Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez "Acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55206

⸱

19 kwietnia 2017

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest opłacalną alternatywą dla ekspresji nagiego plazmidowego DNA w skórze myszy. Ogólnym celem protokołu jest dostarczenie genów związanych z odpornością do tkanki skórnej w celu określenia funkcjonalnej roli określonego genu w zapaleniu skóry.

Streszczenie

Dysregulacja odpowiedzi immunologicznej w skórze jest związana z licznymi chorobami skóry u ludzi. Bezpośredni transfer genów związanych z odpornością do tkanki skórnej jest fascynującym podejściem do badania immunologicznej modulacji zapalenia skóry w mysich modelach chorób ludzkich. Poniżej przedstawiamy opłacalny protokół, który dostarczył nagie DNA do skóry myszy i doprowadził do ekspresji transgenu. Metoda ta została ukuta pod nazwą "acufection", oznaczającątransfekcję DNA za pośrednictwem nakłucia aku. Aby wykonać akufekcję, skórę myszy najpierw nastrzyknięto DNA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie lekko nakłuwano wiązką igieł akupunkturowych, aby ułatwić wchłanianie DNA i transfekcję do komórek. Plazmidowe DNA jest przypuszczalnie wychwytywane przez keratynocyty i komórki dendrytyczne (DC) w skórze i wyrażane w białko. Mechaniczne nakłucie igłami samo w sobie nie spowodowało uszkodzenia skóry ani nie wywołało aktywacji keratynocytów. Ekspresję transfekowanych genów wykryto w skórze zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i translacyjnym po zaostrzeniu przez 2 dni i utrzymała się do 7 dni. Głównym celem opracowania tej metody akutekcji było zbadanie wcześniej niezdefiniowanej izoformy IL-15. Stosując tę metodę, alternatywnie splicowaną izoformę IL-15 z częściowo usuniętym eksonem 7 (IL-15ΔE7) poddano ekspresji w skórze, a następnie potraktowano agonistą receptora Toll-podobnego 7 (TLR7), imikwimodem (IMQ), w celu wywołania stanu zapalnego. IL-15ΔE7 dostarczana przez ACUFECTION w hamowaniu przez skórę proliferacji keratynocytów, grubości naskórka i rekrutacji neutrofili w zapaleniu skóry wywołanym IMQ. Wraz z rosnącym zainteresowaniem identyfikacją mechanizmów regulacyjnych zapalenia skóry, opisany tutaj protokół stanowi opłacalną i wszechstronną alternatywę dla systemu pistoletów genowych lub mikrosiewu w celu dostarczania DNA in vivo. Może to potencjalnie pozwolić na odkrycie funkcji nowego genu w skórze lub na zbadanie nowych metod leczenia chorób skóry.

Wprowadzenie

Skóra to pierwsza linia obrony gospodarza. Keratynocyty (KC) są głównym typem komórek w skórze ludzi i myszy. W odpowiedzi na bodźce środowiskowe (np. światło słoneczne, tlen, chemikalia i inwazja patogenów), KC są aktywowane i wytwarzają szeroki wachlarz prozapalnych cytokin i chemokin, takich jak IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α i GM-CSF1. Razem wyzwalają rekrutację komórek odpornościowych do skóry. Zaostrzone zapalenie skóry jest często związane z wieloma chorobami u ludzi, w tym ostrym ektopowym kontaktowym zapaleniem skóry i przewlekłym zapaleniem zależnym od limfocytów T (np. alergicznym kontaktowym zapaleniem skóry i łuszczycą)2. Modulowanie odpowiedzi prozapalnych w skórze poprzez hamowanie aktywacji KC jest prawdopodobnym podejściem do leczenia zapalenia skóry. Protokół ten opisuje nowe podejście do przejściowej ekspresji genu cytokin w naskórku w celu zbadania odpowiedzi immunologicznej wynikającej z takiego leczenia w skórze.

