Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

DOI:

10.3791/55224

⸱

3 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka pępowina (UC) i łożysko są nieinwazyjnymi, prymitywnymi i obfitymi źródłami mezenchymalnych komórek zrębu (MSC), które coraz częściej zyskują na znaczeniu, ponieważ nie stanowią żadnego etycznego czy moralnego problemu. Obecne metody izolacji MSC z UC dają niewielką ilość komórek o zmiennym potencjale proliferacji. Ponieważ UC jest anatomicznie złożonym narządem, różnice we właściwościach MSC mogą wynikać z różnic w anatomicznych regionach ich izolacji. W tym badaniu najpierw przeprowadziliśmy sekcję próbek pępowiny/łożyska na trzy odrębne obszary anatomiczne: UC, połączenie pępowiny-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP). Po drugie, oddzielono dwie odrębne strefy, wyściółkę sznura (CL) i galaretkę Whartona (WJ). Następnie zastosowano technikę hodowli eksplantatów w celu wyizolowania komórek z czterech źródeł. Czas potrzebny na pierwotną hodowlę komórek z eksplantatów różnił się w zależności od źródła tkanki. Wzrost komórek nastąpił w ciągu 3 - 4 dni od eksplantatów CPJ, podczas gdy wzrost obserwowano po 7 - 10 dniach i 11 - 14 dniach odpowiednio od eksplantatów CL / WJ i FP. Wyizolowane komórki przylegały do tworzywa sztucznego i wykazywały morfologię fibroblastoidów oraz markery powierzchniowe, takie jak CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105, podobnie jak MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BM). Jednak wydajność tworzenia kolonii komórek była zróżnicowana, przy czym CPJ-MSC i WJ-MSC wykazywały wyższą wydajność niż BM-MSC. MSCs ze wszystkich czterech źródeł różnicowały się w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne, co wskazuje, że były multipotencjalne. CPJ-MSC różniły się bardziej efektywnie w porównaniu z innymi źródłami MSC. Wyniki te sugerują, że CPJ jest najsilniejszym regionem anatomicznym i daje większą liczbę komórek, z większą zdolnością do proliferacji i samoodnawiania się in vitro. Podsumowując, analiza porównawcza MSCs z czterech źródeł wykazała, że CPJ jest bardziej obiecującym źródłem MSCs w terapii komórkowej, medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste są obecne w różnych organach i tkankach ciała. Posiadają potencjał regeneracyjny i odgrywają główną rolę w naprawie uszkodzonych tkanek w organizmie przez cały okres życia człowieka1,2. Wzbudziło to duże zainteresowanie dorosłymi komórkami macierzystymi (ASC), zwłaszcza że w przeciwieństwie do embrionalnych komórek macierzystych (ESC) stosowanie ASC nie stwarza dylematów moralnych i etycznych. W kilku badaniach opisano izolację ASC, takich jak mezenchymalne komórki zrębu (MSC); hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC); oraz różnych przodków, w tym różne źródła dla dorosłych, od szpiku kostnego (BM) po tkankę tłuszczową (AT) i miazgę zębową3,4,5. Jednak liczba ASC obecnych w większości dorosłych nisz jest ograniczona, a ich izolacja na ogół wiąże się z inwazyjną i bolesną procedurą, która może powodować zachorowalność w miejscu dawczym. Ponadto wiek dawcy i stres środowiskowy mogą również odgrywać znaczącą rolę w określaniu jakości i aktywności biologicznej izolowanych komórek6,7,8. ASC wykazują również ograniczony potencjał namnażania i różnicowania podczas hodowli in vitro.

Aby przezwyciężyć te wady obecnych ASC, poszukiwano nowych źródeł do izolowania komórek macierzystych. Wysiłki te doprowadziły do wyizolowania komórek macierzystych ze źródeł okołoporodowych, w tym krwi pępowinowej, tkanki pępowinowej, łożyska i płynu owodniowego9. Źródła te zyskały uwagę ze względu na ich łatwą i obfitą dostępność10,11,12,13. Co więcej, tkanki okołoporodowe można pozyskać nieinwazyjnie, a komórki macierzyste z nich pochodzące są bardziej prymitywne niż ASC wyizolowane z dorosłych źródeł14,15. Są one izolowane z tkanek pobranych po urodzeniu i uważa się, że przeszły minimalne zmiany w genomie z powodu starzenia się i stresów środowiskowych16.

