Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

DOI:

10.3791/55215

⸱

12 marca 2017

 ,  , 
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje protokół przygotowania grubych próbek biologicznych do dalszych obserwacji za pomocą skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Opisano w nim również metodę obrazowania służącą do badania struktury 3D grubych próbek biologicznych za pomocą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej. Protokół przygotowania próbki opiera się na konwencjonalnych metodach, w których próbka jest utrwalana za pomocą środków chemicznych, traktowana środkiem kontrastującym z ciężką solą atomową, odwadniana w serii kąpieli etanolowych i zatopiona w żywicy. Następnie opisano specyficzne warunki obrazowania dla obserwacji grubych próbek za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Przekroje próbki obserwuje się przy użyciu metody przezogniskowania, polegającej na zebraniu kilku obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowych. Umożliwia to odzyskanie informacji o ostrości na różnych wysokościach w całej próbce. Ten konkretny wzór zbierania jest wykonywany przy każdym kącie nachylenia podczas zbierania danych tomograficznych. Następnie generowany jest pojedynczy obraz, łączący informacje o ostrości ze wszystkich różnych płaszczyzn ogniskowych. Następnie generowany jest klasyczny zestaw danych serii pochylenia. Zaletą tej metody jest to, że wyrównywanie i rekonstrukcję serii uchyłów można wykonać przy użyciu standardowych narzędzi. Gromadzenie obrazów przezogniskowych pozwala na rekonstrukcję objętości 3D, która zawiera wszystkie szczegóły strukturalne próbki w pozycji wyostrzonej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od początku lat siedemdziesiątych, metody tomografii w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) są szeroko stosowane do strukturalnej charakterystyki próbek biologicznych1,2,3. Atrakcyjność transmisyjnej tomografii elektronowej polegała na tym, że można ją wykorzystać do badania szerokiego zakresu struktur biologicznych w skali nanometrowej, od architektury komórek i ultrastruktury organelli po strukturę kompleksów makromolekularnych i białek. Niemniej jednak transmisyjna tomografia elektronowa nie mogła być stosowana do badania bardzo grubych próbek (większych niż 0,5 μm). Rzeczywiście, grube próbki wytwarzają zbyt wiele rozproszonych elektronów, generując obrazy o niskim stosunku sygnału do szumu (SNR). Ponadto tomografia polega na zbieraniu obrazów przechylonych próbek, przy czym pozorna grubość próbki zwiększa się wraz z kątem nachylenia. Mimo że rozpraszanie nieelastyczne można odfiltrować za pomocą filtrów energetycznych, krytyczna ilość elektronów potrzebna do uzyskania obrazów o wysokim SNR jest ledwo osiągana w TEM. W związku z tym grube próbki biologiczne były badane tylko przy użyciu sectioning4.

