Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55215

⸱

12 marca 2017

 ,  , 
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Streszczenie

Ten raport opisuje protokół przygotowania grubych próbek biologicznych do dalszych obserwacji za pomocą skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Opisano w nim również metodę obrazowania służącą do badania struktury 3D grubych próbek biologicznych za pomocą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej. Protokół przygotowania próbki opiera się na konwencjonalnych metodach, w których próbka jest utrwalana za pomocą środków chemicznych, traktowana środkiem kontrastującym z ciężką solą atomową, odwadniana w serii kąpieli etanolowych i zatopiona w żywicy. Następnie opisano specyficzne warunki obrazowania dla obserwacji grubych próbek za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Przekroje próbki obserwuje się przy użyciu metody przezogniskowania, polegającej na zebraniu kilku obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowych. Umożliwia to odzyskanie informacji o ostrości na różnych wysokościach w całej próbce. Ten konkretny wzór zbierania jest wykonywany przy każdym kącie nachylenia podczas zbierania danych tomograficznych. Następnie generowany jest pojedynczy obraz, łączący informacje o ostrości ze wszystkich różnych płaszczyzn ogniskowych. Następnie generowany jest klasyczny zestaw danych serii pochylenia. Zaletą tej metody jest to, że wyrównywanie i rekonstrukcję serii uchyłów można wykonać przy użyciu standardowych narzędzi. Gromadzenie obrazów przezogniskowych pozwala na rekonstrukcję objętości 3D, która zawiera wszystkie szczegóły strukturalne próbki w pozycji wyostrzonej.

Wprowadzenie

Od początku lat siedemdziesiątych, metody tomografii w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) są szeroko stosowane do strukturalnej charakterystyki próbek biologicznych1,2,3. Atrakcyjność transmisyjnej tomografii elektronowej polegała na tym, że można ją wykorzystać do badania szerokiego zakresu struktur biologicznych w skali nanometrowej, od architektury komórek i ultrastruktury organelli po strukturę kompleksów makromolekularnych i białek. Niemniej jednak transmisyjna tomografia elektronowa nie mogła być stosowana do badania bardzo grubych próbek (większych niż 0,5 μm). Rzeczywiście, grube próbki wytwarzają zbyt wiele rozproszonych elektronów, generując obrazy o niskim stosunku sygnału do szumu (SNR). Ponadto tomografia polega na zbieraniu obrazów przechylonych próbek, przy czym pozorna grubość próbki zwiększa się wraz z kątem nachylenia. Mimo że rozpraszanie nieelastyczne można odfiltrować za pomocą filtrów energetycznych, krytyczna ilość elektronów potrzebna do uzyskania obrazów o wysokim SNR jest ledwo osiągana w TEM. W związku z tym grube próbki biologiczne były badane tylko przy użyciu sectioning4.

Niektóre próbki nie mogą być pokrojone: niektóre mogą ulec degradacji podczas cięcia, a inne muszą być zbadane w całości, aby zrozumieć ich złożoność. Alternatywnym podejściem jest użycie TEM w trybie skanowania5,6,7,8. W skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) ścieżka optyczna elektronów jest inna niż w konwencjonalnym TEM. Elektrony przechodzące przez próbkę bez rozpraszania mogą być zbierane na osi optycznej za pomocą detektora jasnego pola (BF) 9, podczas gdy te rozproszone elastycznie mogą być zbierane pod pewnym kątem od osi optycznej za pomocą detektora ciemnego pola (DF). Inną zaletą STEM jest to, że skupiona wiązka elektronów jest skanowana na powierzchni próbki, co umożliwia zbieranie obrazów piksel po pikselu. Mimo że wiązka elektronów rozszerza się podczas przechodzenia przez sample10, ten konkretny schemat zbierania jest mniej wrażliwy na nieelastycznie rozproszone elektrony niż konwencjonalny TEM. Co więcej, w STEM nie ma soczewki po próbce, co pozwala uniknąć aberracji chromatycznych, które mogą wystąpić w TEM. Długość kamery można regulować tak, aby detektor BF wykrywał głównie nierozproszone elektrony. Używanie detektora DF do badania grubych próbek nie jest zalecane ze względu na wielokrotne rozpraszanie, które daje niedokładne obrazy. Zamiast tego można użyć detektora BF11. Chociaż STEM może generować obrazy o wysokim SNR, ma stosunkowo niską głębię ostrości ze względu na stosunkowo wysoką zbieżność wiązki w porównaniu z TEM, co zmniejsza ilość szczegółowych informacji, które można uzyskać z grubych próbek. W przypadku mikroskopów STEM z korekcją aberracji, w których kąt zbieżności może wynosić nawet 30 mrad, głębia ostrości może być na tyle niska, że informacje o ostrości pochodzą z płaszczyzny ogniskowej wynoszącej zaledwie kilka nanometrów. Ustawienie wiązki elektronów w trybie równoległym zwiększa głębię ostrości wiązki elektronów ze szkodą dla resolution12. Jednak taka konfiguracja nie zawsze jest możliwa.

