$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Budowa urządzeń magnetycznych
UWAGA: Urządzenia używane do zasiewania komórek różnią się w zależności od zastosowania (Rysunek 1). Aby utworzyć agregaty, liczba komórek jest ograniczona do 2,5×105/agregat, dlatego końcówki magnetyczne muszą być bardzo cienkie (średnica 750 μm). Aby wysadzić rusztowania o grubości 1,8 cm igrubości 2/7 mm, magnesy muszą być większe (3 mm średnicy) i zapewnią migrację komórek przez pory rusztowania.
- Budowa urządzenia z mikromagnesami do formowania agregatów (rys. 1A)
- Wykonaj mikrootwory wiertłem 0,8 mm przez aluminiowe płytki (o średnicy 3 cm i grubości 6 mm).
- Włóż końcówkę magnetyczną (o średnicy 750 μm) do każdego otworu płytki.
- Umieść ten dysk na trwałym magnesie neodymowym, który zapewnia namagnesowanie do nasycenia.
- Budowa urządzenia do wysiewu rusztowań (rys. 1B)
- Pokrój twardy polistyren na 2,4 cm2 kwadraty.
- Włóż 9 małych magnesów (o średnicy 3 mm i długości 6 mm) w równej odległości na powierzchni 1,6 cm2.
- Umieść to urządzenie na trwałym magnesie neodymowym.
2. Etykietowanie komórek macierzystych
UWAGA: Komórki macierzyste były znakowane nanocząstkami magnetycznymi o wielkości 0,1 mM przez 30 minut (2,6 ± 0,2 pg żelaza/komórkę), tworząc agregaty, podczas gdy były one znakowane nanocząstkami magnetycznymi 0,2 mM przez 30 minut (5 ± 0,4 pg żelaza/komórkę) w celu zasiewu rusztowań. Te stężenia nanocząstek i czasy inkubacji były wcześniej używane i publikowane dla MSC i innych komórek18,19, i ustalono, że nanocząstki nie wpływają ani na żywotność komórek, ani na zdolność różnicowania MSC. Masę żelaza wbudowaną w komórki macierzyste zmierzono za pomocą magnetoforezy pojedynczej komórki19,20.
- Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kompletnym pożywce do wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCGM) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do zbliżenia do konfluencji (~90%).
- Przygotuj roztwór do etykietowania magnetycznego, mieszając 0,1 lub 0,2 mM tlenku żelaza pokrytego cytrynianem maghemitu (γFe2O3; rdzeń: średnica 8 nm) w bezsurowicyzowym podłożu McCoy's 5A zmodyfikowanym w Roswell Park Memorial Institute (RMPI) bez glutaminy i zawierającym 5 mM cytrynianu sodu.
- Odrzucić pożywkę, przepłukać komórki pożywką RPMI bez surowicy bez glutaminy i dodać 10 ml roztworu nanocząstek tlenku żelaza na 150-centymetrową 2 kolbę hodowlaną, minimalną objętość wymaganą do pokrycia wszystkich komórek.
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , a następnie wyrzucić roztwór nanocząstek. Płukać przez 5 minut pożywką RPMI bez surowicy bez glutaminy, aby zinternalizować nanocząsteczki nadal przyczepione do błony plazmatycznej.
- Odrzucić pożywkę RPMI i dodać 25 ml pełnej pożywki MSCGM na kolbę. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
3. Magnetyczne zasiewanie komórek
- Świeżo przygotuj pożywkę chondrogenną, używając Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą, dodając 50 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 0,1 μM deksametazonu, 1 mM pirogronianu sodu, 0,35 mM L-proliny, 1% uniwersalnego suplementu hodowlanego zawierającego insulinę, ludzką transferynę i kwas selenowy (ITS-Premix) oraz 10 ng/ml transformującego czynnika wzrostu-beta 3 (TGF-β3).
- Odłączyć komórki magnetyczne za pomocą 8 ml 0,05% trypsyny-EDTA na 150cm2 kolby hodowlanej i odwirować zdysocjowane komórki przy 260 × g przez 5 minut. Odessać pożywkę i policzyć ponownie zawieszone komórki.