Niektóre próbki nie mogą być pokrojone: niektóre mogą ulec degradacji podczas cięcia, a inne muszą być zbadane w całości, aby zrozumieć ich złożoność. Alternatywnym podejściem jest użycie TEM w trybie skanowania5,6,7,8. W skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) ścieżka optyczna elektronów jest inna niż w konwencjonalnym TEM. Elektrony przechodzące przez próbkę bez rozpraszania mogą być zbierane na osi optycznej za pomocą detektora jasnego pola (BF) 9, podczas gdy te rozproszone elastycznie mogą być zbierane pod pewnym kątem od osi optycznej za pomocą detektora ciemnego pola (DF). Inną zaletą STEM jest to, że skupiona wiązka elektronów jest skanowana na powierzchni próbki, co umożliwia zbieranie obrazów piksel po pikselu. Mimo że wiązka elektronów rozszerza się podczas przechodzenia przez sample10, ten konkretny schemat zbierania jest mniej wrażliwy na nieelastycznie rozproszone elektrony niż konwencjonalny TEM. Co więcej, w STEM nie ma soczewki po próbce, co pozwala uniknąć aberracji chromatycznych, które mogą wystąpić w TEM. Długość kamery można regulować tak, aby detektor BF wykrywał głównie nierozproszone elektrony. Używanie detektora DF do badania grubych próbek nie jest zalecane ze względu na wielokrotne rozpraszanie, które daje niedokładne obrazy. Zamiast tego można użyć detektora BF11. Chociaż STEM może generować obrazy o wysokim SNR, ma stosunkowo niską głębię ostrości ze względu na stosunkowo wysoką zbieżność wiązki w porównaniu z TEM, co zmniejsza ilość szczegółowych informacji, które można uzyskać z grubych próbek. W przypadku mikroskopów STEM z korekcją aberracji, w których kąt zbieżności może wynosić nawet 30 mrad, głębia ostrości może być na tyle niska, że informacje o ostrości pochodzą z płaszczyzny ogniskowej wynoszącej zaledwie kilka nanometrów. Ustawienie wiązki elektronów w trybie równoległym zwiększa głębię ostrości wiązki elektronów ze szkodą dla resolution12. Jednak taka konfiguracja nie zawsze jest możliwa.

Kiedykolwiek konieczne jest użycie zbieżnej wiązki elektronów, należy użyć technik, które zwiększają głębię ostrości wiązki elektronów podczas badania grubych próbek. Ostatnie badania wykazały pozyskiwanie wielu obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowych w całej próbce w celu odzyskania maksymalnej ilości informacji o ostrości13,14. Oba badania opisują różne sposoby radzenia sobie z informacjami z różnych płaszczyzn ogniskowych. Hovden i in. połączyli w przestrzeni Fouriera obrazy, które zostały zebrane w różnych płaszczyznach ogniskowych, a ostateczną rekonstrukcję uzyskano bezpośrednio z 3D odwrotnej transformaty Fouriera13. W przeciwieństwie do tego, Dahmen i in. opracowali silnik rekonstrukcji wiązki konwergentnej, aby zrekonstruować w przestrzeni rzeczywistej objętość 3D z różnych płaszczyzn ogniskowych14. Nasze laboratorium opracowało również metodę obrazowania grubych próbek biologicznych. Nasza strategia różniła się od dwóch metod opisanych powyżej tym, że połączyliśmy informacje, które są ostre w różnych płaszczyznach ogniskowych i zrekonstruowaliśmy ostateczną objętość 3D w przestrzeni rzeczywistej za pomocą projektora o równoległej wiązce15. Naszym celem było opracowanie metody, którą z łatwością można wykonać w każdym laboratorium mikroskopii elektronowej. W tym celu staraliśmy się zebrać obrazy ogniskowe w ograniczonym czasie, porównywalnym z ramami czasowymi konwencjonalnych eksperymentów tomograficznych. Ponadto proponowana przez nas metoda może zostać dostosowana do użytku z różnymi typami oprogramowania do osiowania i rekonstrukcji.

W kontekście naszej publikacji z 2015 roku15, chcieliśmy zwizualizować i scharakteryzować odzyskiwanie głębi ostrości, więc użyliśmy dużego półkąta zbieżności wynoszącego 25 mrad. Poniżej przedstawiamy krok po kroku protokół wykonywania obrazowania przezogniskowego w STEM według metody opracowanej w naszym laboratorium w 2015 roku15, a także prezentujemy, w jaki sposób przetworzono dane z 2015 roku. Metoda ta pozwala na odzyskanie ostrych informacji z kilku płaszczyzn ogniskowych w grubej próbce biologicznej (750 nm) i umożliwia wysokiej jakości rekonstrukcje 3D. W stosownych przypadkach przedstawiono również różnice w tej metodologii w porównaniu z metodami stosowanymi przez inne grupy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Zapoznaj się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) różnych odczynników przed ich użyciem. Niektóre substancje chemiczne używane podczas przygotowywania próbki są toksyczne, rakotwórcze, mutagenne i/lub działające szkodliwie na rozrodczość. Stosować środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i buty z zakrytymi palcami) i pracować pod wyciągiem podczas pracy z próbką. Cięcie próbki za pomocą ultramikrotomu wymaga użycia ostrych narzędzi, a ostrożne korzystanie z tych narzędzi jest obowiązkowe. W krokach opisanych poniżej autorzy zakładają, że próbka jest próbką kultury komórkowej. Protokół może wymagać modyfikacji w zależności od rodzaju próbki, zwłaszcza etapów wirowania.