Naskórek tworzy najbardziej powierzchowną warstwę skóry. Służy jako fizyczna bariera powstrzymująca substancje zewnętrzne, takie jak kwasy nukleinowe i patogeny, przed przedostaniem się do głębszych warstw skóry. Opracowano kilka bezigłowych technik transferu DNA naskórka3,4. DNA w roztworze lub związane z liposomami kationowymi lub wektorami adenowirusowymi zostało bezpośrednio nałożone na naskórek zmodyfikowany technikami takimi jak usunięcie warstwy rogowej naskórka lub leczenie odczynnikiem do depilacji. Usunięcie zrogowaciałego nabłonka ułatwia przenikanie DNA przez barierę naskórkową i interakcję z keratynocytami i komórkami Langerhansa w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej5. Chociaż do transferu DNA dostępna jest duża powierzchnia i podejście to nie wymaga igieł, istnieją wady, w tym wymóg dużych ilości DNA (10 - 100 μg), surowe traktowanie skóry przez stripping oraz niespójne wyniki w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej u uodpornionych zwierząt bez wzmacniacza dostarczania DNA6. Wykazano, że wewnątrzkomórkowe dostarczanie nagiego DNA do skóry za pośrednictwem mikrocząsteczek jest wysoce skuteczne i powtarzalne w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej7,8. Ręczny pistolet genowy został użyty do bombardowania miejsca docelowego skóry plazmidowymi cząstkami złota pokrytymi DNA o średnicy 2 μm za pomocą przepływu powietrza pod ciśnieniem helu9. Plazmidowe DNA jest przypuszczalnie pobierane przez KC i komórki dendrytyczne (DC) w skórze, a białko ulega lokalnej ekspresji lub jest transportowane do drenujących węzłów chłonnych przez DCs10. Chociaż system pistoletów genowych jest prosty i wymaga ograniczonego doświadczenia technicznego, koszt przygotowania i dostarczenia "pocisku DNA" (tj. proszków złota, helu) oraz samego pistoletu genowego ograniczył jego ogólne zastosowanie. Ponadto wymóg stosowania systemu dostarczania helu ogranicza łatwość transportu pistoletu genowego, gdy eksperymenty są przeprowadzane w różnych miejscach. Wykazano, że mikrosiew osiąga wyższą efektywność transferu genów niż pojedyncze wstrzyknięcie i bombardowanie cząstkami11. Mikrosiew wykorzystuje pistolet do tatuażu do dostarczania DNA do skóry bez użycia kulek cząsteczkowych11. Oscylowanie mikroigłami na skórze przy użyciu tego podejścia prawdopodobnie bezpośrednio zeskrobać błonę komórkową, a tym samym przenieść DNA do wielu komórek w tym samym czasie. Wadą jest jednak ból związany z dużą liczbą wstrzyknięć igłami o średnicy 0,254 mm.

Tutaj oferujemy alternatywne podejście do dostarczania DNA in vivo. Protokół "akufekcjonacji", który tutaj opisaliśmy, zapewnia ekonomiczny i wydajny sposób dostarczania plazmidowego DNA do skóry myszy. Krótko mówiąc, dziesięć igieł do akupunktury (0,2 mm średnicy x 13 mm długości) było związanych w wiązkę taśmą klejącą. Objętość 10 μl PBS z 10 μg plazmidowego DNA zawierającego interesujący nas transgen umieszczono na ogolonej, potraktowanej kremem do depilacji skórze boku. Za pomocą wiązki igieł do akupunktury do oscylacji powierzchni (1 cm x 1 cm) skóry, keratyny w warstwie rogowej zostały rozluźnione, a plazmidowe DNA nałożone na powierzchnię zostało wchłonięte przez naskórek. Uszkodzenia skóry były monitorowane i stwierdzono, że są minimalne. Ekspresja transfekowanego genu w skórze po zakażeniu została potwierdzona zarówno ilościowym testem real-time PCR (qRT-PCR), jak i testem ELISA. Immunomodulacyjne działanie IL-15ΔE7 dostarczanej przez ACUFECTION na stan zapalny skóry wykazano przy użyciu mysiego modelu traktowanego IMQ12. Podczas gdy akcecja okazuje się łatwą i mniej wymagającą metodą dostarczania DNA in vivo, optymalna ilość DNA dla różnych genów i czas nakłuwania skóry muszą być starannie zoptymalizowane, aby uzyskać powtarzalne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Samice myszy w wieku 8 - 12 tygodni zostały wykorzystane do tego badania. Myszy typu dzikiego C57 / BL6 (WT) i z niedoborem IL-15 (Il15-/-) zakupiono odpowiednio z National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan i Taconic Farm. Niedobór IL-15 (Il15-/-) idominacja IL-15 (Il15+/- i Il15+/+) wykazały stosunek 1:3 w drugim pokoleniu ze skrzyżowania heterozygot Il15+/-. Genotyp myszy Il15-/- został potwierdzony analizą PCR. Myszy utrzymywano w ośrodku wolnym od specyficznych patogenów (SPF) w Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym materiały i metody znieczulające, zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez National Taiwan University College of Medicine i College of Public Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Affidavit of Approval of Animal Protocol 20130225).

