Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodki danio pręgowanego stanowią idealny system eksperymentalny do badania złożonych procesów morfogenetycznych ze względu na ich łatwość dostępu i przejrzystość optyczną. W szczególności wydłużenie tylnej części ciała jest niezbędnym procesem w rozwoju embrionalnym, w którym wiele deformacji tkanek działa razem, kierując tworzeniem się dużej części osi ciała. Aby zaobserwować ten proces za pomocą długoterminowego obrazowania poklatkowego, konieczne jest zastosowanie techniki montażu, która zapewnia wystarczające wsparcie w celu utrzymania próbek we właściwej orientacji podczas transferu do mikroskopu i akwizycji. Ponadto mocowanie musi również zapewniać wystarczającą swobodę ruchów dla wyrostka tylnej części ciała, nie wpływając przy tym na jego normalny rozwój. Wreszcie, musi istnieć pewien stopień wszechstronności metody montażu, aby umożliwić obrazowanie w różnych konfiguracjach obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy technikę montażu do obrazowania rozwoju wydłużenia tylnej części ciała u danio pręgowanego D. rerio. Technika ta polega na montowaniu zarodków w taki sposób, że obszary głowy i woreczka żółtkowego są prawie całkowicie włączone do agarozy, pozostawiając tylny obszar ciała, aby wydłużyć się i normalnie rozwijać. Pokażemy, w jaki sposób można to dostosować do pionowych, odwróconych i pionowych zestawów mikroskopii z arkuszami świetlnymi. Chociaż protokół ten koncentruje się na montowaniu zarodków w celu obrazowania tylnej części ciała, można go łatwo zaadaptować do obrazowania na żywo wielu aspektów rozwoju danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Wydłużenie tylnej części ciała jest niezbędnym procesem w rozwoju embrionalnym, dzięki któremu zarodek rozciąga się, tworząc dużą część osi ciała. Jest to przykład złożonego procesu morfogenetycznego, w którym wiele zachowań komórek działa koordynacyjnie, aby wygenerować morfogenezę na poziomie poszczególnych tkanek. Te zróżnicowane deformacje tkanek działają następnie razem, aby wygenerować wydłużenie tylnego ciała na poziomie całej struktury. Aby zrozumieć, w jaki sposób procesy te są kontrolowane i koordynowane podczas rozwoju, musimy być w stanie śledzić te procesy w wielu skalach (tj. na poziomie cząsteczek, komórek, populacji komórek i tkanek) i powiązać to bezpośrednio z morfogenezą całej struktury.
Zarodki zebry są idealne do obrazowania wydłużenia tylnej części ciała, ponieważ ich przezroczystość optyczna i mały rozmiar pozwalają na zastosowanie minimalnie inwazyjnych metod obrazowania światłem, dobrze nadających się do obrazowania na żywo. 1 Zostało to udowodnione przez szereg ostatnich publikacji, które rzuciły światło na rozwój tylnej części ciała na poziomie molekuł,2 pojedyncze komórki,3 i zachowania międzytkankowe,4, a także na poziomie populacji komórek i całego narządu. 5
Zaawansowane techniki obrazowania, takie jak mikroskopia konfokalna, mikroskopia wielofotonowa i selektywna mikroskopia oświetlenia płaskiego (SPIM), umożliwiają długoterminowe obrazowanie procesów rozwojowych ze zmniejszonym efektem toksyczności światła i fotowybielania. Do osiągnięcia trzech celów potrzebne są solidne techniki mocowania żywych próbek: 1) wystarczające wsparcie w celu utrzymania próbek we właściwej orientacji podczas transferu do mikroskopu i podczas akwizycji, 2) wystarczająca swoboda ruchu próbki, aby umożliwić wyrośnięcie tylnego obszaru ciała bez wpływu na jej normalny rozwój, i wreszcie 3) pewien stopień wszechstronności metody montażu, aby umożliwić obrazowanie na różnych konfiguracjach obrazowania.