1. Przygotowanie i mieszanin

  1. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,76 mM KH2PO4).
  2. Przygotować roztwory zawierające 30%, 50% i 70% etanolu w PBS do odwodnienia próbki. Przeprowadzić dehydratację próbki poprzez stopniową inkubację próbki w rosnących stężeniach etanolu.
  3. Przygotować żywicę epoksydową, mieszając bisfenol-A-(epichlorohydrynę) (20 ml), bezwodnik bursztynowy dodecenylu (9 ml), metylo-5-norbornen-2,3-dikarboksylowy (11 ml) i 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol (0,7 ml); można zastosować inne proporcje mieszania w zależności od pożądanej twardości żywicy.
  4. Przygotować roztwory zawierające 30%, 50% i 70% żywicy epoksydowej w etanolu do zatopienia próbki. Zatapianie żywicy należy przeprowadzić poprzez stopniową inkubację próbki o rosnącym stężeniu żywicy.
    UWAGA: Objętości przygotowanych roztworów zależą od rodzaju badanej próbki. W przypadku tkanek potrzeba więcej roztworów niż w przypadku kultur komórkowych.

2. Utrwalenie i zabarwienie próbki

  1. Odwirować kulturę komórkową przez 5 minut przy 5 000 x g. Wykonać wszystkie poniższe wirowania w tych samych warunkach.
  2. Wyrzucić supernatant i utrwalić osad komórkowy poprzez ponowne zawieszenie go w PBS (1 ml) z 4% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut (rysunek 1A). Alternatywnie, utrwalić komórki w temperaturze 4 °C przez noc lub w weekend.
  3. Po odwirowaniu usunąć sklarat nad osadem i przemyć osad 3 razy PBS (1 ml) w celu całkowitego usunięcia środków utrwalających.
  4. Po utrwaleniu próbki 1% OsO4 w PBS (1 ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Po odwirowaniu usunąć supernatant i przemyć osad 3 razy PBS (1 ml), aby całkowicie usunąć OsO4. Dezaktywuj OsO4 w oleju i wyrzuć.
  6. Dodać 2% octan uranylu do PBS (1 ml) jako środek kontrastowy i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej (ryc. 1B).
  7. Po odwirowaniu usunąć supernatant i przemyć osad 3 razy PBS (1 ml) w celu usunięcia niezwiązanego octanu uranylu; octan uranylu zawiera pierwiastki radioaktywne i powinien zostać wyrzucony do pojemnika przeznaczonego na odpady radioaktywne.
    UWAGA: Czasy inkubacji mogą być modyfikowane w zależności od wielkości próbki. Na przykład utrwalanie i barwienie grubszych próbek, takich jak próbki tkanek, wymaga dłuższego czasu inkubacji. Dłuższy czas inkubacji może być również lepszy dla etapów odwadniania i osadzania. Octan uranylu można zastąpić roztworem "bez uranu", który zawiera sole gadolinu.

