-H2B-mCh/CAG-eGFP-aniliny zostały wyizolowane w 3. dniu po urodzeniu (P3) i transfekowane indukującym aktywność cyklu komórkowego miR1995, siRNA p27 i siRNA Fzr1. W porównaniu z kontrolą negatywną (Figura 1A), zdjęcia miR199- (Figura 1B) i transfekowane kardiom.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kontrowersja co do tego, czy kardiomiocyty są w stanie ponownie wejść w cykl komórkowy i dzielić się po urazie i podczas homeostazy tkanek. Wartości obrotu podstawowego kardiomiocytów podano w zakresie od 1%1 do 80%7. Również po uszkodzeniu serca w strefie granicznej odnotowano indukcję aktywności cyklu komórkowego i wytwarzanie nowych kardiomiocytów, z wartościami od 0,0083%8 do 25 - 40%7. Rozbieżności te można częśc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy S. Grünbergowi (Bonn, Niemcy) i P. Freitagowi (Bonn, Niemcy) za ich pomoc techniczną.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm szalka PetriegoSarstedt821472
100 &mikro; m sitko komórkoweBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-butanodion, monoksym, (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ kaniula iniekcyjna, StericanBraun, Melsungen 4657519
igła o rozmiarze 20Becton Dickinson GmbH301300
Płytki 24-dołkoweBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-metylo-butanCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% roztwór formaldehyduAppliChem GmbH A0936,1000
3-drogowy kranB. Braun Medical Inc.16494C
Strzykawka 50 mlB. Braun Medical Inc.8728810F
70% etanolOtto Fischar GmbH27669
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa-FluoremJackson ImmunoResearch115-605-205
Alfa-aktinina EA-53, mysia IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 Well, Pół obszaruGreiner bio-one675986
Kolagenaza BRoche11088815001
mikroskop konfokalny Eclipse Ti-EKriostat Nikon
CM 3050SLeica
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
płodowa surowica cielęcaPromoCell, Heidelberg
Roztwór formaldehydu (4%)PanReac AppliChemA3697
Żelatyna ze skóry świni, typ ASigma-Aldrich, szkiełka nakrywkowe SteinheimG2500
VWR631-0146
GlukozaSigma-AldrichG7021
Rurka przedłużająca HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparyna-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
Szkiełka mikroskopowe HistoBondMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Strzykawka insulinowaBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mysia IgG Cy5 (osioł)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
probówka do mikrowirówekSarstedt72690
Mini wytrząsarkaVWR12620-940
mimik miRNA mirVana, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsja MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-dołkowy ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
ujemny kontrola (zakodowane RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Zestaw do dysocjacji serca noworodkówMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Aminokwasy endogenne, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Zredukowana pożywka w surowicyGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicylina/StreptomycynaGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Podłoże montażowe z polialkoholu winylowego z DABCO®, zapobiegające blaknięciuSigma-Aldrich10981
RNaza AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
pojemniki na próbkiVitlab80731
Pipeta serologicznaGreiner607180
oprogramowanie NIS Elements Nikon
SacharozaSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek OCT CompoundSakura Finetek / VWR25608-930
Jodek ToPro3 (642/661)Molekularny sondy/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsynaSigma-AldrichT1426
Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA) Fluoresceina oznaczonaVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&alfa;-aktyninaprzeciwciało Sigma-AldrichA7811
β-MerkaptoetanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
Serum osła

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiomyocyte NucleiCell Cycle ActivityH2B mCherry TransgenicEGFP Analin SignalsConfocal Video MicroscopyHeart Tissue DigestionNuclearity DeterminationEndoreduplication DetectionMitosis VisualizationCardiac Regeneration

Related Articles