Jednak zgłaszane cechy komórek macierzystych ze źródeł okołoporodowych oraz ich potencjał do samoodnawiania się i różnicowania różnią się znacznie11,17. Może to częściowo wynikać z faktu, że ludzka pępowina (UC) jest złożonym narządem. Stawiamy hipotezę, że dyskretne regiony tkanki okołoporodowej tworzą specyficzne nisze odpowiedzialne za zmienność i bardziej prymitywny charakter tych komórek macierzystych w porównaniu z ASC pochodzącymi ze źródeł nieokołoporodowych. W tym badaniu opisano sekcję próbek pępowiny/łożyska na trzy odrębne obszary anatomiczne: UC, połączenie pępowiny-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP). UC zostało następnie podzielone na dwie strefy: wyściółkę sznurową (CL) i galaretkę Whartona (WJ). Analiza wyizolowanych komórek z CL, WJ, CPJ i FP wykazała, że wszystkie wykazywały morfologię fibroblastoidów i ekspresję markerów MSC, ale różniły się potencjałem samoodnawiania i różnicowania. Komórki pochodzące z CPJ wykazywały wyższy wskaźnik proliferacji i potencjału samoodnawiania w porównaniu z komórkami pochodzącymi z UC i FP, co czyni je bardziej obiecującym źródłem terapii komórkowej, medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki (n = 3) uzyskano od zdrowych, wyrażających zgodę dawców za pośrednictwem Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI i Providence Hospital, Southfield, MI zgodnie odpowiednio z HIC- (HIC #2012-101) i IRB- (IRB# 820662-3), zatwierdzonymi protokołami i przetworzonymi zgodnie z zatwierdzonymi przez IBC (#2858) Uniwersytetu Oakland, Rochester, MI.

1. Przetwarzanie ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina z łożyskiem oraz łożyska płodu i komórek izolujących

  1. Pobrać w asepcie próbki UC o długości około 10 cm, w tym 5-6 cm podłączone do CPJ i 3-4 cm FP. Natychmiast umieścić każdą próbkę w pojemniku zbiorczym zawierającym pożywkę (DMEM z 4,500 mg/ml glukozy i roztworem antybiotyku (0,1% gentamycyny, 0,2% streptomycyny i 0,12% penicyliny)) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu transportu do laboratorium, umieszczając ją na lodzie w styropianowym pudełku. Próbkę należy przetworzyć w temperaturze 4 °C w ciągu 2-4 godzin od pobrania.
  2. Umieścić próbkę na 150-milimetrowej szalce Petriego trzymanej na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą igły i strzykawki przepłucz go kilkakrotnie lodowatym PBS, aby usunąć skrzepy krwi. Upewnij się, że próbka jest mokra z PBS podczas przetwarzania i nie pozwól jej wyschnąć. Aby zachować sterylność, z próbką należy obchodzić się w sposób aseptyczny przy użyciu autoklawowanego PBS i narzędzi chirurgicznych podczas przetwarzania próbki.
  3. Dokładnie zbadaj próbkę, aby zidentyfikować różne obszary anatomiczne: UC, CPJ i FP. Najpierw przeanalizuj UC. Przytrzymaj płodowy koniec UC kleszczami i ostrożnie wykonaj pierwsze cięcie tuż na górze CPJ za pomocą nożyczek. Wykonaj drugie cięcie poniżej CPJ, aby oddzielić CPJ (1,5 - 2,0 cm) od FP. Umieść oddzielone UC, CPJ i FP na oddzielnych szalkach Petriego do dalszej obróbki.
  4. Przetnij UC wzdłużnie za pomocą nożyczek i kleszczy, całkowicie odsłaniając naczynia krwionośne i otaczające WJ bez naruszania nabłonka.
  5. Zeskrob WJ z naczyń krwionośnych i wewnętrznego nabłonka podbłonka za pomocą skalpela, a następnie usuń naczynia krwionośne. Pamiętaj, aby zebrać pozostały okołonaczyniowy WJ pod naczyniami krwionośnymi i wokół nich, a następnie umieścić zebrany WJ na osobnej szalce Petriego.
  6. Zebrać pozostałą tkankę, wyściółkę pępowiny (CL), na oddzielnej szalce Petriego.
  7. Po oddzieleniu tkanek reprezentujących CL, WJ, CPJ i FP, zastąp PBS 3 - 5 ml komercyjnego roztworu trypsyny i oddzielnie pokrój każdą z tkanek na kawałki o średnicy od 1 do 2 mm za pomocą nożyczek.
  8. Inkubować fragmenty tkanek w dostępnym w handlu roztworze trypsyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut w inkubatorze z 5% CO2 w celu częściowego roztrawienia próbek. Obserwuj częściowe trawienie, wizualizując uwalnianie komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
  9. Do częściowo strawionych próbek dodać równą objętość pożywki hodowlanej (CM; DMEM z 4,500 mg / ml glukozy i 2 mM L-glutaminy, uzupełniony 10% ludzką surowicą / FBS i roztworem antybiotyku (0,1% gentamycyny, 0,2% streptomycyny i 0,12% penicyliny)) w celu zneutralizowania komercyjnego roztworu trypsyny. Przenieś zawartość do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i pozwól, aby częściowo strawione kawałki tkanki osiadły przez 3 minuty.
  10. Ostrożnie zassać supernatant, w tym pojedyncze komórki (nie rozszerzają się one wydajnie) i umieścić na płytce 15-20 częściowo strawionych fragmentów tkanek w kolbie do hodowli tkankowych o długości 75cm2 i dodać 9 ml CM. Inkubować w temperaturze 37 °C i nie naruszać kolb hodowlanych przez 2-3 dni, aby umożliwić przyleganie kawałków tkanki.
    UWAGA: Pozostała część częściowo strawionych próbek tkanek może zostać poddana kriokonserwacji w celu przyszłej izolacji komórek.
  11. Po 3 dniach inkubacji zmień CM i codziennie szukaj pojawienia się wyrostów komórek z eksplantatu; wzrost komórek powinien być widoczny z przylegających eksplantatów po 3-4 dniach, 7-10 dniach i 11-14 dniach inkubacji odpowiednio dla CPJ, CL/WJ i FP. Od tego momentu zmieniaj CM co 3 dni lub w razie potrzeby.
    UWAGA: Wzrost komórek osiąga 70% konfluencji 7 - 10 dni po początkowym wyrosciu komórki z eksplantatu. Należy pamiętać, że nieprzylegające kawałki tkanek nie spowodują wzrostu komórek, dopóki nie przylgną do plastiku. Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć kolby w celu uniknięcia oderwania się przylegających kawałków tkanki. Jeśli po pierwszych 3 dniach hodowli pozostaną jakieś pływające kawałki, można je uratować, przenosząc je do nowej kolby w celu zamocowania.
    UWAGA: Gdy wzrost komórek z eksplantatów tkanek osiągnie 70% konfluencji, należy je hodować. Jak wspomniano powyżej, MSC z CL/WJ, FP, CPJ i osiągną zbieg odpowiednio w ciągu 10 - 14 dni, 14 - 20 dni i 17 - 24 dni.
  12. Aby wyhodować wyrosłe komórki z eksplantatów, należy rozdzielić komórki za pomocą 1-2 ml komercyjnego roztworu trypsyny/75-cm2 kolby hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zneutralizować za pomocą 1-2 ml CM i odwirować 1,500 x g przez 3 minuty. Upewnij się, że obracasz kolbę, dodając trypsynę, aby równomiernie rozprowadzić się w całym ciele.
  13. UWAGA: Granulowane komórki są uważane za pasaż 0 (P0) i zostaną zawieszone w CM, policzone i subhodowane przy gęstości wysiewu 1 x 104 / cm2 w celu amplifikacji, charakterystyki i kriokonserwacji. Nadmiar komórek można poddać krioprezerwacji w temperaturze P0.