Ten protokół wprowadza technikę montażu do obrazowania rozwoju drobnicy D. rerio. Technika ta polega na montowaniu zarodków w taki sposób, że obszary głowy i woreczka żółtkowego są prawie całkowicie włączone do agarozy, pozostawiając tylny obszar ciała do wydłużenia i normalnego rozwoju. W związku z tym jest to również odpowiednia metoda do długoterminowego obrazowania innych obszarów rozwijającego się ciała, ponieważ agaroza umożliwia obrazowanie za pomocą standardowych technik obrazowania światłem. Protokół ten pokazuje montowanie zarodków w orientacji bocznej, chociaż możliwe jest również montowanie zarodków w orientacji alternatywnej. Pokaże również, w jaki sposób można dostosować metodę do pionowych, odwróconych i pionowych ustawień mikroskopii z arkuszami świetlnymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów i wyciągniętej igły szklanej
- Przygotować 25-krotny roztwór zapasowy Tricaine (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoowego, nazywany również etylem 3-aminobenzoat) o stężeniu 4 mg/mL w 20 mM Tris pH 8.8 i dostosować pH roztworu do wartości 7. Rozdzielić na aalikwoty po 4 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Środek znieczulający Tricaine działa preferencyjnie na neuronowe napięciowo zależne kanały sodowe, blokując w ten sposób drżenia i ruchy mięśni6. - Przygotować roztwór roboczy Tricaine o końcowym stężeniu 0,17 mg/ml w pożywce dla embrionów E3.7
UWAGA: Roztwór roboczy Tricaine należy przygotować bezpośrednio przed użyciem, ponieważ pH tego roztworu ulega zmianie. - Rozpuścić agarozę niskotopliwą do końcowego stężenia 1,5% w pożywce dla embrionów E3 w probówce o pojemności 50 mL, podgrzewając roztwór w mikrofalówce. Pozostawić roztwór do wyrównania temperatury do 42 - 45 °C w kąpieli wodnej lub inkubatorze laboratoryjnym. Jeśli przygotowywane są duże szalki do obrazowania arkuszem światła w układzie pionowym (krok 4), przygotować dodatkowe 25 mL 1% standardowej agarozy w pożywce dla embrionów E3.
- Użyć borokrzemowego szkła z kapilarami włóknistymi o wymiarach: średnica zewnętrzna (OD) 1,20 mm, średnica wewnętrzna (ID) 0,69 mm, długość 10 mm.
- Jeśli kapilary są wyciągane za pomocą wyciągacza igieł z drutem grzejnym opisanego w Tabeli sprzętu i odczynników, należy zastosować następujące ustawienia: Heat 60, Pull 120, Velocity 50, Time 25, Pressure 50. Za pomocą ostrych pęsety przełamać igłę tuż za punktem jej zgięcia, aby uzyskać czystą i ostrą igłę do orientacji embrionów i usuwania nadmiaru agarozy. Do usuwania nadmiaru agarozy można również użyć mikroskalpela.
2. Osadzanie zarodków do mikroskopii odwróconej lub prostej
- Hoduj zarodki w pożywce do zarodków E3 do osiągnięcia odpowiedniego stadium.7
- W odpowiednim stadium przeprowadzić dechorionację embrionów za pomocą pary ostrych pęset pod binokularowym mikroskopem stereoskopowym.
- Inkubować zdechorionowane embriony przez co najmniej 5 min w roboczym roztworze tricainy.
- Po ostygnięciu stopionego roztworu agarozy do 45 °Cza pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść zdechorionowany embrion bezpośrednio do probówki o pojemności 50 ml, przenosząc minimalną ilość medium E3.
- Wyjąć embrion wraz z około 1 ml medium montażowego i dodać ok. 100 µl medium montującego wraz z embrionem do centralnego kręgu szalki Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem i mikrootworem o średnicy 10 mm.
- Podczas twardnienia medium montażowego przesuń zarodek do krawędzi kręgu agarozy tak, aby ogon był skierowany na zewnątrz (Rycina 1A). Użyj igły kapilarnej, aby utrzymać embrion w pożądanej orientacji bocznej do momentu całkowitego stężenia żelu. Aby obrazować rozwój tylnej części ciała, należy zadbać o to, by zorientować embrion możliwie najbardziej bocznie. W związku z tym należy utrzymać embrion w tej pozycji, dokonując ostrożnych korekt za pomocą igły kapilarnej.