3. Odwodnienie próbki

  1. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C w PBS (1 ml) z 30% etanolem (rysunek 1C).
  2. Powtórz krok 3.1, używając roztworów o stopniowo rosnącym stężeniu etanolu (50%, 70% i do 100%). Podczas tych etapów dehydratacji należy utrzymywać próbkę w temperaturze 4 °C w celu konserwacji próbki.
  3. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w czystym etanolu (1 ml); inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

4. Osadzanie żywicy

  1. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w etanolu z 30% żywicą epoksydową (1 ml) na 30 minut w temperaturze pokojowej (rysunek 1D).
  2. Powtórz krok 4.1, używając roztworów o stopniowo rosnącym stężeniu żywicy epoksydowej (50%, 70% i do 100%).
  3. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i zawiesić osad w czystej żywicy epoksydowej (1 ml); inkubować przez noc w temperaturze pokojowej Obecność utwardzającego DMP-30 może wywołać polimeryzację żywicy; jeśli tak się stanie, przygotuj dwie partie żywicy epoksydowej, jedną z DMP-30 i jedną bez.
  4. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 200 μl czystej żywicy epoksydowej (zawierającej utwardzacz) w plastikowej kapsułce; próbka powinna znajdować się na dnie plastikowej kapsułki.

5. Polimeryzacja żywicy

  1. Inkubować plastikową kapsułkę zawierającą próbkę w inkubatorze nastawionym na 60 °C przez 48 godzin; inne rodzaje żywic mogą polimeryzować w różnych ustawieniach.
  2. Wyjąć kapsułkę z inkubatora i sprawdzić, czy żywica uległa polimeryzacji; żywica powinna być twarda po przyciśnięciu do twardej powierzchni.
  3. Dodaj czystą żywicę epoksydową (zawierającą utwardzacz) na wierzch spolimeryzowanej żywicy zawierającej próbkę; ta dodatkowa warstwa żywicy ułatwi cięcie próbki. Inkubować kapsułkę w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.

6. Podział próbki na sekcje

  1. Zamontuj próbkę do góry nogami w uchwycie na próbkę tak, aby próbka była skierowana do góry i zamocuj ją na bloku przycinania ultramikrotomu. Mocno zablokuj dźwignię, aby przymocować blok przycinania do ultramikrotomu.
  2. Za pomocą żyletki lub podobnego ostrego narzędzia do cięcia wytnij plastikową kapsułkę, aby oddzielić ją od spolimeryzowanej żywicy. Przeciąć żywicę tak, aby próbka była zawarta w żywicy w kształcie mniej więcej piramidy. Nie ma potrzeby wyjmowania całej plastikowej kapsułki; Usuń tylko część zakrywającą spolimeryzowaną próbkę.
  3. Zdejmij kapsułkę i uchwyt próbki z bloku przycinania i zainstaluj je na ruchomym ramieniu ultramikrotomu.
  4. Zamontuj nóż do przycinania na bloku noża i dokładnie przytnij ściany piramidy. Zaleca się użycie lornetki, aby nadać piramidzie idealny kształt; Im lepsza piramida, tym lepsze będą jej przekroje.
  5. Zdejmij nóż do przycinania i zastąp go nożem histologicznym, którego można używać do cięcia odcinków grubszych niż 0,5 μm.
  6. Po napełnieniu kuwety noża histologicznego odpowiednią ilością wody, przyłóż krawędź tnącą noża do powierzchni próbki i za pomocą lornetki wyreguluj kąt nachylenia kapsułki tak, aby nóż przeciął się prostopadle do piramidy.
  7. Dostosuj prędkość cięcia do żądanej grubości sekcji, aby uzyskać jednorodne sekcje.
  8. Pozwól sekcji unosić się nad wodą i obławiaj ją za pomocą pętli.
  9. Przesuń pętlę w kierunku miedzianej siatki do mikroskopii elektronowej, która została umieszczona na bibule filtracyjnej.
    UWAGA: Siatka powinna być wcześniej poddana obróbce, aby zwiększyć jej hydrofilowość. Można to zrobić za pomocą pisaka do powlekania siatką.
  10. Ze względu na absorpcję wody przez bibułę filtracyjną, pozwól, aby sekcja przykleiła się do siatki. Pozostaw do wyschnięcia na kilka minut przed włożeniem go do mikroskopu elektronowego.