1. Przygotowanie igieł do akupunktury

UWAGA: Igły do akupunktury to urządzenia medyczne składające się z uchwytu i końcówki igły (Rysunek 1A). Średnice igły do akupunktury wahały się od 0,2 mm (36 G) do 0,35 mm (28 G). Wybieramy najdelikatniejszy punkt igły, aby uniknąć potencjalnego nadmiernego uszkodzenia komórek podczas nakłuwania skóry. Igła 0,2 mm ma 4 różne długości, w tym 13 mm (0,5 cala), 25 mm (1,0 cala), 40 mm (1,5 cala) i 50 mm (2,0 cala). Zestaw 10 igieł o długości 13 mm zapewniał najlepszy komfort chwytu podczas oscylacji igły na skórze myszy C57BL/6. Parametry mogą być modyfikowane, jeśli metoda zostanie zastosowana do skóry większych zwierząt lub wykonana przez badaczy o większych dłoniach.

  1. Wyjmij igły do akupunktury ze sterylnego, niepirogennego opakowania. Umieść igły na sterylnym serwecie.
  2. Użyj samoprzylepnej taśmy do etykietowania, aby związać 10 igieł w wiązkę (Rysunek 1B).
    UWAGA: 10 igieł jest ułożonych geometrycznie, tworząc kształt walca. Dla wygody użyj kawałka folii parafinowej, aby ustabilizować układ przed nałożeniem taśmy klejącej. Upewnij się, że wszystkie punkty igły znajdują się na tej samej płaszczyźnie. Użycie wiązki zamiast pojedynczej igły ułatwia maksymalną infuzję DNA poprzez zwiększenie powierzchni kontaktu między igłami a skórą.

2. Przygotowanie dużej ilości plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn

  1. Przekształć chemicznie kompetentne komórki bakteryjne za pomocą plazmidowego DNA.
  2. Wybrać i zaszczepić pojedynczą kolonię bakteryjną w 3 ml pożywki LB zawierającej antybiotyki i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez noc.
  3. Zwiększyć skalę hodowli, rozcieńczając kulturę bakteryjną w stosunku 1:100 w 250 ml pożywki LB antybiotykami i wstrząsając przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Przygotuj dużą ilość DNA, używając wysokiej jakości zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Protokół Acufection wymaga wysokiej czystości i dużej ilości plazmidowego DNA. Zaleca się stosowanie wysokiej jakości, wolnego od endotoksyn i oczyszczonego kolumnowo plazmidowego DNA.
  5. Eluować DNA w sterylnej wodzie. Przechowywać DNA w małych porcjach w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowe do koncentracji.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania DNA, aby zapewnić stałą ekspresję plazmidowego DNA.
  6. Rozcieńczyć plazmidowe DNA do 1 mg/ml w sterylnym PBS w celu uzyskania akufekcji.

3. Procedura dla Acufection

UWAGA: Optymalna ilość DNA i obszar docelowej powierzchni skóry mogą się różnić dla różnych genów i wymagają dalszej optymalizacji. Siła nakłucia i liczba nakłuć zrogowaciałej warstwy skóry również mogą się różnić w zależności od grubości skóry. Warunki te muszą być dokładnie określone po ocenie poziomu ekspresji acufekcyjnych transkryptów genowych za pomocą qRT-PCR.