2. Charakterystyka izolowanych komórek

  1. Test skuteczności tworzenia kolonii (CFE)
    1. Pokryć 100-milimetrowe szalki Petriego (powierzchnia 60cm2) 0,1% żelatyny przez 30 minut i umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne, powłoka żelatynowa poprawia przyleganie komórek.
    2. Usunąć nadmiar żelatyny i wysiać na pokrytą płytkę komórkami P0 w stężeniu 1,63 komórek/cm2. Dodać 3 ml CM i inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    3. Monitoruj płytki z nasionami pod kątem wzrostu klonów za pomocą mikroskopii świetlnej (LM) i zmieniaj pożywkę co 3 dni.
    4. Po 10 - 14 dniach wzrostu komórek umyj szalki Petriego dwukrotnie PBS i utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.
    5. Zabarwić utrwalone komórki 0,1% fioletem krystalicznym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i spłukać płytkę wodą z kranu, aż niezwiązana niebieska plama zniknie.
    6. Policz liczbę kolonii składających się z co najmniej 50 komórek za pomocą LM.
  2. Ekspresja markerów powierzchni komórki
    1. Hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z dostępnym w handlu roztworem trypsyny, a następnie przemyj i osadzaj przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty. Zawieś komórki w buforze FACS (1x PBS z 2% FBS i 0,1% azydkiem sodu).
      UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.
    2. Wybarwić komórki (~ 106) przeciwciałami specyficznymi dla MSC znakowanymi FITC lub APC (przeciwciała sprzężone z FITC przeciwko: CD44 i CD90 lub przeciwciała sprzężone APC przeciwko: CD29, CD73 i CD105) w buforze FACS przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    3. Odwirować wybarwione komórki przy 670 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS.
    4. Analizuj komórki barwione przeciwciałami za pomocą FACS zgodnie z protokołem producenta.