Kiedykolwiek konieczne jest użycie zbieżnej wiązki elektronów, należy użyć technik, które zwiększają głębię ostrości wiązki elektronów podczas badania grubych próbek. Ostatnie badania wykazały pozyskiwanie wielu obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowych w całej próbce w celu odzyskania maksymalnej ilości informacji o ostrości13,14. Oba badania opisują różne sposoby radzenia sobie z informacjami z różnych płaszczyzn ogniskowych. Hovden i in. połączyli w przestrzeni Fouriera obrazy, które zostały zebrane w różnych płaszczyznach ogniskowych, a ostateczną rekonstrukcję uzyskano bezpośrednio z 3D odwrotnej transformaty Fouriera13. W przeciwieństwie do tego, Dahmen i in. opracowali silnik rekonstrukcji wiązki konwergentnej, aby zrekonstruować w przestrzeni rzeczywistej objętość 3D z różnych płaszczyzn ogniskowych14. Nasze laboratorium opracowało również metodę obrazowania grubych próbek biologicznych. Nasza strategia różniła się od dwóch metod opisanych powyżej tym, że połączyliśmy informacje, które są ostre w różnych płaszczyznach ogniskowych i zrekonstruowaliśmy ostateczną objętość 3D w przestrzeni rzeczywistej za pomocą projektora o równoległej wiązce15. Naszym celem było opracowanie metody, którą z łatwością można wykonać w każdym laboratorium mikroskopii elektronowej. W tym celu staraliśmy się zebrać obrazy ogniskowe w ograniczonym czasie, porównywalnym z ramami czasowymi konwencjonalnych eksperymentów tomograficznych. Ponadto proponowana przez nas metoda może zostać dostosowana do użytku z różnymi typami oprogramowania do osiowania i rekonstrukcji.

W kontekście naszej publikacji z 2015 roku15, chcieliśmy zwizualizować i scharakteryzować odzyskiwanie głębi ostrości, więc użyliśmy dużego półkąta zbieżności wynoszącego 25 mrad. Poniżej przedstawiamy krok po kroku protokół wykonywania obrazowania przezogniskowego w STEM według metody opracowanej w naszym laboratorium w 2015 roku15, a także prezentujemy, w jaki sposób przetworzono dane z 2015 roku. Metoda ta pozwala na odzyskanie ostrych informacji z kilku płaszczyzn ogniskowych w grubej próbce biologicznej (750 nm) i umożliwia wysokiej jakości rekonstrukcje 3D. W stosownych przypadkach przedstawiono również różnice w tej metodologii w porównaniu z metodami stosowanymi przez inne grupy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Przed użyciem odczynników należy zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów (MSDS). Kilka z chemikaliów stosowanych podczas przygotowywania próbek jest toksycznych, rakotwórczych, mutagennych i/lub reprotoksycznych. Podczas pracy z próbką należy stosować środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i pełne obuwie) oraz pracować pod dygestorium. Wycinanie sekcji próbki za pomocą ultramikrotomu wiąże się z użyciem ostrych narzędzi, których ostrożne posługiwanie się jest obowiązkowe. W poniższych krokach autorzy zakładają, że próbka pochodzi z hodowli komórkowej. Protokół może wymagać modyfikacji w zależności od rodzaju próbki, szczególnie w odniesieniu do etapów wirowania.