  1. Zważyć myszy i podać tribromoetanol (400 μg na g masy ciała) we wstrzyknięciu otrzewnowym.
    UWAGA: 2,2,2-tribromoetanol jest środkiem znieczulającym do wstrzykiwań, który był powszechnie stosowany u myszy. Roztwory sporządza się przez rozpuszczenie niefarmaceutycznego 2,2,2-tribromoetanolu (2,5 g) w wodzie destylowanej (200 ml) zawierającej 2,5% 2-metylo-2-butanolu.
  2. Stosuj maść okulistyczną weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
    UWAGA: Efekt znieczulenia zostanie wywołany w ciągu 1 - 2 minut. Sprawdź odruch szczypania palca u nogi, aby zapewnić wystarczającą głębokość znieczulenia przed operacją.
  3. Ogolić skórę grzbietu i nałożyć krem do depilacji, aby rozpuścić białka keratynowe w łodydze włosa.
    UWAGA: Stosowanie kremu do depilacji do usuwania włosów ułatwi infuzję DNA do skóry.
  4. Użyj wacików nasączonych wodą, aby zetrzeć krem do depilacji.
    UWAGA: Krem do depilacji jest rozpuszczalny w wodzie. Całkowite usunięcie kremu zapobiegnie przetłuszczaniu się powierzchni i zapewni lepszy efekt nakłuwania.
  5. Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby zdezynfekować powierzchnię skóry.
  6. Zaznacz obszar docelowy (1 cm x 1 cm) na depilowanej skórze za pomocą wcześniej odmierzonego szablonu. UWAGA: Oznaczenie miejsca docelowego pomoże w nałożeniu wiązki igieł w górę iw dół w określonym obszarze. Jest to ważne, aby zapewnić dostarczenie tej samej ilości DNA do określonej powierzchni, aby zminimalizować różnice między eksperymentami.
  7. Umieść 10 μl kropli plazmidowego DNA (10 μg) na zaznaczonej skórze.
    UWAGA: Ilość DNA do akutekcji różni się w zależności od różnych genów i rodzaju wektora ekspresji. Ilość użytego DNA powinna być dokładnie miareczkowana przed przeprowadzeniem interesującego eksperymentu. 10 μl to mała kropla płynu, która dobrze przylega do ogolonej i wydepilowanej skóry, nie zwijając się podczas nakłuwania. Uwzględnij grupę kontrolną myszy leczonych 10 μl pustego wektora DNA w celu porównania z myszami, u których zdiagnozowano badany gen.
  8. Przytrzymaj wiązkę igieł do akupunktury (Ryc. 1B) i nakłuj zaznaczoną powierzchnię ruchem góra-dół przez 100 razy lub do momentu, gdy wilgoć z DNA w PBS zniknie na skórze. UWAGA: Może wystąpić pewne zaczerwienienie powierzchni skóry. Unikaj wykonywania głębokich nacięć, które krwawią. Liczba ruchów nakłuwania w górę iw dół na powierzchni skóry jest funkcjonalnie określana, gdy wilgoć z DNA w PBS (10 μl) znika ze skóry. Zdecydowaliśmy się 100 razy w ciągu 30 sekund, ponieważ dało to najbardziej spójne wyniki z genów dostarczanych przez akufekcję. W razie potrzeby igły mogą być ponownie użyte do maksymalnie 6 docelowych nakłuć skóry (1 cm x 1 cm każde). Opłucz igły w 70% etanolu i PBS między ćwiczeniami. Zmień igły na nowe, gdy są lub dla innego plazmidowego DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  9. Umieść zainfekowane myszy na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała do momentu przebudzenia.
  10. Wróć myszy do klatki, gdy odzyskają wystarczającą przytomność. Uwaga: Myszy z akufekcją należy przechowywać w oddzielnej klatce (mniej niż 5 zwierząt na klatkę) od klatki myszy bez zachorowań.
  11. Umieść butelkę z wodą na miejscu i umieść klatkę z powrotem w stojaku IVC (indywidualnie wentylowana klatka).

4. Opieka pooperacyjna

  1. Przez pierwsze 48 godzin po zabiegu należy ściśle monitorować myszy pod kątem dyskomfortu, w tym zmian w zachowaniu (niepokój, pobudzenie lub zaburzenia odżywiania) lub nieprawidłowego wyglądu (szorstka sierść lub zgarbiona postawa).

5. Imikwimod (IMQ) Leczenie skóry z infekcją IL-15ΔE7

UWAGA: Ekspresja transkrypcyjna i produkcja białka genu akufekcyjnego są wykrywalne w dniu 3. Myszy z plazmidem będącym przedmiotem zainteresowania mogą być leczone różnymi rodzajami stymulantów 3 dni po transfekcji. Ilustrujemy to tutaj, traktując skórę myszy z zakwasem IL-15ΔE7 kremem IMQ. IMQ to amina imidazinoliny zatwierdzona do leczenia brodawek zewnętrznych narządów płciowych i okołoporodowych13. Wykazano, że miejscowe leczenie IMQ wywołuje u myszy zaburzenia skóry podobne do łuszczycy u myszy objawiające się łuszczącą się skórą, proliferacją naskórka i naciekiem neutrofili przez skórę12,14,15 .