3. Potencjał różnicowania

  1. Różnicowanie adipogenne
    1. Hodować izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjować z komercyjnym roztworem trypsyny, a następnie myć i osadzać przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty.
    2. W inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C hodować komórki w stężeniu 100 000 komórek/basenik na 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml CM.
    3. Po 24 godzinach zastąpić CM pożywką do różnicowania adipogennego (0,5 μM izobutyloksantyny, 1 μM deksametazonu, 10 μM insuliny i 200 μM indometacyny) i inkubować. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3 dni lub tak często, jak to konieczne.
    4. Po 3 tygodniach inkubacji utrwalić komórki 2 ml 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i zabarwić czerwonym olejem O, aby wykryć produkcję kropelek lipidów w celu analizy różnicowania adipogennego.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.
    5. Traktuj utrwalone komórki 60% izopropanolem (2 ml / dołek płytki 6-dołkowej) przez 5 minut.
    6. Zastąp izopropanol 2 ml czerwonej plamy olejowej O (przefiltruj 3 części plamy z czerwonego oleju O i 2 części wody destylowanej), inkubuj przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej i przemyj 3-4 razy wodą z kranu, aby usunąć wszelkie niezwiązane plamy.
    7. Wizualizuj zabarwione na czerwono kropelki lipidów, wskazujące na linię komórek adipogennych, za pomocą LM.
  2. Różnicowanie chondrogenne
    1. Hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z komercyjnym roztworem trypsyny i przemyj PBS.
    2. Aby osadzać komórki do indukcji chondrogennej, należy odwirować 250 000 komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z 2 ml CM przy 11 000 x g przez 8 minut. Inkubować granulki przez noc w temperaturze 37 °C.
    3. Po 24 godzinach delikatnie zastąpić CM chondrogenną pożywką różnicującą (20 ng TGFβ1, 10 ng insuliny, 100 nM deksametazonu i 100 μM kwasu askorbinowego) bez naruszania osadu i kontynuować inkubację. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3 dni lub tak często, jak to konieczne.
    4. Po 3 tygodniach inkubacji utrwalić komórki 2 ml 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kriosekcja i barwienie 1% błękitem toluidynowym w celu zbadania obecności lub produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej w celu określenia różnicowania chondrogennego.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.
    5. Do kriosekcji delikatnie umyj zebrane granulki komórek dwukrotnie PBS i utrwal 1 ml 4% paraformaldehydu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.
    6. Przemyć granulki dwukrotnie PBS w celu usunięcia paraformaldehydu i przenieść do roztworu sacharozy/OCT (1:2, 20% sacharoza:OCT). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, aby roztwór całkowicie wsiąkł w osady komórkowe; Umożliwi to płynne sekcjonowanie.
    7. Przenieś granulki do foremek OCT. Zamrażać formy w temperaturze -20 °C przez 4 - 6 godzin i kriosekcję około 10 - 12 mikronów odcinków granulek komórek za pomocą kriostatu do barwienia błękitem toluidyny.
    8. Delikatnie przemyć kriosekcje PBS; dodać kilka kropli 1% niebieskiej plamy toluidynowej, całkowicie pokrywając skrawki osadów na szkiełku; i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Umyj szkiełka kilkakrotnie PBS w celu odbarwienia. Usuń nadmiar plamy, zanurzając szkiełko w roztworze alkoholu na bazie HCl (95% alkoholu + 0,5 ml HCl) kilka razy, aż zniknie niezwiązany niebieski kolor. Zamontuj zabarwione sekcje za pomocą 100 μl roztworu montażowego w celu długotrwałej konserwacji szkiełek.
      UWAGA: Niebieskie zabarwienie skrawków wskazuje na obecność glikozaminoglikanów i glikoprotein i będzie można je obserwować za pomocą LM.
  3. Różnicowanie osteogenne
    1. Ponownie hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z komercyjnym roztworem trypsyny, a następnie umyj i osadź przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty.
    2. Subhodowla komórek w stężeniu 100 000 komórek/basenik na 6-dołkowych płytkach zawierających 2 ml CM w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    3. Po 24 godzinach zastąpić CM osteogennym podłożem różnicującym (0,1 μM deksametazonu, 10 μM β-glicerofosforanu i 50 μM fosforanu askorbinianu) i kontynuować inkubację. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3 dni lub tak często, jak to konieczne.
    4. Po 3 tygodniach inkubacji utrwalić komórki 2 ml 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i zabarwić czerwienią alizarynową, aby wykryć obecność osadów wapnia w celu określenia różnicowania osteogennego.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zachowanie ostrożności podczas noszenia rękawiczek i okularów podczas użytkowania.
    5. Delikatnie umyj utrwalone komórki dwukrotnie wodą destylowaną i potraktuj 2% czerwoną plamą alizaryny (2 ml / studzienkę na 6-dołkowej płytce) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Usuń nadmiar plamy, delikatnie myjąc ją wodą z kranu, aby osady wapnia nie zniknęły.
    7. Wizualizacja zabarwionych na czerwono osadów wapnia za pomocą LM.

4. Ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR)

  1. Hoduj izolowane komórki do 70% konfluencji, dysocjuj z komercyjnym roztworem trypsyny, przemyj i osadzaj przez wirowanie przy 1,500 x g przez 3 minuty, aby wyizolować całkowity komórkowy RNA.
  2. Umyj komórki PBS, aby usunąć ślady FBS, a następnie przystąp do izolacji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Oczyść wyizolowany całkowity RNA przez traktowanie DNazą w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy użyciu termocyklera. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przygotować trzykrotnie 10 μl reakcji PCR na 96-dołkowej płytce, przy czym każda reakcja zawiera 5 μl supermiksu SYBR-green PCR, 3 μl podwójnie destylowanej wody, 0,5 μl każdego startera, do przodu i do tyłu; oraz 1 μl rozcieńczonego (1:10) cDNA.
  5. Wykonaj PCR w następujących parametrach: 10 minut w temperaturze 98 °C, a następnie 44 cykle po 30 s każdy w temperaturze 98 °C, 20 s w 60 °C i 30 s w temperaturze 72 °C.
  6. Normalizować amplifikację genów docelowych do genów referencyjnych, GAPDH i β-ACTIN; sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 1.