UWAGA: Na tym etapie, jeśli jest to wymagane, do naczynia montażowego można dodać wiele embrionów. W takim przypadku należy najpierw przenieść agarozę o niskiej temperaturze topnienia do naczynia, a następnie umieścić embriony w centrum kropli agarozy. Następnie należy przesunąć embriony w stronę krawędzi szklanego pierścienia i ustawić je w pożądanej pozycji. W ten sposób można zamontować do sześciu embrionów, zanim agaroza stężeje.
3. Usuwanie nadmiaru agarozy wokół tylnej części ciała
UWAGA: W tej sekcji opisano procedurę usuwania agarozy z obszaru otaczającego tylną część ciała. W przypadku wydłużania się tylnej części ciała ważne jest zapewnienie możliwości prawidłowego wzrostu ogona. Poprzez usunięcie agarozy po całkowitym otoczeniu zarodka agarozą, zarodek pozostaje zamknięty w obrębie regionu głowy oraz około połowy pęcherzyka żółtkowego.
- Po zastygnięciu kropli agarozy należy zalać szalkę Petriego pracującym roztworem Tricaine.
- Pod stereomikroskopem z podstawą z oświetleniem przeświecającym należy ustawić położenie lustra oraz kąt padania światła tak, aby uzyskanym silnym kontrastem zapewnić wyraczną widoczność nacięć w agarozie przez cały czas trwania operacji.
- Aby wykonać cięcie 1 (Rycina 1), użyj igły kapilarnej lub mikroskalpela, aby przeciąć agarozę w połowie długości żółtka, od pozycji znajdującej się tuż za tworzącym się polem serca do pozycji 5. somitu (5.th przedni somit).
- Wykonaj pierwsze cięcie w sąsiedztwie formującego się serca, zgodnie z rysunkiem, przecinając całkowicie agarozę aż do szkła.
- Należy utrzymać kapilarę lub mikroskalpel głęboko w agarozie i powoli przesuwać go w górę i w dół, wykonując długie cięcie nad embrionem, zgodnie z pokazaną instrukcją. Rysunek 1Przeciąć jak najbliżej zarodka, uważając, aby nie przebić zarodka ani żółtka.
- Następnie wykonaj nacięcia 2 i 3 (Rysunek 1), zaczynając od pozycji przeciwległej do zarodka, prowadząc cięcie aż do szklanego dna naczynia. Wykonać cięcie nr 2 w sposób styczny do pierwszych pięciu somytów, aby umożliwić pełne rozłożenie tylnej części ciała w kierunku grzbietowym. Wykonać cięcie nr 3 w 90° kąt względem powierzchni żółtka, zaczynając od pola sercowego.
UWAGA: Wycinanie agarozy aż do krawędzi szklanego okręgu (jak pokazano w Rycina 1) pomaga w usunięciu agarozy jako jednego bloku (krok 3.6). Nie jest to jednak konieczne. - Zaczynając od miejsca przecięcia nacięć 1 i 3, wykonaj powolne cięcie ukośne w kierunku końca nacięcia 2, jednocześnie powoli unosząc narzędzie w górę, aby uwolnić kwadrat agarozy otaczający tylną część ciała.
Uwagi: W niektórych przypadkach materiał zostanie uwolniony w jednym bloku i operacja zostanie zakończona za jednym razem. W innych przypadkach może być konieczne kilkukrotne powtórzenie czynności, aby usunąć całą agarozę otaczającą embrion. - Za pomocą pary ostrych pęset usuń przemieszczone bloki agarozy z medium dla embrionów. Aby ułatwić ten proces, przesuń fragmenty agarozy na bok naczynia i wykorzystaj ściankę szalki Petriego jako podparcie podczas wyjmowania fragmentów agarozy.
Rysunek 1: Schematy układów montażowych. (ASchemat przedstawia położenie zamocowanego zarodka wewnątrz szklanego pierścienia w centrum szalki Petriego. Po prawej stronie znajduje się powiększenie zarodka, na którym kolejne cięcia przez otaczającą agarozę zaznaczono czerwonymi liniami przerywanymi.BZamocowane zarodki przedstawiono na schemacie w widoku bocznym, co obrazuje łatwość dostępu zarówno dla obiektywów odwróconych, jak i prostych.C) Podobny schemat przedstawiający sposób montażu embrionów do układów obrazowania arkuszowego światła w orientacji pionowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Jeśli drgania mięśni nie zostaną w tym momencie całkowicie zablokowane, należy dodać krople Tricaine z roztworu zapasowego o stężeniu 4 mg/ml, pH 7.
