Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kardiomiocyty są podatne na zmiany cyklu komórkowego, takie jak endoreduplikacja (ciągłe rundy syntezy DNA bez kariokinezy i cytokinezy) i mitoza acytokinetyczna (kariokineza, ale bez cytokinezy). Takie nietypowe zmiany cyklu komórkowego skutkują powstawaniem komórek poliploidalnych i wielojądrowych, a nie podziałem komórkowym. Dlatego, aby określić obrót i regenerację serca, kluczowe znaczenie ma prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów, liczby jąder w komórce i stanu ich cyklu komórkowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego, takich jak analogi tymidyny Ki-67, PCNA lub pHH3. W tym miejscu przedstawiamy metody rozpoznawania kardiomiocytów i ich jądrowości oraz określania ich aktywności cyklu komórkowego. Używamy dwóch opublikowanych systemów transgenicznych: transgenicznej linii myszy Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz linii myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego. Połączone razem, te dwa systemy ułatwiają badanie regeneracji i plastyczności serca.
Wprowadzenie
Prawidłowa identyfikacja jąder kardiomiocytów i stanu cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla określenia obrotu i regeneracji mięśnia sercowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku stosowania markerów jądrowych, takich jak pHH3, Ki-67 lub analogi tymidyny, do identyfikacji aktywności cyklu komórkowego. Ponieważ zdolność proliferacyjna kardiomiocytów dorosłych ssaków jest bardzo mała1, fałszywa identyfikacja jądra dodatniego dla markera proliferacji jądra kardiomiocytów może mieć decydujące znaczenie dla wyniku testu proliferacji. Co więcej, kardiomiocyty są podatne na zmiany w cyklu komórkowym, takie jak endoreduplikacja i mitoza acyt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury tego protokołu dotyczące zwierząt były zgodne ze standardami etycznymi Uniwersytetu w Bonn i zgodne z wytycznymi z Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.
1. Wizualizacja in vitro aktywności cyklu komórkowego w kardiomiocytach poporodowych
- Poporodowa dysocjacja kardiomiocytów
- Preparaty przedeksperymentalne
- Przygotować pożywki hodowlane (IMDM, 1% penicylina/streptomycyna, 1% aminokwasy endogenne, 0,1% β-merkaptoetanol); podłoże 1: dodać FCS do 2%; podłoże 2: dodać FCS do 20%.
- Pokryj 96-dołkową n....
- Preparaty przedeksperymentalne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu analizy wpływu siRNA/miRNA na aktywność cyklu komórkowego postnatalnych kardiomiocytów in vitro, kardiomiocyty myszy podwójnie transgenicznych Myh6-H2B-mCh/CAG-eGFP-anillin izolowano w 3. dniu postnatalnym (P3) i transfekowano indukującym aktywność cyklu komórkowego miR1995, siRNA p27 oraz siRNA Fzr1. W porównaniu z kontrolą negatywną (Rycina 1A), zdjęcia kardiomiocytów transfekowanych miR199- (Rycina 1B) oraz siRNA.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kontrowersja co do tego, czy kardiomiocyty są w stanie ponownie wejść w cykl komórkowy i dzielić się po urazie i podczas homeostazy tkanek. Wartości obrotu podstawowego kardiomiocytów podano w zakresie od 1%1 do 80%7. Również po uszkodzeniu serca w strefie granicznej odnotowano indukcję aktywności cyklu komórkowego i wytwarzanie nowych kardiomiocytów, z wartościami od 0,0083%8 do 25 - 40%7. Rozbieżności te można częśc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy S. Grünbergowi (Bonn, Niemcy) i P. Freitagowi (Bonn, Niemcy) za ich pomoc techniczną.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 cm szalka Petriego | Sarstedt | 821472 | |
| 100 &mikro; m sitko komórkowe | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-butanodion, monoksym, (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ kaniula iniekcyjna, Sterican | Braun, Melsungen 4657519 | ||
| igła o rozmiarze 20 | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| Płytki 24-dołkowe | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-metylo-butan | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% roztwór formaldehydu | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-drogowy kran | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| Strzykawka 50 ml | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% etanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa-Fluorem | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alfa-aktinina EA-53, mysia IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 Well, Pół obszaru | Greiner bio-one | 675986 | |
| Kolagenaza B | Roche | 11088815001 | |
| mikroskop konfokalny Eclipse Ti-E | Kriostat Nikon | ||
| CM 3050S | Leica | ||
| Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | ||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| płodowa surowica cielęca | PromoCell, Heidelberg | ||
| Roztwór formaldehydu (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Żelatyna ze skóry świni, typ A | Sigma-Aldrich, szkiełka nakrywkowe Steinheim | G2500 | |
| VWR | 631-0146 | ||
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Rurka przedłużająca Heidelberger | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparyna-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Szkiełka mikroskopowe HistoBond | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Strzykawka insulinowa | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco' s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Dü sseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mysia IgG Cy5 (osioł) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| probówka do mikrowirówek | Sarstedt | 72690 | |
| Mini wytrząsarka | VWR | 12620-940 | |
| mimik miRNA mirVana, has-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsja Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-dołkowy ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| ujemny kontrola (zakodowane RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Zestaw do dysocjacji serca noworodków | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Dü sseldorf | ||
| Aminokwasy endogenne, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Zredukowana pożywka w surowicy | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Podłoże montażowe z polialkoholu winylowego z DABCO®, zapobiegające blaknięciu | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNaza A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| pojemniki na próbki | Vitlab | 80731 | |
| Pipeta serologiczna | Greiner | 607180 | |
| oprogramowanie NIS Elements Nikon | |||
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura Finetek / VWR | 25608-930 | |
| Jodek ToPro3 (642/661) | Molekularny sondy/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA) Fluoresceina oznaczona | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| &alfa;-aktynina | przeciwciało Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Merkaptoetanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
Bibliografia
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