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj wszystkie analizy za pomocą oprogramowania statystycznego. Przedstaw dane jako średnią ± SEM. Wyniki z wartością p (**p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05) uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekcja i izolacja komórek z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowinowo-łożyskowego i łożyska płodu

Tkanka okołoporodowa składa się z trzech odrębnych obszarów anatomicznych. Pierwszą z nich jest UC, zawierająca dwie tętnice i jedną żyłę, a także dwie odrębne strefy: CL (zewnętrzna wyściółka rdzenia) i WJ (galaretowaty materiał otaczający naczynia krwionośne wewnątrz rdzenia). Drugi to CPJ (połączenie między pępowiną a łożyskiem), a trzeci to FP, który następuje bezpośrednio po CPJ (pępowina wkłada się do łożyska, które jest przymocowane do ściany macicy matki). Schemat protokołu izolacji komórek z tkanki okołoporodowej przedstawiono na rysunku Rysunek 1. Cztery źródła - CL, WJ, CPJ i FP - są wyraźnie identyfikowalne i zostały oddzielone w celu wyizolowania komórek z eksplantatów, jak pokazano na Rysunek 2. Pojawienie się wyrostów komórkowych z kultur eksplantatów było rutynowo monitorowane i rejestrowane przez LM. Przylegające komórki fibroblastoidalne obserwowano po 3-4 dniach hodowli eksplantatów CPJ. Komórki o podobnej morfologii pojawiły się 7-8, 9-10 i 11-14 dni po wyhodowaniu eksplantatów WJ, CL i FP. Wyrostek komórek z eksplantatów reprezentujących różne źródła (CL, WJ, CPJ i FP) jest przedstawiony w Rysunek 3A. Komórki te były uważane za P0. Kiedy komórki P0 były hodowane, wydawało się, że rosną klonalnie, wykazując morfologię fibroblastoidów podobną do BM-MSC. Wykazały jednak zmienność w czasie podwojenia populacji, w zakresie od 32 godzin do 94 godzin dla komórek z CPJ i FP, jak pokazano na Rysunek 3B i C. Komórki z WJ i CL miały podobne czasy podwojenia przyśrodkowo do CPJ i FP. Dalsza analiza komórek P0 wykazała, że różniły się one również w CFE, wahając się od 16 do 92 kolonii. Komórki z CPJ miały najwyższy (92), podczas gdy komórki FP miały najniższy (16) CFE. Komórki z CL i WJ miały wartości CFE wynoszące odpowiednio 59 i 80 kolonii (Rysunek 4A-C). Komórki z CL miały wartości CFE podobne do BM-MSC. Wyniki te sugerują, że komórki pochodzące z CPJ mają wyższe zdolności proliferacyjne i samoodnawiające.

Profil immunologiczny wyizolowanych komórek

Komórki wyizolowane z CL, WJ, CPJ i FP zostały zbadane pod kątem ekspresji markerów specyficznych dla komórek. Komórki P3-5 wykazywały dodatnią ekspresję markerów MSCs, takich jak CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105 (Figura 5A i B). Wiadomo również, że komórki te wyrażają główny marker zgodności tkankowej klasy I, HLA-ABC, i nie wyrażają markera klasy II, HLA-DR3. Odsetek komórek dodatnich dla tych wybranych markerów ze wszystkich czterech źródeł był podobny do wyrażonego przez standardowe BM-MSC. Jednak współczynniki MFI wskazują, że komórki pochodzące z WJ i CPJ są prawie podobne i są nawet wyższe niż komórki pochodzące z CL i FP (Rysunek 5C). Co ciekawe, pomimo różnych wartości CFE, wszystkie komórki z różnych źródeł wyrażały podobne poziomy markerów MSC. Na podstawie wyników markerów powierzchniowych komórek, wyizolowane komórki ze wszystkich czterech źródeł uznano za MSC. Dalsza analiza tych komórek wykazała, że wyrażają one również geny pluripotencji, OCT4, NANOG, KLF4 i SOX2, jak pokazano na Rysunek 5D. CPJ-MSC miały najwyższą ekspresję markerów pluripotencji, a następnie WJ-, CL- i FP-MSC.

Potencjał różnicowania izolowanych MSCs

Złotym standardem charakteryzowania MSC jest ich zdolność do różnicowania się na wiele linii. Nasze wyniki wykazały, że wyizolowane MSCs ze wszystkich źródeł okołoporodowych łatwo różnicowały się w komórki adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne. Pochodne adipogenne wytwarzały kropelki lipidów, które były dodatnio barwione Oil Red O, jak pokazano na Rysunek 6A. Barwienie błękitem toluidynowym chondrogennej pochodnej MSCs wykazało obecność proteoglikanów i glikoprotein, które pomagały w produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej (Figura 6B). Osteogenne pochodne MSCs dodatnio barwione czerwienią alizarynową wskazują na obecność złogów wapnia biorących udział w mineralizacji kości, jak pokazano na Rysunek 6C.