7. Konstrukcja serii Through-focal Tilt

  1. Zbieraj obrazy przezogniskowe w stałych odstępach czasu.
    UWAGA: Seria nachylenia przez ogniskową składa się z zestawu obrazów przechodzących przez ogniskową, które są zbierane pod każdym kątem nachylenia serii pochylenia. Cała amplituda ogniska powinna być wystarczająca do pokrycia całej grubości próbki.
  2. Określ wartość interwału ostrości. Jeżeli odstęp jest równy głębi ostrości, należy pobrać całą próbkę w pozycji zogniskowanej; To ustawienie reprezentuje najwyższą możliwą próbkowanie. Jeśli interwał jest większy niż głębia ostrości, niektóre części próbki nie zostaną uzyskane w ostrości, co oznacza, że niektóre części próbki nie zostaną zebrane w ostrości.
  3. Oblicz głębię ostrości wiązki elektronów na podstawie długości fali elektronu i półkąta zbieżności wiązki elektronów. Podczas gdy długość fali elektronów jest bezpośrednio związana z napięciem przyspieszenia, użyj półkąta zbieżności dostarczonego przez producenta mikroskopu elektronowego lub określ go doświadczalnie na podstawie wzoru dyfrakcyjnego znanego próbnika16. Ponieważ elektrony przyspieszające przy długości fali λ uderzają w próbkę z półkątem zbieżności α w mikroskopie elektronowym, użyj następującego równania, aby określić głębię ostrości (DOF):

    figure-protocol-1
  4. Zaprojektuj serię ogniskowych tak, aby cała amplituda ogniska obejmowała próbkę przy jej maksymalnej grubości pozornej (tj. przy jej najwyższym nachyleniu).
    UWAGA: Próbka o grubości 0,75 μm będzie miała pozorną grubość 2,19 μm przy nachyleniu 70°, więc amplituda ostrości powinna być większa niż 2,19 μm. W przypadku tej próbki, jeśli określony powyżej interwał ostrości jest równy 50 nm, będzie to wymagało 44 obrazów (2,19 μm/50 nm), aby pokryć próbkę przy jej maksymalnej pozornej grubości. Cała amplituda ostrości jest równa wartości interwału ostrości pomnożonej przez liczbę kroków ogniskowej. Przy najwyższym nachyleniu (θ) pozorna grubość próbki jest zdefiniowana w następujący sposób:

    figure-protocol-2

8. Obrazowanie próbki

UWAGA: Opisanie jak skonfigurować mikroskop elektronowy w trybie STEM wykracza poza zakres tego protokołu; większość tych informacji można znaleźć w podręczniku dostarczonym przez producenta mikroskopu elektronowego. Należy jednak pamiętać o następujących kwestiach: i) rozmiar plamki należy dobrać zgodnie z pożądanym powiększeniem; ii) Ronchigram musi być dobrze wyrównany; oraz iii) w trybie BF długość kamery musi być dostosowana do wyboru nierozproszonych elektronów przy jednoczesnym utrzymaniu dobrego oświetlenia detektora. Skrawki żywicy osadzone na miedzianych siatkach mikroskopii elektronowej powinny być oświetlone przed akwizycją obrazu, aby zapobiec kurczeniu się. Efekty kurczenia się żywicy i ładowania mogą być mylone podczas akwizycji obrazu. Zastosowanie przysłony obiektywu może poprawić stabilność próbki w przypadku wystąpienia efektów ładowania. Jednak w szczególnym przypadku konfiguracji STEM apertura obiektywu nie jest kompatybilna z trybem obrazowania HAADF, a bardzo małe apertury obiektywu nie są kompatybilne z trybem obrazowania BF.

