Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Summary

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Abstract

Zarodki danio pręgowanego stanowią idealny system eksperymentalny do badania złożonych procesów morfogenetycznych ze względu na ich łatwość dostępu i przejrzystość optyczną. W szczególności wydłużenie tylnej części ciała jest niezbędnym procesem w rozwoju embrionalnym, w którym wiele deformacji tkanek działa razem, kierując tworzeniem się dużej części osi ciała. Aby zaobserwować ten proces za pomocą długoterminowego obrazowania poklatkowego, konieczne jest zastosowanie techniki montażu, która zapewnia wystarczające wsparcie w celu utrzymania próbek we właściwej orientacji podczas transferu do mikroskopu i akwizycji. Ponadto mocowanie musi również zapewniać wystarczającą swobodę ruchów dla wyrostka tylnej części ciała, nie wpływając przy tym na jego normalny rozwój. Wreszcie, musi istnieć pewien stopień wszechstronności metody montażu, aby umożliwić obrazowanie w różnych konfiguracjach obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy technikę montażu do obrazowania rozwoju wydłużenia tylnej części ciała u danio pręgowanego D. rerio. Technika ta polega na montowaniu zarodków w taki sposób, że obszary głowy i woreczka żółtkowego są prawie całkowicie włączone do agarozy, pozostawiając tylny obszar ciała, aby wydłużyć się i normalnie rozwijać. Pokażemy, w jaki sposób można to dostosować do pionowych, odwróconych i pionowych zestawów mikroskopii z arkuszami świetlnymi. Chociaż protokół ten koncentruje się na montowaniu zarodków w celu obrazowania tylnej części ciała, można go łatwo zaadaptować do obrazowania na żywo wielu aspektów rozwoju danio pręgowanego.

Introduction

Wydłużenie tylnej części ciała jest niezbędnym procesem w rozwoju embrionalnym, dzięki któremu zarodek rozciąga się, tworząc dużą część osi ciała. Jest to przykład złożonego procesu morfogenetycznego, w którym wiele zachowań komórek działa koordynacyjnie, aby wygenerować morfogenezę na poziomie poszczególnych tkanek. Te zróżnicowane deformacje tkanek działają następnie razem, aby wygenerować wydłużenie tylnego ciała na poziomie całej struktury. Aby zrozumieć, w jaki sposób procesy te są kontrolowane i koordynowane podczas rozwoju, musimy być w stanie śledzić te procesy w wielu skalach (tj. na poziomie cząsteczek, komórek, populacji komórek i tkanek) i powiązać to bezpośrednio z morfogenezą całej struktury.

Zarodki zebry są idealne do obrazowania wydłużenia tylnej części ciała, ponieważ ich przezroczystość optyczna i mały rozmiar pozwalają na zastosowanie minimalnie inwazyjnych metod obrazowania światłem, dobrze nadających się do obrazowania na żywo. ¹ Zostało to udowodnione przez szereg ostatnich publikacji, które rzuciły światło na rozwój tylnej części ciała na poziomie molekuł,² pojedyncze komórki,³ i zachowania międzytkankowe,⁴, a także na poziomie populacji komórek i całego narządu. ⁵

Zaawansowane techniki obrazowania, takie jak mikroskopia konfokalna, mikroskopia wielofotonowa i selektywna mikroskopia oświetlenia płaskiego (SPIM), umożliwiają długoterminowe obrazowanie procesów rozwojowych ze zmniejszonym efektem toksyczności światła i fotowybielania. Do osiągnięcia trzech celów potrzebne są solidne techniki mocowania żywych próbek: 1) wystarczające wsparcie w celu utrzymania próbek we właściwej orientacji podczas transferu do mikroskopu i podczas akwizycji, 2) wystarczająca swoboda ruchu próbki, aby umożliwić wyrośnięcie tylnego obszaru ciała bez wpływu na jej normalny rozwój, i wreszcie 3) pewien stopień wszechstronności metody montażu, aby umożliwić obrazowanie na różnych konfiguracjach obrazowania.