1. Przygotowanie buforów i mieszanin

  1. Przygotować roztwór soli buforowanej fosforanowo (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 oraz 1,76 mM KH2PO4).
  2. Przygotować roztwory zawierające 30%, 50% i 70% etanolu w PBS do odwodnienia próbek. Odwodnienie próbek przeprowadzić poprzez stopniową inkubację w roztworach o rosnącym stężeniu etanolu.
  3. Przygotować żywicę epoksydową, mieszając bisfenol-A-(epichlorohydrynę) (20 mL), bezwodnik dodecenylobursztynowy (9 mL), kwas metylo-5-norbornen-2,3-dikarboksylowy (11 mL) oraz 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol (0,7 mL); w zależności od pożądanej twardości żywicy można zastosować inne proporcje mieszania.
  4. Przygotować roztwory zawierające 30%, 50% i 70% żywicy epoksydowej w etanolu do zatopienia próbek. Zatopienie w żywicy przeprowadzić poprzez stopniową inkubację próbek w roztworach o rosnącym stężeniu żywicy.
    UWAGA: Objętości przygotowanych roztworów zależą od rodzaju badanej próbki. W przypadku tkanek wymagane jest więcej roztworów niż w przypadku kultur komórkowych.

2. Fixacja i barwienie próbki

  1. Wirować hodowlę komórkową przez 5 min przy 5,000 x g. Wszystkie kolejne wirowania należy przeprowadzać w tych samych warunkach.
  2. Odlać supernatant i utrwalić osad komórkowy, resuspending go w PBS (1 mL) z 4% paraformaldehydem i 2% glutaraldehydem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min (Rycina 1A). Alternatywnie można utrwalać komórki w temperaturze 4 °C przez noc lub przez cały weekend.
  3. Po wirowaniu usunąć supernatant i przemyć osad 3 razy PBS (1 mL), aby całkowicie usunąć środki utrwalające.
  4. Przeprowadzić post-utrwalanie próbki za pomocą 1% OsO4 w PBS (1 mL) przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  5. Po wirowaniu usunąć supernatant i przemyć osad 3 razy PBS (1 mL), aby całkowicie usunąć OsO4. OsO4 należy zdezaktywować w oleju i zutylizować.
  6. Dodać 2% octan uranylu w PBS (1 mL) jako środek kontrastowy i inkubować próbkę przez 30 min w temperaturze pokojowej (Rycina 1B).
  7. Po wirowaniu usunąć supernatant i przemyć osad 3 razy PBS (1 mL), aby usunąć niezwiązany octan uranylu; octan uranylu zawiera pierwiastki promieniotwórcze i powinien być utylizowany w pojemniku przeznaczonym do odpadów radioaktywnych.
    UWAGA: Czas inkubacji można modyfikować w zależności od wielkości próbki. Na przykład utrwalanie i barwienie grubszych próbek, takich jak próbki tkanek, wymaga dłuższego czasu inkubacji. Dłuższe czasy inkubacji mogą być również korzystne w etapach odwadniania i zatapiania. Octan uranylu można zastąpić roztworem „bezuranylowym” zawierającym sole gadolinu.

3. Odwodnienie próbki

  1. Po wirowaniu odlej supernatant i inkubuj próbkę przez 30 min w temperaturze 4 °C w PBS (1 mL) z 30% etanolem (Rycina 1C).
  2. Powtórz krok 3.1, stosując roztwory o stopniowo zwiększonym stężeniu etanolu (50%, 70% i do 100%). Podczas tych etapów odwadniania utrzymuj próbkę w temperaturze 4 °C w celu jej konserwacji.
  3. Po wirowaniu odlej supernatant i resuspenduj osad w czystym etanolu (1 mL); inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.

