Ten protokół jest opłacalną alternatywą dla ekspresji nagiego plazmidowego DNA w skórze myszy. Ogólnym celem protokołu jest dostarczenie genów związanych z odpornością do tkanki skórnej w celu określenia funkcjonalnej roli określonego genu w zapaleniu skóry.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez "Acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dysregulacja odpowiedzi immunologicznej w skórze jest związana z licznymi chorobami skóry u ludzi. Bezpośredni transfer genów związanych z odpornością do tkanki skórnej jest fascynującym podejściem do badania immunologicznej modulacji zapalenia skóry w mysich modelach chorób ludzkich. Poniżej przedstawiamy opłacalny protokół, który dostarczył nagie DNA do skóry myszy i doprowadził do ekspresji transgenu. Metoda ta została ukuta pod nazwą "acufection", oznaczającątransfekcję DNA za pośrednictwem nakłucia aku. Aby wykonać akufekcję, skórę myszy najpierw nastrzyknięto DNA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie lekko nakłuwano wiązką igieł akupunkturowych, aby ułatwić wchłanianie DNA i transfekcję do komórek. Plazmidowe DNA jest przypuszczalnie wychwytywane przez keratynocyty i komórki dendrytyczne (DC) w skórze i wyrażane w białko. Mechaniczne nakłucie igłami samo w sobie nie spowodowało uszkodzenia skóry ani nie wywołało aktywacji keratynocytów. Ekspresję transfekowanych genów wykryto w skórze zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i translacyjnym po zaostrzeniu przez 2 dni i utrzymała się do 7 dni. Głównym celem opracowania tej metody akutekcji było zbadanie wcześniej niezdefiniowanej izoformy IL-15. Stosując tę metodę, alternatywnie splicowaną izoformę IL-15 z częściowo usuniętym eksonem 7 (IL-15ΔE7) poddano ekspresji w skórze, a następnie potraktowano agonistą receptora Toll-podobnego 7 (TLR7), imikwimodem (IMQ), w celu wywołania stanu zapalnego. IL-15ΔE7 dostarczana przez ACUFECTION w hamowaniu przez skórę proliferacji keratynocytów, grubości naskórka i rekrutacji neutrofili w zapaleniu skóry wywołanym IMQ. Wraz z rosnącym zainteresowaniem identyfikacją mechanizmów regulacyjnych zapalenia skóry, opisany tutaj protokół stanowi opłacalną i wszechstronną alternatywę dla systemu pistoletów genowych lub mikrosiewu w celu dostarczania DNA in vivo. Może to potencjalnie pozwolić na odkrycie funkcji nowego genu w skórze lub na zbadanie nowych metod leczenia chorób skóry.
Wprowadzenie
Skóra to pierwsza linia obrony gospodarza. Keratynocyty (KC) są głównym typem komórek w skórze ludzi i myszy. W odpowiedzi na bodźce środowiskowe (np. światło słoneczne, tlen, chemikalia i inwazja patogenów), KC są aktywowane i wytwarzają szeroki wachlarz prozapalnych cytokin i chemokin, takich jak IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α i GM-CSF1. Razem wyzwalają rekrutację komórek odpornościowych do skóry. Zaostrzone zapalenie skóry jest często związane z wieloma chorobami u ludzi, w tym ostrym ektopowym kontaktowym zapaleniem skóry i przewlekłym zapaleniem zależnym od limfocytów T (np. alergicznym kontaktowym zapaleniem skóry i łus....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Samice myszy w wieku 8 - 12 tygodni zostały wykorzystane do tego badania. Myszy typu dzikiego C57 / BL6 (WT) i z niedoborem IL-15 (Il15-/-) zakupiono odpowiednio z National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan i Taconic Farm. Niedobór IL-15 (Il15-/-) idominacja IL-15 (Il15+/- i Il15+/+) wykazały stosunek 1:3 w drugim pokoleniu ze skrzyżowania heterozygot Il15+/-. Genotyp myszy Il15-/- został potwierdzony analizą PCR. Myszy utrzymywano w ośrodku wolnym od specyficznych patogenów (SPF) w Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Wszystkie procedury na zwierzęt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Choć w ciągu pierwszej godziny po nakłuciu igłami do akupunktury zaobserwowano pewne zaczerwienienie, skóra oczyściła się w 2. dniu, a do 7. dnia po nakłuciu nie stwierdzono żadnych niepożądanych reakcji skórnych (Rysunek 2A). Analiza H&E wykazała, że nakłuwanie igłami indukuje bardzo niski poziom ortokerozy naskórka oraz minimalną infiltrację skóry właściwej w porównaniu z nieleczoną skórą (Rysunek 2B). Grubość naskórka (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszym krokiem zapewniającym ekspresję akufektycznego plazmidowego DNA jest równomierne oscylowanie i rozluźnienie zrogowaciałej warstwy skóry. Delikatnie popychając igły bez przecinania skóry, siła powinna być wystarczająco duża, aby wcisnąć powierzchnię. Aby ułatwić wchłanianie DNA w 10 μl roztworu na powierzchni 1 cm x 1 cm, igły powinny oscylować w górę iw dół około 100 razy w ciągu 30 s. Można określić siłę, która jest potrzebna do nakłucia skóry i odnotowując, ile razy jest to potrzebne, aby uzyskać najleps.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Dziękujemy dr Betty Wu-Hsieh i Chien-Kuo Lee z NTU, Leigh Zerboni z Uniwersytetu Stanforda i dr Peterowi Hoffmannowi z Uniwersytetu Hawajskiego za przeczytanie manuskryptu, Yun Chien z NTU za pomoc techniczną oraz dr Wen-Chi Wei z Centrum Badań Biotechnologii Rolnictwa w Academia Sinica za porady techniczne.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0,5 | Wyrób medyczny |
| NairTM Balsam | Kościół & Dwight | N/A | Służy do usuwania włosów |
| Substytut Shandon Xyline | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparunizacja |
| Avertin (2,2,2-Tribrometanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Znieczulenie |
| 2-metylo-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Rozpuszczalnik do rozpuszczania avertyny |
| DifcoTM bulion LB, Miller | BD | 244620 | Rozmnażanie i utrzymanie E. coli dla biologii molekularnej |
| Mysz IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go zestaw | eBioscience | 88-7215 | Pomiar białka IL-15 |
| przeciw myszom Ly6G | BioLegend | 127601 | stosowane do immunohistochemicznego barwienia |
| anty-mysiego Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Przeciwciało stosowane do barwienie immunohistochemiczne |
| Prosta plama Mysz MAXPO (Szczur) | Nichirei Biosciences | 414341F | Odczynnik do blokowania sygnału tła w barwieniu myszy na myszy |
| Zestaw substratów peroksydazy DAB (HRP) | Vector Laboratories | SK-4100 | Podłoże nadtlenkowe do barwienia immunohistochemicznego |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Redukcja niespecyficznych barwień tła |
| Zieleń metylowa | Sigma-Aldrich | M8884 | Barwienie jądrowe |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Trwale zachowujące plamy histochemiczne Inhibitor |
| proteazy w tabletkach koktajlowych | Roche | 04-693-116-001 | Hamuje aktywność proteazy w lizacie komórkowym |
| Aldara krem 3M | Parmaceuticals | N/A | 5% imikwimod krem |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Służy do sproszkowania tkanki skórnej |
| ABI7900HT cykler | Thermo Fisher Scientific | N/A | ilościowy test PCR w czasie rzeczywistym |
| Kamera | Panasonic | HDC-SD60 | Dokumentacja obrazu |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Mikroskopia jasnego pola |
Bibliografia
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