Ten protokół wprowadza technikę montażu do obrazowania rozwoju drobnicy D. rerio. Technika ta polega na montowaniu zarodków w taki sposób, że obszary głowy i woreczka żółtkowego są prawie całkowicie włączone do agarozy, pozostawiając tylny obszar ciała do wydłużenia i normalnego rozwoju. W związku z tym jest to również odpowiednia metoda do długoterminowego obrazowania innych obszarów rozwijającego się ciała, ponieważ agaroza umożliwia obrazowanie za pomocą standardowych technik obrazowania światłem. Protokół ten pokazuje montowanie zarodków w orientacji bocznej, chociaż możliwe jest również montowanie zarodków w orientacji alternatywnej. Pokaże również, w jaki sposób można dostosować metodę do pionowych, odwróconych i pionowych ustawień mikroskopii z arkuszami świetlnymi.

Protocol

1. Przygotowanie roztworów i wyciągnięta szklana igła

1. Przygotuj 25x roztwór podstawowy Trikainy (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego, zwany również 3-aminobenzoesanem etylu) o stężeniu 4 mg / ml w 20 mM Tris pH 8,8 i doprowadź ten roztwór do pH 7. Porcja 4 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Znieczulająca Trikaina działa preferencyjnie na kanały sodowe bramkowane napięciem nerwowym, blokując w ten sposób drganie i ruch mięśni⁶.
2. Przygotować roztwór roboczy trikainy o końcowym stężeniu 0,17 mg/ml w pożywce dla zarodków E3. ⁷
   UWAGA: Przygotuj roztwór roboczy Trikainy doraźnie, gdy pH tego roztworu dryfuje.
3. Rozpuść agarozę o niskiej temperaturze topnienia do końcowego stężenia 1,5% w pożywce zarodkowej E3 w probówce o pojemności 50 ml, ogrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej. Pozostawić ten roztwór do równowagi do 42-45 °C w łaźni wodnej lub inkubatorze stołowym. W przypadku przygotowywania dużych naczyń do obrazowania na pionowym arkuszu świetlnym (krok 4), należy dodać dodatkowe 25 ml 1% standardowej topniejącej agarozy w pożywce dla zarodków E3.
4. Stosować szkło borokrzemianowe z kapilarami z żarnikiem o wymiarach OD 1,20 mm, ID 0,69 mm, długości 10 mm.
5. Jeśli kapilary są naciągane na typ ściągacza igłowego z filamentem grzewczym opisany w Tabeli Wyposażenia i Odczynników, należy użyć następujących ustawień: Ciepło 600, Ciągnięcie 120, Prędkość 50, Czas 225, Ciśnienie 500. Za pomocą pary ostrych kleszczy złamij igłę tuż za punktem, w którym się zgina, aby utworzyć czystą i ostrą igłę do orientacji zarodków i usuwania nadmiaru agarozy. Mikroskalpel może być również użyty do usunięcia nadmiaru agarozy.

2. Osadzanie zarodków do mikroskopii odwróconej lub pionowej

1. Wyhodować zarodki do odpowiedniego stadium w pożywce dla zarodków E3. ⁷
2. Na wymaganym etapie należy usunąć zarodki za pomocą pary ostrych kleszczy pod dwuokularowym mikroskopem preparacyjnym
.
3. Inkubować zdekorionowane zarodki przez co najmniej 5 minut w roztworze roboczym Trikainy.
4. Gdy stopiony roztwór agarozy ostygnie do temperatury 45 °C, za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść zdekorionowany zarodek bezpośrednio do probówki o pojemności 50 ml przy minimalnym transferze pożywki E3.
5. Usunąć zarodek razem z około 1 ml pożywki montażowej i dodać ok. 100 μl pożywki montażowej wraz z zarodkiem do środkowego okręgu płytki Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem z mikrodołkiem o średnicy 10 mm.
6. W miarę zastygania podłoża mocującego przesuń zarodek na krawędź koła agarozy z ogonem skierowanym na zewnątrz (ryc. 1A). Użyj igły kapilarnej, aby utrzymać zarodek w pożądanej orientacji bocznej, aż do całkowitego związania żelu. Aby zobrazować rozwój tylnej części ciała, należy zwrócić uwagę na orientację zarodka w orientacji jak najbardziej bocznej. Dlatego utrzymuj zarodek w tej pozycji, ostrożnie regulując igłą do naczyń włosowatych.
   UWAGA: W tym momencie można dodać wiele zarodków do naczynia montażowego, jeśli jest to wymagane. W takim przypadku najpierw przenieś niskotopliwą agarozę do naczynia i dodaj zarodki do środka kropli agarozy. Następnie wypchnij zarodki na krawędzie szklanego pierścienia i ustaw je w żądanej pozycji. W ten sposób można umieścić do sześciu zarodków, zanim agaroza zastygnie.