4. Zatapianie w żywicy

  1. Po wirowaniu odrzucić nadsącz i resuspender osad w etanolu z 30% żywicą epoksydową (1 mL) przez 30 min w temperaturze pokojowej (Rycina 1D).
  2. Powtórzyć krok 4.1, stosując roztwory z stopniowo zwiększanym stężeniem żywicy epoksydowej (50%, 70% i do 100%).
  3. Po wirowaniu odrzucić nadsącz i resuspender osad w czystej żywicy epoksydowej (1 mL); inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Obecność utwardzacza DMP-30 może zainicjować polimeryzację żywicy; w takim przypadku przygotować dwie partie żywicy epoksydowej, jedną z DMP-30 i jedną bez DMP-30.
  4. Po wirowaniu resuspender osad w 200 µL czystej żywicy epoksydowej (zawierającej utwardzacz) w plastikowej kapsułce; próbka powinna znajdować się na dnie kapsułki.

5. Polimeryzacja żywicy

  1. Inkubować plastikową kapsułkę zawierającą próbkę w inkubatorze ustawionym na 60 °C przez 48 h; inne rodzaje żywic mogą polimeryzować w innych warunkach.
  2. Wyjąć kapsułkę z inkubatora i sprawdzić, czy żywica spolimeryzowała; żywica powinna być twarda przy nacisku na twardą powierzchnię.
  3. Dodać czystą żywicę epoksydową (zawierającą utwardzacz) na wierzch spolimeryzowanej żywicy zawierającej próbkę; ta dodatkowa warstwa żywicy ułatwi wycięcie próbki. Inkubować kapsułkę w 60 °C przez 48 h.

6. Sekcjonowanie próbek

  1. Zamocuj próbkę do góry nogami w uchwycie do preparatów w taki sposób, aby próbka znajdowała się u góry, a następnie przymocuj go do bloku przycinającego ultramikrotomu. Mocno zablokuj dźwignię, aby zabezpieczyć blok przycinający na ultramikrotomie.
  2. Używając żyletki lub podobnego ostrego narzędzia tnącego, wytnij plastikową kapsułkę, aby oddzielić ją od spolimeryzowanej żywicy. Przytnij żywicę tak, aby próbka była zawarta w żywicy w kształcie zbliżonym do piramidy. Nie ma potrzeby usuwania całej plastikowej kapsułki; usuń tylko część pokrywającą spolimeryzowaną próbkę.
  3. Zdejmij kapsułkę wraz z uchwytem do preparatów z bloku przycinającego i zainstaluj je na ruchomym ramieniu ultramikrotomu.
  4. Zainstaluj nóż do przycinania w bloku noża i precyzyjnie przytnij ściany piramidy. Zaleca się użycie binokularów, aby nadać piramidzie idealny kształt; im lepszy kształt piramidy, tym lepsze będą otrzymane przekroje.
  5. Zdejmij nóż do przycinania i zastąp go nożem histologicznym, który można wykorzystać do wycinania przekrojów o grubości większej niż 0.5 µm.
  6. Po napełnieniu kuwety noża histologicznego odpowiednią ilością wody, doprowadź ostrze noża do powierzchni próbki i za pomocą binokularów dostosuj kąt nachylenia kapsułki tak, aby nóż przecinał piramidę prostopadle.
  7. Dostosuj prędkość cięcia zgodnie z pożądaną grubością przekroju, aby uzyskać jednorodne sekcje.
  8. Pozwól, aby przekrój unosił się na powierzchni wody, a następnie wyłów go za pomocą pętelki.
  9. Przesuń pętelkę w stronę miedzianej siatki do mikroskopii elektronowej, która została umieszczona na papierze filtracyjnym.
    UWAGA: Siatka powinna zostać wcześniej poddana obróbce w celu zwiększenia jej hydrofilowości. Można to zrobić za pomocą pisaka do powlekania siatek.
  10. Dzięki absorpcji wody przez papier filtracyjny przekrój przywrze do siatki. Pozostaw go do wyschnięcia przez kilka minut przed wprowadzeniem do mikroskopu elektronowego.