UWAGA: Wektor plazmidowy zawierał pełnowymiarowe mysie cDNA IL-15, pod regulacją czynnika elongacyjnego α czynnika wydłużenia 1 (pEF), otoczone peptydem sygnałowym IL-2 i znacznikiem FLAG na końcu C (pEF-IL-15, 5859 par zasad), który został skonstruowany zgodnie z opisem Bamforda i wsp.16. Plazmid jest używany jako matryca IL-15 do usuwania pierwszych 16 aminokwasów w resztach 33 - 48 w eksonie 7 genu IL-15 dla IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 par zasad) metodą SOE (synteza przez rozszerzenie na zakładkę) metodą PCR17. Kolonie bakteryjne, które zostały pomyślnie przekształcone za pomocą IL-15ΔE7, zostały zweryfikowane przez trawienie enzymem restrykcyjnym, a następnie sekwencjonowanie DNA12,18. Przygotowano dużą ilość plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn zgodnie z opisem w kroku 2 protokołu.

  1. Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie tribromoetanolu (400 μg na g masy ciała) i nałożenie maści okulistycznej weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. Sprawdź odruch szczypania palca u nogi, aby zapewnić wystarczającą głębokość znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegów operacyjnych. UWAGA: Ponieważ skóra o wymiarach 2 cm x 2 cm będzie leczona z powodu IMQ, 2 dawki plazmidowego DNA pIL-15ΔE7 (10 μg w 10 μl PBS na dawkę) są umieszczane w 2 miejscach docelowych (1 cm x 1 cm każde).
  2. Zaznaczyć skórę boku (2 cm x 2 cm) pokrywającą obszar dotknięty chorobą.
  3. Użyj aplikatora z końcówką higieniczną, aby miejscowo nałożyć krem IMQ na zaznaczoną powierzchnię. Uwaga: krok 5.1 przeprowadza się tylko dla pierwszej dawki (60 mg/dawkę). Kolejne kolejne dawki stosuje się u myszy nieznieczulonych.
  4. Codziennie dokumentuj zmiany na skórze grzbietowej poddanej działaniu IMQ za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości. Uwaga: Jedna osoba trzyma mysz, podczas gdy druga nagrywa. Zdjęcia są robione i edytowane w późniejszym czasie.
  5. Poddaj myszy eutanazji poprzez wstrzyknięcie przedawkowania tribromoetanolu (800 μg na g masy ciała), a następnie zwichnięcie szyjki macicy w 4. lub 7. dniu po leczeniu IMQ. Skóra jest wycinana i przetwarzana (kroki 4.1 - 4.5).

6. Homogenat skóry myszy

  1. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać poziome cięcie od podstawy ogona. Przejdź obustronnie do podstawy kończyny tylnej i kontynuuj cięcie pionowo wzdłuż boku do podstawy kończyny przedniej.
  2. Ostrożnie oderwij skórę od leżącej pod spodem tkanki od tyłu do przodu. Użyj nożyczek, aby odciąć skórę grzbietową. Ułóż skórę na sterylnej szalce Petriego.
  3. Użyj skalpela, aby wyciąć docelową skórę i natychmiast zamroź ją w ciekłym azocie. Uwaga: Ten sam rozmiar skóry bez (1 cm x 1 cm) lub z zabiegiem IMQ (2 cm x 2 cm) jest ustalany dla każdej myszy, aby zminimalizować różnice między eksperymentami.
  4. Umieść zamrożoną tkankę skórną na środku wstępnie schłodzonego 2-komorowego moździerza z uchwytami i tłuczkiem. Użyj ołowianego młotka na moździerzu, aby sproszkować tkankę.
  5. Szybko umieść sproszkowaną tkankę w nowej probówce zawierającej 500 μl odczynnika do lizy komórek do ekstrakcji RNA lub w probówce zawierającej 50 μl PBS i 1x koktajl inhibitorów proteazy w celu uzyskania lizatu białkowego.