Zgodnie z oczekiwaniami, analiza transkrypcyjna izolowanych MSCs ze wszystkich źródeł wykazała zróżnicowanie trójliniowe (Rysunek 6D-F). Potencjał różnicowania różnił się jednak w zależności od źródła MSC. Adipogenne pochodne WJ-MSCs charakteryzowały się 2-krotnie większymi poziomami ekspresji wybranych genów adipogennych (CEBPβ, FABP4 i PPARγ) w porównaniu z CPJ-MSC. CL- i FP-MSCs charakteryzowały się najniższą ekspresją tych genów. W przypadku różnicowania chondrogennego, pochodne CPJ-MSCs wykazywały 50-krotną ekspresję wybranych genów chondrogennych (SOX9 i COL2) niż pochodne WJ i FP-MSCs. Podobnie jak w przypadku słabego różnicowania adipogennego CL-MSC, miały one niższy potencjał chondrogeneczny, o czym świadczy najniższa ekspresja genów chondrogennych. CPJ-MSCs wykazały również najwyższy potencjał różnicowania osteogennego, na co wskazują 2-krotnie wyższe poziomy transkryptów wybranych genów osteogennych (COL1, OPN i OCN). Jednak ekspresja markera progenitorowego RUNX2 była najwyższa w osteogennych pochodnych WJ-MSC, co wskazuje, że komórki te wolno reagowały na warunki różnicowania. Ponownie, CL-MSC wykazały słabe różnicowanie w kierunku osteogennym. Wyniki te sugerują, że CPJ-MSC i WJ-MSC wykazywały większy potencjał różnicowania niż CL- i FP-MSC. CL-MSC miały najmniejszy potencjał różnicowania się w pochodne trójliniowe.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat izolacji komórek z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina z łożyskiem i łożyska płodu. Sprawdź pobraną próbkę i przystąp do sekcji. Krok 1. Ręcznie wypreparuj i rozdziel próbkę pępowiny/łożyska na trzy dyskretne obszary: pępowinę (UC), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP). Oddziel dwie odrębne strefy UC na podszewkę sznurka (CL) i galaretkę Whartona (WJ) za pomocą nożyczek i kleszczy. Krok 2. Pokrój każdą z wypreparowanych tkanek osobno na kawałki o średnicy od 1 do 2 mm za pomocą nożyczek i częściowo strawij kawałki. Krok 3. Zahoduj kawałki tkanki. Krok 4. Odizoluj komórki od eksplantatów poprzez leczenie trypsyną. Subkultura i scharakteryzuj izolowane komórki. Krok 5. Wyizolowane i scharakteryzowane komórki mogą być amplifikowane i wykorzystywane do różnych zastosowań. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Preparacja i hodowla eksplantatów z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina z łożyskiem i łożyska płodu. Pokazano trzy różne obszary anatomiczne próbki rdzenia/łożyska: UC (z podziałem na CL i WJ), CPJ i FP, a także powiązane tętnice i żyły. CL, WJ, CPJ i FP oddzielono ręczną sekcją w celu wyizolowania komórek z eksplantatów. Każdy z wypreparowanych obszarów został oddzielnie pocięty na małe fragmenty i wyhodowany na 75-centymetrowych płytkach2 przy użyciu 9 ml CM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Morfologia izolowanych komórek z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina z łożyskiem i łożyska płodu. (A) Przerost komórek z eksplantatów CL, WJ, CPJ i FP, jak wizualizowano za pomocą LM. (B) Subkultura izolowanych komórek z eksplantatów CL, WJ, CPJ i FP wykazała morfologię fibroblastoidów. Podziałka odpowiada 100 μm (powiększenie: 4X). (C) Czas podwojenia populacji wyizolowanych komórek z CL, WJ, CPJ i FP. Jako standard zastosowano BM-MSC. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej z trzech pomiarów (**p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Skuteczność tworzenia kolonii przez komórki z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowinowo-łożyskowego i łożyska płodu. (A) Wzrost komórek (P0) wyizolowanych z CL, WJ, CPJ i FP, posianych z gęstością klonalną 1,63 komórek / cm2, uwidoczniono za pomocą LM. (B) Mikrofotografie komórek barwionych fioletem krystalicznym wykazujących zdolność do tworzenia kolonii. (C) Pojedyncza kolonia komórek barwionych fioletem krystalicznym. Podziałka skali reprezentuje 100 μm (powiększenie: 4X). (D) Graficzne przedstawienie liczby kolonii utworzonych z komórek pochodzących z CL, WJ, CPJ i FP. Jako standard użyto BM-MSC. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej z trzech pomiarów (**p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza markerów MSC wyrażanych przez komórki wyizolowane z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowinowo-łożyskowego i łożyska płodu. (A) Ekspresja mezenchymalnych markerów powierzchniowych (CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105) przez komórki z CL, WJ, CPJ i FP, oznaczona za pomocą cytometrii przepływowej. (B i C) Graficzne przedstawienie procentowego udziału komórek dodatnich i średnich współczynników intensywności fluorescencji (MFI) dla wybranych mezenchymalnych markerów powierzchniowych. Współczynniki MIF obliczono, dzieląc wartość MFI markera (wygenerowaną przez oprogramowanie na podstawie intensywności fluorescencji populacji komórek bramkowanych) przez wartość MFI izotypu. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej z trzech pomiarów. (D) Ekspresja genów pluripotencji (OCT4, NANOG, KLF4 i SOX2) przez komórki z CL, WJ, CPJ i FP, określona metodą qRT-PCR. (**p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05). Ekspresja genów została znormalizowana do GAPDH i β-ACTIN, a słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej z potrójnych pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wieloliniowe różnicowanie MSC wyizolowanych z ludzkiej pępowiny, połączenia pępowina z łożyskiem i łożyska płodu. (A) Komórki inkubowano w pożywce do różnicowania adipogennego przez 3 tygodnie i barwiono czerwienią olejową O, wskazując na obecność kropelek lipidów. (B) Osady komórkowe inkubowano w pożywce do różnicowania chondrogennego przez 3 tygodnie. Kriosekcje histologiczne kultur osadów barwiono błękitem toluidynowym, wykazując obecność glikozaminoglikanów. (C) Komórki inkubowano w pożywce różnicującej kości przez 3 tygodnie i barwiono czerwienią alizarynową, wykazując produkcję złogów wapnia sugerujących mineralizację kości. Wszystkie obrazy zostały uzyskane przez LM. Podziałka odpowiada 100 μm (powiększenie: 4X). Standardem były BM-MSC. (D-F) Ekspresja wybranych genów (CEBPβ, FABP4 i PPARγ; SOX9, ACAN oraz COL2; oraz COL1, RUNX2, OPN i OCN reprezentujące różnicowanie MSCs odpowiednio na linie adipogenne, chondrogenne i osteogenne), jak określono za pomocą analizy qRT-PCR (**p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05). Ekspresja genów została znormalizowana do GAPDH i β-ACTIN, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z potrójnych pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