7. Projekt serii pochyleń w całym zakresie ogniskowania

  1. Należy zebrać obrazy w serii przezogniskowej (through-focal) w stałych odstępach ogniskowania.
    UWAGA: Seria przechyłów przezogniskowych składa się z zestawu obrazów przezogniskowych, które są zbierane dla każdego kąta przechyłu w serii przechyłowej. Całkowita amplituda ogniskowania powinna być wystarczająca, aby objąć pełną grubość próbki.
  2. Należy określić wartość odstępu ogniskowania. Jeśli odstęp jest równy głębokości ostrości, cała próbka zostanie zarejestrowana w ostrości; ustawienie to reprezentuje najwyższą możliwą częstotliwość próbkowania. Jeśli odstęp jest większy niż głębokość ostrości, niektóre części próbki nie zostaną zarejestrowane w ostrości, co oznacza, że fragmenty próbki pozostaną nieostre.
  3. Głębokość ostrości wiązki elektronów oblicza się na podstawie długości fali elektronów oraz półkąta zbieżności wiązki elektronowej. Ponieważ długość fali elektronów jest bezpośrednio powiązana z napięciem przyspieszającym, należy użyć półkąta zbieżności podanego przez producenta mikroskopu elektronowego lub wyznaczyć go eksperymentalnie z obrazu dyfrakcyjnego znanego preparatu16. Biorąc pod uwagę, że elektrony przyspieszane do długości fali λ uderzają w próbkę z półkątem zbieżności α w mikroskopie elektronowym, należy zastosować następujący wzór do wyznaczenia głębokości ostrości (DOF):

    figure-protocol-1
  4. Należy zaprojektować serię ogniskową w taki sposób, aby całkowita amplituda ogniskowania objęła próbkę przy jej maksymalnej grubości pozornej (tj. przy największym przechyle).
    UWAGA: Próbka o grubości 0,75 µm będzie miała grubość pozorną 2,19 µm przy przechyle 70°, zatem amplituda ogniskowania powinna być większa niż 2,19 µm. W przypadku tej próbki, jeśli wyznaczony powyżej odstęp ogniskowania wynosi 50 nm, wymagane będzie wykonanie 44 obrazów (2,19 µm/50 nm), aby objąć próbkę przy jej maksymalnej grubości pozornej. Całkowita amplituda ogniskowania jest równa wartości odstępu ogniskowania pomnożonej przez liczbę kroków ogniskowania. Przy największym przechyle (θ) grubość pozorna próbki jest definiowana następująco:

    figure-protocol-2

8. Obrazowanie próbek

UWAGA: Zakres niniejszego protokołu nie obejmuje opisu konfiguracji mikroskopu elektronowego w trybie STEM; większość tych informacji znajduje się w instrukcji obsługi dostarczonej przez producenta mikroskopu elektronowego. Należy jednak zwrócić uwagę na następujące kwestie: i) rozmiar plamki (spot size) powinien być dobrany zgodnie z pożądanym powiększeniem; ii) ronchigram musi być odpowiednio ustawiony; oraz iii) w trybie BF należy dostosować długość drogi optycznej kamery, aby wybrać elektrony nierozproszone, zachowując jednocześnie dobre oświetlenie detektora. Przekroje w żywicy osadzone na miedzianych siatkach do mikroskopii elektronowej powinny zostać oświetlone przed akwizycją obrazu, aby zapobiec kurczeniu. Kurczenie się żywicy oraz efekty ładowania mogą nakładać się na siebie podczas akwizycji obrazu. Zastosowanie przysłony obiektywu może poprawić stabilność próbki w przypadku wystąpienia efektów ładowania. Jednak w przypadku konfiguracji STEM przysłona obiektywu nie jest kompatybilna z trybem obrazowania HAADF, a bardzo małe przysłony obiektywu nie są kompatybilne z trybem obrazowania BF.