  1. Korzystając z małego powiększenia (około 20 000X w STEM), przejrzyj próbkę i zlokalizuj obszar zainteresowania.
  2. Wyreguluj wysokość emucentryczną (oś Z) tak, aby obszar zainteresowania nie oddalał się podczas obracania próbki.
  3. Sprawdź, czy interesujący Cię obiekt pozostanie widoczny w całym zakresie nachylenia.
  4. Ze względu na znaczną liczbę obrazów zarejestrowanych w serii z przezogniskową w pochyleniu, należy użyć oprogramowania do automatycznego zbierania. W razie potrzeby skorzystaj z rozwiązania komercyjnego lub zaprojektuj niestandardowe oprogramowanie do gromadzenia danych. Upewnij się, że program jest w stanie wykonać trzy następujące kroki:
    1. Śledzenie i ustawianie ostrości jak w standardowym schemacie zbierania z serii pochylenia.
    2. Upewnij się, że obrazy przelotowe nakładają się na pozycję Z próbki.
    3. Automatycznie rejestruj serię obrazów przez ogniskową pod każdym kątem nachylenia.
  5. Podaj programowi główne parametry serii pochylenia przez ogniskową (tj. interwały ogniskowych, krok ogniskowej, minimalny kąt nachylenia, maksymalny kąt pochylenia, krok pochylenia i prędkość skanowania).
  6. Rozpocznij proces zbierania obrazu i poczekaj na zakończenie działania oprogramowania.

9. Przetwarzanie obrazu

UWAGA: W tym protokole przetwarzanie serii przekątnej przez ogniskową odbywa się za pomocą pluginów ImageJ17. Dane uzupełniające 1 pokazują makro ImageJ dla kroku wyrównania (Turboreg) i do łączenia informacji o ostrości (rozszerzona głębia ostrości) dla serii nachylenia przez ogniskową zaprojektowanej z trzema wartościami ostrości.