4. Montowanie zarodków do pionowej mikroskopii arkusza światła
UWAGA: Jest to modyfikacja metody opisanej powyżej, która umożliwia dostęp do wielu obiektywów podczas obrazowania próbek za pomocą pionowo zorientowanego SPIM. Pomysłem stojącym za tą modyfikacją jest uniesienie próbki nieco powyżej dna naczynia, aby zapewnić łatwy dostęp dla dwóch obiektywów obrazujących.
- Przed montażem próbki, pokryj plastikową szalkę Petriego o średnicy 10 mm warstwą 1% agarozy w medium E3 o wysokości 5 mm i pozostaw do zastygnięcia.
- Nanieś w centrum szalki kroplę 1 ml agarozy niskotopliwej i pozostaw do zastygnięcia.
- Zatop embriony w agarozie niskotopliwej zgodnie z opisem w sekcji 2. Jednak tym razem wyjmij embrion z probówki 50 ml z agarozą za pomocą mniejszej ilości roztworu (0,5 ml) i umieść tę małą kroplę na wierzchu kropli 1 ml w centrum szalki.
- Użyj igły kapilarnej, aby umieścić embrion w centrum małej kropli i utrzymać jego prawidłową orientację do momentu zastygnięcia żelu.
- Zalej szalkę roztworem roboczym Tricaine i usuń nadmiar agarozy zgodnie z opisem w sekcji 3, ale bez przecinania poduszki ze standardowej 1% agarozy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany powyżej protokół szczegółowo przedstawia wszechstronną technikę montowania zarodków ryby danio pręgowanej do długoterminowego obrazowania poklatkowego. Przykład tej metody pokazano na Rysunku 2A oraz na animowanym Rysunku 1 (wideo). Zarodki zostały wstrzyknięte na etapie 1 komórki mRNA kodującym fotokonwertowalne białko fluorescencyjne kikumeGR. Na etapie 15 somitów zostały one zamontowane zgodnie z powyższym opisem i obrazowano przez 12 hr za pom...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta technika mocowania umożliwia utrzymanie zarodków w bezruchu podczas transferu do mikroskopu oraz podczas długotrwałych eksperymentów obrazowania poklatkowego, mających na celu śledzenie wydłużenia tylnej części ciała w wielu skalach długości. Co więcej, jest wszechstronny, ponieważ pozwala na obrazowanie zarówno w pionowych, jak i odwróconych ustawieniach mikroskopowych, a także zasugerowano, w jaki sposób można go jeszcze bardziej dostosować do pionowo zorientowanego SPIM.
Krytycznym kroki...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Estelle Hirsinger: Podstawowe finansowanie z Instytutu Pasteura i Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger jest pracownicą Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon był finansowany przez Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS), następnie stypendium Roux (Institut Pasteur), a następnie stypendium AFM-Téléthon (numer 16829). Obecnie jest wspierany przez Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE | |||
| Naczynia ze szklanym dnem | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm szalka Petriego, 10 mm mikrostudzienka. Nr 1.5 szklane nakrycie |
| Kapilary na igły iniekcyjne& | nbsp; Sutter | BF 120-94-10 | Używamy szkła orokrzemianowego z żarnikiem, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, długość 10 cm. Jednak igły z filamentem nie są konieczne i większość standardowych igieł iniekcyjnych powinna działać. |
| Mikroskalpel | Feather | P-715 | Jednorazowy skalpel okulistyczny Micro Feather z plastikową rączką |
| Pipety | o długości 230 mm | ||
| ODCZYNNIKI | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| < mocne>SPRZĘT | |||
| Kleszcze precyzyjne | NARZĘDZIA NAUKOWE GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Ściągacz igieł | Sutter | P97 | Ściągacz igieł do żarnika grzewczego |
| Lornetka do mikroskopu preparacyjnego | Leica | S8 Apo |
Bibliografia
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