7. H&E i immunohistochemiczne barwienie sekcji skóry

  1. Umieść tkankę skórną w kasecie i zanurz ją na noc w 4% paraformaldehydzie.
  2. Osadzanie i wycinanie tkanki, które w naszym przypadku zostało wykonane przez Pracownię Patologii w LAC, NTU. Uwaga: Przekrój jest cięty na grubość 5 μm. Umieść skrawki tkanki na dodatnio naładowanych szkiełkach.
  3. Podgrzewać szkiełka w temperaturze 65 °C przez 15 min.
  4. Umieść szkiełka w stojaku do barwienia. Zanurz stojak w odpowiednim zbiorniku zawierającym substytut ksylenu na 5 minut dwukrotnie, a następnie sekwencyjnie zanurz w 100%, 95%, 80%, 75%, 60% i 50% etanolu (po 5 minut) w celu ponownego nawodnienia. Zanurz szkiełka w wodzie z kranu na 3 minuty przed barwieniem.
  5. Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną. Uwaga: Barwienie H & E zostało wykonane na życzenie w Laboratorium Patologii w LAC, NTU.
  6. W przypadku barwienia immunohistochemicznego należy zablokować skrawek roztworem blokowym w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby zmniejszyć niespecyficzne barwienie tła. Uwaga: Roztwór blokowy został opracowany komercyjnie przy użyciu technik barwienia immunologicznego. Ten produkt nie zawiera surowicy zwierzęcej.
  7. Zanurz szkiełko w PBS, aby wypłukać roztwór blokowy.
  8. Rozcieńczyć roztwór blokowy w PBS w stosunku 1:10 i dodać 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS) (roztwór rozcieńczalnika).
  9. Odpowiednio rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe należy odpipetować na sekcję i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Przeciwciała rozcieńcza się w roztworze rozcieńczalnika. Stężenia przeciwciał dla tego barwienia zostały zoptymalizowane na poziomie 1:800 i 1:200 odpowiednio dla Ki67 (klon SolA15) i Ly6G (klon 1A8). Stwierdzono, że te stężenia wykazują wyraźną plamę bez barwienia tła.
    1. Wybarwić jeden odcinek szeregowy w tym samym przebiegu tym samym roztworem, pomijając przeciwciało pierwszorzędowe w celu kontroli nieswoistego wiązania przeciwciała drugorzędowego.
  10. Umyj szkiełka trzy razy w TBS plus 0,1% Tween-20 (roztwór TBST) przez 5 minut każda. Zmieniaj roztwór między praniami.
  11. Odpipetować jedną kroplę znakowanych polimerów do każdej sekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Uwaga: Znakowany polimer jest komercyjnie przygotowywany przez połączenie polimerów aminokwasowych z peroksydazą i przeciwciałem drugorzędowym, które jest redukowane do fragmentu Fab'. Odczynnik jest gotowy do użycia do barwienia immunohistochemicznego wycinków tkanek myszy.
  12. Umyj szkiełka trzy razy w TBST przez 5 minut każda. Zmieniaj roztwór między praniami.
  13. Odpipetować roztwór tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzindyny (DAB) na wycinek tkanki i odstawić w temperaturze pokojowej do momentu, gdy w jasnym polu mikroskopowym pojawi się brązowy osad. Uwaga: Czas wytrącania się DAB w obecności peroksydazy wynosi około 30 minut.
  14. Zanurz szkiełka w wodzie, aby zatrzymać aktywność peroksydazy. Zanurz szkiełka w roztworze zieleni metylowej do barwienia jądrowego. Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 5 minut każda.
  15. Umieść szkiełko nakrywkowe na poplamionej sekcji, która jest pokryta trwałym medium montażowym (8 μl na sekcję).