  1. Wyrównaj zebrane obrazy pod tym samym kątem nachylenia (tj. obrazy przechodzące przez ogniskową). Ponieważ obrazy nie mają tych samych informacji o ostrości, nie mają tych samych cech wyrównania; wykonaj wyrównanie, wyrównując sąsiednie obrazy dwa po dwóch (tj. zgodnie z hierarchią piramidalną, z najbliższymi wartościami ostrości na początku) za pomocą wtyczki Turboreg18, ImageJ.
  2. Konsekwentnie sprawdzaj wyrównanie obrazów przezogniskowych pod każdym kątem nachylenia. Ułóż wyrównane obrazy przelotowe, aby poprawić kontrolę wzrokową.
    UWAGA: Tylko strefa, która jest aktywna, powinna poruszać się podczas przeglądania stosu. Dokładne wyrównanie jest najważniejsze, ponieważ następny krok polega na odzyskaniu informacji, które są ostre z różnych obrazów.
  3. Scal informacje, które są ostre, za pomocą wtyczki Extended Depth of Field19, ImageJ; to ostatecznie wygeneruje pojedynczy obraz ze stosu obrazów. Podczas odzyskiwania głębi ostrości można użyć kilku ustawień, ale do zachowania informacji o obrazie należy użyć najwyższych ustawień.
    UWAGA: Seria pochylenia składa się teraz z jednego obrazu pod każdym kątem nachylenia, przy czym każdy obraz zawiera informacje o ostrości odzyskane z obrazów przezogniskowych.
  4. Przetwarzanie danych.
    UWAGA: Można używać standardowych narzędzi do wyrównywania i rekonstrukcji, ponieważ dane zostały teraz zredukowane do standardowej serii pochylenia. W tym protokole TomoJ jest używany do wyrównywania i rekonstrukcji danych20,21. Więcej szczegółów na temat korzystania z TomoJ można znaleźć w oryginalnej publikacji22.
  5. Wykonaj dokładne wyrównanie serii uchylnej.
    UWAGA: Dobrą strategią jest użycie złotych koralików jako znaczników odniesienia, aby dokładnie śledzić zmiany między obrazami. Lokalne minima mogą być również stosowane, jeśli nie można dodać złotych koralików do próbki.
  6. Wykonaj rekonstrukcję 3D wyrównanych danych; dostępnych jest kilka algorytmów do wykonywania rekonstrukcji w przestrzeni rzeczywistej lub przestrzeni Fouriera, z których każdy ma zalety i ograniczenia.
  7. Jeśli końcowe wyrównanie serii pochylenia jest słabe, wprowadź pewne ulepszenia, optymalizując początkowe kroki. Powtórz kroki wyrównywania, jeśli ostateczna rekonstrukcja 3D wydaje się rozmyta lub zdeformowana; w praktyce im większa liczba zebranych płaszczyzn ogniskowych, tym lepszy kontrast i szczegółowość rekonstrukcji 3D.
    UWAGA: Do przetwarzania serii pochylenia przez ogniskową można użyć kilku programów. Jednak narzędzia użyte w tym protokole zostały wybrane, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że działały najlepiej. Turboreg18 działał lepiej pod względem wyrównywania obrazów, gdy występował gradient ostrości. Więcej informacji można znaleźć na dedykowanej stronie internetowej23. Wtyczka Extended Depth of Field19 działała bardzo dobrze pod względem odzyskiwania informacji o ostrości z różnych obrazów, podczas gdy inne narzędzia skutkowały modyfikacjami widocznych pikseli. Więcej informacji, zwłaszcza na temat pisania skryptów, można znaleźć na dedykowanej stronie internetowej24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym badaniu, elektrony zostały przyspieszone do 200 kV w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Obrazy zostały zebrane w trybie STEM BF przy użyciu czasu przebywania 20 μs. Jeśli chodzi o konstrukcję serii nachylenia przez ogniskową, stwierdziliśmy, że interwały ostrości wynoszące 150 nm dały zadowalające wyniki w badaniu ultrastrukturalnym próbki biologicznej o grubości 750 nm - mimo że głębia ostrości wiązki elektronów wynosiła tylko 3 nm - ponieważ użyliśmy bardzo dużego półkąta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy konwencjonalny protokół przygotowania próbki wraz z przewodnikiem krok po kroku dotyczącym wykonywania analizy 3D na grubych próbkach biologicznych za pomocą tomografii przezogniskowej STEM. Osadzanie próbek biologicznych w żywicy jest stosowane od dziesięcioleci26 , a alternatywne protokoły, które są dostosowane do różnych rodzajów próbek, można znaleźć w literaturze27. Natomiast obrazowanie grubych próbek w STEM przy użyciu metod przezskórnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z dwóch grantów ANR (ANR-11-BSV8-016 i ANR-10-IDEX-0001-02). Dziękujemy również PICT-IBiSA za zapewnienie dostępu do sprzętu do obrazowania chemicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP4417
EtanolSigma-Aldrich2860
Żywica epoksydowaEMS14120
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Dodaj proszek paraformaldehydu do PBS podgrzanego w temperaturze około 60 °C.
Zwiększ pH, dodając 1 N NaOH, aż nie będzie widoczny proszek PFA.
Aldehyd glutarowySigma-AldrichG5882 
Tetroksyd osmuEMS19150
Octan uranyluSigma-Aldrich73943
Kapsułka żelatynowaEMS70110
Noże do przycinania i histoDystrybucja LFGdiamentowe Diatome
Mikroskopia elektronowa siatka miedzianaDystrybucja LFG PióroG200-Cu
LFG Distribution70624
Uchwyt na próbkiJEOLEM-21311 Mikroskop elektronowy HTR
JEOLJEM-2200FS
Noże do powlekania siatki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124(2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia elektronowaprzygotowanie pr bekobrazowanie przez ogniskodopasowanie serii pochylerekonstrukcja 3Dzatapianie w ywicyultramikrotomiatryb wi zki zbie nej

Powiązane artykuły