3. Usuwanie nadmiaru agarozy wokół tylnej części ciała

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę, za pomocą której agaroza jest usuwana z obszaru otaczającego tylne ciało. W przypadku wydłużenia tylnej części ciała ważne jest, aby ogon mógł normalnie wyrastać. Usuwając agarozę po całkowitym włączeniu zarodka przez agarozę, zarodek pozostawia się zamknięty w okolicy głowy i około połowie woreczka żółtkowego.

1. Gdy kropla agarozy zastygnie, zalej szalkę Petriego roztworem roboczym Tricaine.
2. Pod mikroskopem dwuokularowym z podstawą ze światłem przechodzącym wyreguluj położenie lustra i kąt padającego światła tak, aby silny kontrast pozwalał na wyraźne widzenie nacięć w agarozie podczas operacji.
3. Aby wykonać cięcie 1 (ryc. 1), użyj igły kapilarnej lub mikroskalpela, aby przeciąć agarozę w połowie długości żółtka, od pozycji tuż za tworzącym się polem serca do pozycji somitu 5 (5. przedni somit).
4. Rozpocznij początkowe cięcie w sąsiedztwie formującego się serca, jak pokazano, i całą drogę przez agarozę do szklanki.
5. Trzymaj kapilarnę lub mikroskalpel głęboko w agarozie i powoli piłuj w górę iw dół, zaczynając wykonywać długie nacięcie nad zarodkiem, jak pokazano na rysunku 1. Pokrój jak najbliżej zarodka, nie nakłuwając zarodka ani żółtka.
6. Następnie wykonaj nacięcia 2 i 3 (ryc. 1), zaczynając od pozycji przy zarodku i z nacięciem biegnącym aż do naczynia ze szklanym dnem. Wykonaj cięcie 2 tak, aby było styczne do pierwszych 5 somitów, co pozwala na pełne rozłożenie tylnego ciała w kierunku grzbietowym. Wykonać cięcie 3 pod kątem 90° powierzchnią żółtka i zaczynając od pola serca.
   UWAGA: Cięcie agarozy do krawędzi szklanego koła (jak pokazano na rysunku 1) pomaga w usunięciu agarozy jako całego bloku (krok 3.6). Nie jest to jednak konieczne.
7. Zaczynając od przecięcia cięć 1 i 3, wykonaj powolne cięcie ukośne w kierunku końca cięcia 2, powoli unosząc się do góry, aby usunąć kwadrat agarozy otaczający tylną część ciała.
   Uwagi: W niektórych przypadkach zostanie to zwolnione w jednym bloku, a operacja zostanie zakończona za jednym razem. W innych może być konieczne kilka prób usunięcia całej agarozy otaczającej zarodek.
8. Za pomocą pary ostrych kleszczy usuń usunięte bloki agarozy z pożywki zarodkowej. Aby wspomóc ten proces, przesuń kawałki agarozy na bok naczynia i użyj ścianki szalki Petriego jako podparcia podczas wyjmowania kawałków agarozy.