  1. Przy użyciu niskiego powiększenia (około 20 000X w STEM), przejrzyj próbkę i zlokalizuj obszar zainteresowania.
  2. Dostosuj wysokość eukentryczną (oś Z) tak, aby obszar zainteresowania nie przesuwał się podczas obracania próbki.
  3. Upewnij się, że badany obiekt pozostanie widoczny w całym zakresie pochylenia.
  4. Ze względu na znaczną liczbę obrazów pozyskiwanych podczas serii pochyleń przezogniskowych (through-focal tilt-series), użyj oprogramowania do automatycznego zbierania danych. Można wykorzystać rozwiązanie komercyjne lub, w razie potrzeby, zaprojektować własne oprogramowanie do akwizycji danych. Upewnij się, że program jest w stanie wykonać następujące trzy kroki:
    1. Śledzenie i ogniskowanie zgodnie ze standardnym schematem zbierania serii pochyleń.
    2. Zapewnienie, że obrazy przezogniskowe pokrywają się z pozycją Z próbki.
    3. Automatyczne pozyskiwanie serii obrazów przezogniskowych dla każdego kąta pochylenia.
  5. Wprowadź do programu główne parametry serii pochyleń przezogniskowych (t.j. interwały ogniskowania, krok ogniskowania, minimalny kąt pochylenia, maksymalny kąt pochylenia, krok pochylenia oraz prędkość skanowania).
  6. Uruchom proces zbierania obrazów i poczekaj na zakończenie pracy programu.

9. Przetwarzanie obrazu

UWAGA: W niniejszym protokole przetwarzanie serii pochyleń w obrębie płaszczyzny ogniskowania (through-focal tilt-series) jest wykonywane przy użyciu wtyczek ImageJ17. Dane uzupełniające 1 zawierają makro ImageJ dla etapu wyrównywania (Turboreg) oraz dla łączenia informacji w ostrości (Extended Depth of Field) dla serii pochyleń w obrębie płaszczyzny ogniskowania zaprojektowanej dla trzech wartości ogniskowania.