- Umieść szalkę Petriego z kulturą komórkową ze szklanym dnem (35 mm) na obu urządzeniach magnetycznych.
- Aby magnetycznie uformować agregaty, dodaj 3 ml pożywki chondrogenicznej do szalki Petriego i delikatnie umieść najmniejszą możliwą objętość (nie więcej niż 8 μl) zawierającą 2,5×105 znakowanych komórek na agregat (można zdeponować do 16 agregatów). Pozostawić szalkę Petriego na 20-30 minut bez jej przesuwania, pozwalając jej uformować sferoidy, a następnie umieścić całe urządzenie, łącznie z szalką Petriego zawierającą 16 agregatów, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Uformuj agregacje kontrolne zgodnie z tym samym protokołem i zastąp całe podłoże pożywką chondrogenną bez TGF-β3.
- Aby wygenerować konstrukcję agregatu 3D, umieść 2 agregaty w kontakcie w dniu 8, aby utworzyć 8 dubletów i zainicjuj fuzję. W dniu 11 połącz 2 dublety, aby utworzyć 4 czworaki. Na koniec połącz 4 czworaczki w dniu 15, aby uzyskać ostateczną strukturę.
- W tym samym czasie tworzą agregaty przez odwirowanie 2,5×105 znakowanych komórek macierzystych w ilości 260 × g przez 5 minut w 15-mililitrowych probówkach z 1,5 ml pożywki chondrogenicznej z lub bez TGF-β3 (odpowiednio dla próbki i kontroli).
- Aby magnetycznie wysiewać rusztowania, umieść każde wysuszone rusztowanie na szalce Petriego. Używaj polisacharydowych porowatych rusztowań wykonanych z pullulan/dextran21. Dla każdego rusztowania rozcieńczyć 2×106 znakowanych komórek macierzystych w 350 μl pożywki chondrogennej bez TGF-β3 i ostrożnie pipetować komórki na rusztowanie.
- Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić pełną penetrację komórek w rusztowaniu, a następnie delikatnie dodać 3 ml pożywki chondrogennej z TGF-β3 lub bez niej (odpowiednio do próbki lub kontroli) do szalki Petriego.
- Inkubować rusztowanie komórkowe na urządzeniu magnetycznym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 dni, aby umożliwić migrację komórek przez pory rusztowania i uwięzienie.
- W tym samym czasie, rusztowania nasienne z 2×106 znakowanymi komórkami macierzystymi postępują zgodnie z tą samą metodą i inkubują bez magnesu, aby uzyskać rusztowania o równomiernym wysiewie jako kontrole pozytywne.
4. Różnicowanie na chondrocyty
UWAGA: Po 4 dniach inkubacji, usuń magnesy i kontynuuj dojrzewanie chondrogenne na szalce Petriego (warunki statyczne) lub w bioreaktorze (warunki dynamiczne). Próbki kontroli ujemnej dojrzewają w warunkach statycznych z pożywką chondrogenną bez TGF-β3.
- W warunkach statycznych należy przechowywać komórkowe rusztowania lub agregaty na tej samej szalce Petriego. Zmieniaj pożywkę chondrogenną dwa razy w tygodniu przez 21 dni.
- W warunkach dynamicznych przygotuj bioreaktor.
- Wytnij silikonową rurkę na odpowiednią długość zgodnie z protokołem producenta.
- Autoklaw wszystkich materiałów: komory hodowlanej o pojemności 500 ml, rurek, rotatorów 2-drogowych i klatek.
- Umieść części bioreaktora w sterylnej stacji bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Podłącz rurkę do rotatorów 2-drogowych i do komory hodowlanej zgodnie z instrukcjami producenta.
- Ostrożnie przenieś rusztowania komórkowe do wysterylizowanych klatek za pomocą sterylnej szpatułki. Umieść 2 rusztowania w klatce. Gdy klatki będą gotowe, włóż je do igieł pokrywy, aby nie przesuwały się podczas dalszego obracania. Napełnij komorę hodowlaną pożywką chondrogenną i zamknij ją pokrywą zawierającą klatki.
- Włącz pompę perystaltyczną, aby napełnić rurkę medium chondrogetycznym i wyeliminować pęcherzyki powietrza.