Rysunek 1: Schematy ustawień montażowych. (A) Schemat pokazuje położenie zamontowanego zarodka w środkowym szklanym pierścieniu szalki Petriego. Po prawej stronie znajduje się powiększenie zarodka z każdym kolejnym przecięciem przez otaczającą agarozę pokazane kropkowanymi czerwonymi liniami. (B) Zamontowane zarodki są przedstawione na diagramie w widoku bocznym, co pokazuje łatwość dostępu zarówno dla celów odwróconych, jak i pionowych. (C) Podobny digram pokazujący, w jaki sposób można montować embriony w pionowych zestawach obrazowania za pomocą arkuszy świetlnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Jeśli drganie mięśni nie zostanie całkowicie zablokowane w tym momencie, dodaj krople trikainy z roztworu podstawowego 4 mg/ml o pH 7.

4. Montaż zarodków do pionowej mikroskopii świetlnej

UWAGA: Jest to wariacja na temat metody opisanej powyżej, która pozwala na dostęp do wielu obiektywów do obrazowania próbek za pomocą pionowo zorientowanego SPIM. Ideą tej odmiany jest podniesienie próbki nieco wyżej niż dno naczynia, aby umożliwić łatwy dostęp do dwóch obiektywów obrazowania.

1. Przed zamontowaniem próbki pokryć 100-milimetrową plastikową szalkę Petriego 1% agarozą w podłożu E3 na wysokość 5 mm i pozostawić do zastygnięcia.
2. Umieść kroplę 1 ml agarozy o niskiej temperaturze topnienia na środku naczynia i pozostaw do stężenia.
3. Osadź zarodki w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, jak w sekcji 2. Jednak tym razem wyjmij zarodek z 50 ml probówki agarozy z mniejszą kroplą roztworu (0,5 ml) i umieść tę małą kroplę na 1 ml kropli na środku naczynia.
4. Użyj igły kapilarnej, aby umieścić zarodek w środku małej kropli i utrzymuj jego prawidłową orientację, aż żel zastygnie.
5. Zalać naczynie roztworem roboczym Trikainy i usunąć nadmiar agarozy, jak w sekcji 3, ale bez przecinania poduszki z 1% standardowej agarozy.

Results

Opisany powyżej protokół szczegółowo opisuje wszechstronną technikę montażu zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania poklatkowego. Przykład tego pokazano na rysunku 2A oraz na rysunku 1 w animacji/wideo. Zarodki wstrzyknięto w fazie 1 komórki z mRNA kodującym fotokonwertowalne białko fluorescencyjne kikumeGR. Na etapie 15 somitów zostały one zamontowane zgodnie z powyższym opisem i obrazowane przez 12 godzin na odwróconym mikroskopie kon...

Discussion

Ta technika mocowania umożliwia utrzymanie zarodków w bezruchu podczas transferu do mikroskopu oraz podczas długotrwałych eksperymentów obrazowania poklatkowego, mających na celu śledzenie wydłużenia tylnej części ciała w wielu skalach długości. Co więcej, jest wszechstronny, ponieważ pozwala na obrazowanie zarówno w pionowych, jak i odwróconych ustawieniach mikroskopowych, a także zasugerowano, w jaki sposób można go jeszcze bardziej dostosować do pionowo zorientowanego SPIM.

Krytycznym kroki...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE
Naczynia ze szklanym dnem	Mattek	P35-1.5-10-C	35 mm szalka Petriego, 10 mm mikrostudzienka. Nr 1.5 szklane nakrycie
Kapilary na igły iniekcyjne&	nbsp; Sutter	BF 120-94-10	Używamy szkła orokrzemianowego z żarnikiem, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długość 10 cm. Jednak igły z filamentem nie są konieczne i większość standardowych igieł iniekcyjnych powinna działać.
Mikroskalpel	Feather	P-715	Jednorazowy skalpel okulistyczny Micro Feather z plastikową rączką
Pipety			o długości 230 mm
ODCZYNNIKI
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Sigma-Aldrich	A9414
< mocne>SPRZĘT
Kleszcze precyzyjne	NARZĘDZIA NAUKOWE GMBH	11252-30	Dumont #5
Ściągacz igieł	Sutter	P97	Ściągacz igieł do żarnika grzewczego
Lornetka do mikroskopu preparacyjnego	Leica	S8 Apo