gen Sekwencje podkładowe Długość produktu PAŹ 4 Do przodu-CCCCTGGTGCCGTGAA 97 Rozdział 97 Odwrócony-GCAAATTGCTCGAGTTCTCTCTG NANOG powiedział: Naprzód- AAAGAATCTTCACCTATGCC Rozdział 110 Rewers- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT Zobacz materiał KLF4 Naprzód- CGAACCCACACAGGTGAGAA 94 Rozdział 94 Rewers- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC Klasa SOX2 Naprzód- TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 75 Rozdział Rewers- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC SOX9 (klasa SOX9) Naprzód- AGCGAACGCACATCAAGAC Rozdział 85 Rewers- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG COL2 (wersja angielska) Naprzód- CTCGTGGCAGAGATGGAGAA Z kolei 252 TGLI Rewers- CACCAGGTTCACCAGGATTG ACAN (Sieć ACAN) Naprzód- AGCCTGCGCTCCAATGACT Rozdział 103 Rewers- GGAACACGATGCCTTTCACC COL1 (wersja angielska) Naprzód- AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 114 Rozdział Rewers- GACCCTGTTCACCTTTTCCA BIEGX2 Naprzód- TGCTTCATTCGCCTCACAAA Rozdział 111 Rewers- AGTGACCTGCGGAGATTAAC OPN (Sieć OPN) Naprzód- CATACAAGGCCATCCCCGTT Rozdział 112 Rewers- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC Sieć OCN Naprzód- TAAACAGTGCTGGAGGCTGG Rozdział 191 Rewers- CTTGGACACAAAGGCTGCAC Certyfikat CEBPβ Dalej- TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94 Rozdział 94 Rewers- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG FABP4 powiedział: Naprzód- TTAGATGGGGGTGTCCTGGT Rozdział 158 Rewers- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA PPARγ Naprzód- GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74 Rozdział 74 Rewers- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG GAPDH Naprzód- ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG Rozdział 101 Rewers- GCCATCACGCCACAGTTTC aktyna Naprzód- AATCTGGCACCACACCTTCTAC 170 szt. Rewers- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

Tabela 1: Lista sekwencji ludzkich starterów użytych w tym badaniu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawne postępy w badaniach nad komórkami macierzystymi nie tylko przyczyniły się do lepszego zrozumienia podstawowych procesów rozwoju, ale także stworzyły obiecujące możliwości wykorzystania komórek macierzystych w zastosowaniach biotechnologicznych, farmaceutycznych, terapii komórkowej, medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej 18,19,20. Podczas gdy pluripotencjalne EKM wyizolowane z wczesnych zarodków są najbardziej obiecujące, stoją one przed wyzwaniami technicznymi i dylematami etycznymi 21,22,23. Alternatywą są indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z dorosłych komórek, ale one również borykają się z podobnymi problemami technicznymi i związanymi z bezpieczeństwem23. Ponadto komórki iPS mogą nie być stabilne genetycznie lub mogły ulec zmianom genetycznym, co ogranicza ich zastosowanie terapeutyczne. Komórki macierzyste zostały również zgłoszone w różnych tkankach i narządach postnatalnych. Najczęstszymi źródłami tych ASC są szpik kostny, tkanka tłuszczowa i mięśniowa. Jednak ASC ze źródeł postnatalnych mają ograniczony potencjał wzrostu i różnicowania24,25. Cierpią również z powodu starzenia się i narażenia na stresy środowiskowe, a zatem nie zawsze są skuteczne w zastosowaniach terapeutycznych 26,27,28. To skłoniło nas i innych do poszukiwania nowych źródeł komórek macierzystych, które są bardziej naiwne niż ASC.