- Umieść i zabezpiecz napełnioną komorę w silniku bioreaktora i włącz komputer, który steruje obrotami zarówno ramienia, jak i komory.
- Zastosuj prędkość obrotową 5 obrotów na minutę (rpm) zarówno na ramieniu, jak i na komorze. Wyreguluj pompę perystaltyczną na natężenie przepływu 10 obr./min w celu ciągłego zasilania rusztowań komórkowych.
5. Ekstrakcja RNA i analiza ekspresji genów
UWAGA: Przed ekstrakcją RNA, trawić rusztowania roztworem enzymatycznym.
- Przygotować 1 ml roztworu enzymatycznego, dodając 100 μl pullulanazy (40 j./ml) i 50 μl dekstranazy (60 mg/ml) do 850 ml pożywki DMEM bez surowicy.
- Przepłukać rusztowania dwukrotnie pożywką DMEM bez surowicy, wyrzucić pożywkę i dodać 800 μl roztworu enzymatycznego na rusztowanie. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C pod delikatnym mieszaniem.
- Gdy rusztowanie jest całkowicie rozpuszczone, przenieść roztwór zawierający komórki do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 300 × g przez 10 minut, ostrożnie odessać pożywkę, przepłukać dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1× (PBS), odwirować przy 300 × g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w roztworze do izolacji RNA.
- Aby wyekstrahować RNA z agregatów, przed wykonaniem ekstrakcji RNA umieść sferoidy w roztworze izolacyjnym RNA i całkowicie je zmiażdż za pomocą homogenizatora.
- Wyizolować RNA za pomocą zestawu do całkowitej ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zsyntetyzować komplementarne DNA z 400 ng całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy zgodnie z instrukcjami producenta, używając 250-ngowych starterów losowych, 1 μl mieszanki dNTP (po 10 mM) i 40 U/ml inhibitora RNazy; końcowa objętość reakcji wynosi 20 μL. Pod koniec reakcji dodać 80 μl wody destylowanej, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.
- W przypadku ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) należy użyć mieszaniny PCR zawierającej odczynnik fluorescencyjny w celu ilościowego określenia względnej ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania, takich jak agrekan (AGC) i kolagen II (Col II), z 10× rozcieńczonym cDNA. Normalizuj poziomy ekspresji genów za pomocą genu referencyjnego Białko rybosomalne, duże, P0 (RPLP0). Obliczenia należy wykonać ze wzorem 2-ΔΔCT, gdzie ΔΔCT = ΔCT stanu zróżnicowanego - średnia ΔCT stanu kontrolnego, a każdy ΔCT reprezentuje CT genu będącego przedmiotem zainteresowania - CT genu odniesienia (RPLP0).
- Pomiary statystyczne należy określić jako wartości średnie ± błędu standardowego średniej (SEM). Przeprowadź analizę za pomocą n ≥ 2 niezależnych eksperymentów. Użyj testu t Studenta, aby przeanalizować różnice statystyczne między odwirowanymi granulkami a fuzjami magnetycznymi (* p < 0,05). Określ istotność za pomocą testu Kruskala-Wallisa (jednoczynnikowy ANOVA nieparametryczny) do analizy różnic statystycznych między zróżnicowanymi rusztowaniami i rusztowaniem kontrolnym (* p < 0,05).
6. Analiza histologiczna
- Przepłukać komórkowe rusztowania lub agregaty sterylnym 1× PBS, utrwalić je w 10% roztworze formaliny na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i spłukać 1× PBS.
- Usunąć PBS, zanurzyć próbki w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) i zamrozić je w kąpieli izopentanowej zanurzonej w ciekłym azocie. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C. Próbki należy przeciąć kriostatem w celu uzyskania kriosekcji o wielkości 8 μm w przypadku kruszyw lub 12 μm w przypadku rusztowań komórkowych.
- Wybarwić kriosekcje 0,5% roztworem błękitu toluidynowego przez 2 minuty, spłukać w wodzie z kranu, odwodnić 100% etanolem, sklarować za pomocą toluenu i zamontować szkiełka za pomocą podłoża montażowego do mikroskopii świetlnej.