  1. Wyrównaj obrazy zebrane pod tym samym kątem nachylenia (t. j. obrazy wzdłuż płaszczyzny ogniskowej). Ponieważ obrazy nie zawierają tych samych informacji w obszarze ostrości, nie posiadają tych samych cech umożliwiających dopasowanie; należy przeprowadzić wyrównanie poprzez dopasowywanie sąsiadujących obrazów parami (t. j. zgodnie z hierarchią piramidową, zaczynając od najbliższych wartości ostrości, przy użyciu Turboreg18, wtyczka do programu ImageJ.
  2. Należy konsekwentnie weryfikować wyrównanie obrazów przezogniskowych dla każdego kąta nachylenia. Następnie należy nałożyć wyrównane obrazy przezogniskowe w stos, aby usprawnić inspekcję wizualną.
    UWAGA: Podczas przeglądania stosu obrazów przesuwać należy wyłącznie obszar znajdujący się w ostrości. Precyzyjne wyrównanie jest kluczowe, ponieważ kolejny etap polega na odzyskaniu informacji znajdujących się w ostrości z różnych obrazów.
  3. Połącz informacje znajdujące się w obszarze ostrości, stosując rozszerzoną głębię ostrości (Extended Depth of Field)19, wtyczka do programu ImageJ; pozwoli to ostatecznie wygenerować pojedynczy obraz ze stosu obrazów. Podczas odzyskiwania głębi ostrości można zastosować kilka ustawień, jednak należy użyć wartości najwyższych, aby zachować informacje obrazowe.
    UWAGA: Seria pochyleń składa się obecnie z jednego obrazu na każdy kąt pochylenia, przy czym każdy obraz zawiera informacje w ostrości odzyskane z obrazów z przesunięciem ogniska (through-focal).
  4. Przetwórz dane.
    UWAGA: Można stosować standardowe narzędzia do dopasowania i rekonstrukcji, ponieważ dane zostały zredukowane do standardowej serii pochyleń. W niniejszym protokole do dopasowania i rekonstrukcji danych wykorzystano program TomoJ.20,21Więcej szczegółów dotyczących użytkowania programu TomoJ można znaleźć w oryginalnej publikacji.22.
  5. Przeprowadź precyzyjne wyrównanie serii pochyleń.
    UWAGA: Skuteczną strategią jest wykorzystanie złotych kulek jako markerów referencyjnych w celu dokładnego śledzenia przesunięć między obrazami. W przypadku braku możliwości dodania złotych kulek do próbki można wykorzystać lokalne minima.
  6. Przeprowadź rekonstrukcję 3D wyrównanych danych; do wykonywania rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej lub przestrzeni Fouriera dostępnych jest kilka algorytmów, z których każdy posiada określone zalety i ograniczenia.
  7. Jeśli końcowe wyrównanie serii pochyleń jest niewystarczające, należy wprowadzić poprawki poprzez optymalizację początkowych etapów. W przypadku, gdy końcowa rekonstrukcja 3D wydaje się rozmyta lub zdeformowana, należy powtórzyć kroki wyrównywania; w praktyce im większa liczba zebranych płaszczyzn ogniskowych, tym lepszy kontrast i szczegółowość rekonstrukcji 3D.
    UWAGA: Do przetwarzania serii pochyleń wzdłuż osi ostrości (through-focal tilt-series) można wykorzystać wiele programów komputerowych. Narzędzia zastosowane w niniejszym protokole zostały jednak wybrane dlatego, że w naszym doświadczeniu sprawdziły się najlepiej. Turboreg18 wykazał się lepszą skutecznością w dopasowywaniu obrazów w przypadku występowania gradientu ostrości. Więcej informacji znajduje się na dedykowanej stronie internetowej23Wtyczka Extended Depth of Field (rozszerzonej głębi ostrości)19 wykazały się bardzo wysoką skutecznością w odzyskiwaniu informacji ostrych z różnych obrazów, podczas gdy inne narzędzia prowadziły do widocznych modyfikacji pikseli. Więcej informacji, w szczególności w zakresie pisania skryptów, znajduje się na tej dedykowanej stronie internetowej24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W naszym badaniu elektrony przyspieszono do 200 kV w transmisyjnym mikroskopie elektronowym z działem emisji polowej. Obrazy gromadzono w trybie STEM BF, stosując czas przebywania sonda 20 µs. W odniesieniu do projektu serii przechyłów przez płaszczyznę ogniskowania ustalono, że interwały ogniskowania wynoszące 150 nm dawały satysfakcjonujące wyniki w badaniu ultrastrukturalnym próbki biologicznej o grubości 750 nm – mimo że głębia ostrości wiązki elektronów wynosiła zaledwie 3 nm – ponie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy konwencjonalny protokół przygotowania próbki wraz z przewodnikiem krok po kroku dotyczącym wykonywania analizy 3D na grubych próbkach biologicznych za pomocą tomografii przezogniskowej STEM. Osadzanie próbek biologicznych w żywicy jest stosowane od dziesięcioleci26 , a alternatywne protokoły, które są dostosowane do różnych rodzajów próbek, można znaleźć w literaturze27. Natomiast obrazowanie grubych próbek w STEM przy użyciu metod przezskórnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z dwóch grantów ANR (ANR-11-BSV8-016 i ANR-10-IDEX-0001-02). Dziękujemy również PICT-IBiSA za zapewnienie dostępu do sprzętu do obrazowania chemicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP4417
EtanolSigma-Aldrich2860
Żywica epoksydowaEMS14120
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Dodaj proszek paraformaldehydu do PBS podgrzanego w temperaturze około 60 °C.
Zwiększ pH, dodając 1 N NaOH, aż nie będzie widoczny proszek PFA.
Aldehyd glutarowySigma-AldrichG5882 
Tetroksyd osmuEMS19150
Octan uranyluSigma-Aldrich73943
Kapsułka żelatynowaEMS70110
Noże do przycinania i histoDystrybucja LFGdiamentowe Diatome
Mikroskopia elektronowa siatka miedzianaDystrybucja LFG PióroG200-Cu
LFG Distribution70624
Uchwyt na próbkiJEOLEM-21311 Mikroskop elektronowy HTR
JEOLJEM-2200FS
Noże do powlekania siatki

Bibliografia

  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124(2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroskopia elektronowaprzygotowanie próbekobrazowanie przez ogniskodopasowanie serii pochyleńrekonstrukcja 3Dzatapianie w żywicyultramikrotomiatryb wiązki zbieżnej
Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.