8. Fotografia i analiza wycinka barwionej tkanki

  1. Wizualizacja wybarwionych H &E i skrawków tkanek IHC pod mikroskopem jasnego pola. Rejestruj obrazy za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) podłączonej do mikroskopu. Do analizy ilościowej można użyć oprogramowania do obrazowania
    1. Zeskanuj całe poplamione fragmenty za pomocą skanoskopu z obiektywem 20X.
    2. Zmierz grubość naskórka w obrębie 1-milimetrowego segmentu naskórka i policz liczbę komórek immunoreaktywnych Ki67 w tym segmencie.
      UWAGA: Analiza ilościowa jest wykonywana przy użyciu oprogramowania do automatyzacji mikroskopii i analizy obrazu. Grubość naskórka określa się na podstawie odległości między warstwą podstawną a najbardziej zewnętrzną warstwą naskórka.
    3. Policz liczbę komórek immunoreaktywnych Ly6G w obszarze skóry właściwej (prostokąt 230 x 270μm2) bezpośrednio pod skórą poddawaną miejscowemu działaniu IMQ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Choć w ciągu pierwszej godziny po nakłuciu igłami do akupunktury zaobserwowano pewne zaczerwienienie, skóra oczyściła się w 2. dniu, a do 7. dnia po nakłuciu nie stwierdzono żadnych niepożądanych reakcji skórnych (Rysunek 2A). Analiza H&E wykazała, że nakłuwanie igłami indukuje bardzo niski poziom ortokerozy naskórka oraz minimalną infiltrację skóry właściwej w porównaniu z nieleczoną skórą (Rysunek 2B). Grubość naskórka (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym krokiem zapewniającym ekspresję akufektycznego plazmidowego DNA jest równomierne oscylowanie i rozluźnienie zrogowaciałej warstwy skóry. Delikatnie popychając igły bez przecinania skóry, siła powinna być wystarczająco duża, aby wcisnąć powierzchnię. Aby ułatwić wchłanianie DNA w 10 μl roztworu na powierzchni 1 cm x 1 cm, igły powinny oscylować w górę iw dół około 100 razy w ciągu 30 s. Można określić siłę, która jest potrzebna do nakłucia skóry i odnotowując, ile razy jest to potrzebne, aby uzyskać najleps...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Dziękujemy dr Betty Wu-Hsieh i Chien-Kuo Lee z NTU, Leigh Zerboni z Uniwersytetu Stanforda i dr Peterowi Hoffmannowi z Uniwersytetu Hawajskiego za przeczytanie manuskryptu, Yun Chien z NTU za pomoc techniczną oraz dr Wen-Chi Wei z Centrum Badań Biotechnologii Rolnictwa w Academia Sinica za porady techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Accu Handy NeedleAccu36Gx0,5Wyrób medyczny
NairTM BalsamKościół & DwightN/ASłuży do usuwania włosów
Substytut Shandon XylineThermo Fisher Scientific6764506Deparunizacja
Avertin (2,2,2-Tribrometanol)Sigma-AldrichT4,840-2Znieczulenie
2-metylo-2-butanolSigma-Aldrich152463Rozpuszczalnik do rozpuszczania avertyny
DifcoTM bulion LB, MillerBD244620Rozmnażanie i utrzymanie E. coli dla biologii molekularnej
Mysz IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go zestaweBioscience88-7215Pomiar białka IL-15
przeciw myszom Ly6GBioLegend127601stosowane do immunohistochemicznego barwienia
anty-mysiego Ki-67eBioscience14-5698-80Przeciwciało stosowane do barwienie immunohistochemiczne
Prosta plama Mysz MAXPO (Szczur)Nichirei Biosciences414341FOdczynnik do blokowania sygnału tła w barwieniu myszy na myszy
Zestaw substratów peroksydazy DAB (HRP)Vector LaboratoriesSK-4100Podłoże nadtlenkowe do barwienia immunohistochemicznego
Ultra V blockThermo Fisher ScientificTA-060-UBRedukcja niespecyficznych barwień tła
Zieleń metylowaSigma-AldrichM8884Barwienie jądrowe
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Trwale zachowujące plamy histochemiczne Inhibitor
proteazy w tabletkach koktajlowychRoche04-693-116-001Hamuje aktywność proteazy w lizacie komórkowym
Aldara krem 3MParmaceuticalsN/A5% imikwimod krem
Bessman Tissue PulverizerSpectrum Labs189475Służy do sproszkowania tkanki skórnej
ABI7900HT cyklerThermo Fisher ScientificN/Ailościowy test PCR w czasie rzeczywistym
KameraPanasonicHDC-SD60Dokumentacja obrazu
Axio Scope.A1ZEISSN/AMikroskopia jasnego pola
Przeciwciało

Bibliografia

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

sk ra myszyplazmidowy DNAig y do akupunkturyizoforma IL 15agonista TLR7leczenie imikimodemanaliza qRT PCRbarwienie immunohistochemiczne
Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez "Acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.