Zbadaliśmy okołoporodowe źródła pierwotnych komórek macierzystych jako alternatywy dla ASC. W tym raporcie przedstawiamy niezawodną, solidną i prostą metodę izolowania ludzkich MSC od próbek pępowiny/łożyska. W porównaniu z innymi źródłami i metodami stosowanymi do izolacji ASC, metoda ta zapewnia skuteczną i nieinwazyjną metodę izolowania dużych ilości wysokiej jakości MSC. To dodatkowo podkreśla wyższy potencjał wzrostu i różnicowania okołoporodowych MSCs w porównaniu z MSCs ze źródeł dorosłych, takich jak BM.

UC łączące płód z łożyskiem jest dużym narządem z odrębnymi obszarami anatomicznymi, w tym dwiema tętnicami, żyłą, CL i WJ (tkanką otaczającą naczynia krwionośne). W kilku badaniach wykazano izolację MSCs z całego pasma rozdzielczego, WJ lub łożyska, o zmiennym potencjale wzrostu i różnicowania25,29. Niemniej jednak do tej pory w żadnym badaniu nie zbadano skutecznie i nie porównano komórek z różnych regionów anatomicznych próbki pępowiny/łożyska. Przedstawiamy tutaj systematyczną i prostą metodę preparacji UC, CPJ i połączonego FP w celu izolacji MSC. Pokazujemy również kompleksowy i prosty protokół charakteryzujący i oceniający jakość izolowanych komórek poprzez określenie ich zdolności do proliferacji, a także ich potencjału samoodnawiania i różnicowania. Ta metoda jest powtarzalna i daje dużą ilość MSCs najwyższej jakości.

Odkryliśmy, że częściowe trawienie fragmentów tkanek o wielkości 1-2 mm przy użyciu komercyjnego roztworu trypsyny w sposób powtarzalny dawało komórki z eksplantatów, podczas gdy całkowite trawienie tkanki na pojedyncze komórki miało słabą wydajność izolowanych komórek. Jednak jedno z badań wykazało, że większe eksplantaty tkankowe UC o wielkości około 10 mm były optymalne do izolacji komórek30. I odwrotnie, inne badanie sugerowało, że metoda eksplantatu tkanek skutkowała dłuższym cyklem hodowli i niższą wydajnością komórek w porównaniu z metodą trawienia enzymatycznego31. W poprzednich doniesieniach leczenie tkanek pępowinowych kolagenazą II i hialuronidazą, oddzielnie lub po trypsyny, przeprowadzono w celu wyizolowania komórek pępowinowych 32,33,34. Nie tylko istnieje duża różnorodność w metodach trawienia tkanki pępowinowej przed hodowlą, ale także izolowane komórki wydają się być niejednorodne. Stosowanie ostrych enzymów przez dłuższy czas może degradować błonę komórkową, wpływając na przyleganie komórek i proliferację. Wyniki tej metody wykazały, że częściowo strawione eksplantaty tkanek okołoporodowych zapewniały wzrost komórek bez powodowania rozległych uszkodzeń komórek, utrzymywały żywotność i dawały większe ilości jednorodnych populacji MSC.

Chociaż protokół sekcji i izolacji komórek z eksplantatów jest prosty, niektóre kroki mogą okazać się trudne. Po pierwsze, należy upewnić się, że eksplantat przylega do podłoża, pozwalając na ich przyczepienie się do powierzchni kolby hodowlanej. Można to ułatwić, stosując niewielką ilość pożywki, przykrywając tylko kawałki tkanek przez pierwsze 2 godziny hodowli, a następnie ostrożnie dodając pozostałą pożywkę. Po drugie, należy ograniczyć liczbę eksplantatów do mniej niż 15 na kolbę T75. Zbyt mała przestrzeń między kawałkami lub zbyt wiele kawałków w kolbie hamuje wzrost komórek. Po trzecie, fragmenty tkanek, które nie przyklejają się do powierzchni kolby hodowlanej po 3 dniach inkubacji, należy przenieść do nowej kolby w celu przylegania i hodowli. Po czwarte, fragmenty tkanek przeznaczone do hodowli powinny być wolne od resztek komórkowych, które hamują przyczepianie. Po piąte, hodowla dużych kawałków wymaga większej ilości pożywki i nie poprawia wydajności wzrostu komórek. Na koniec należy uważnie monitorować kultury eksplantatów, szczególnie po pojawieniu się przerostu komórek, ponieważ komórki mogą szybko zlewać się i różnicować w zależności od źródła tkanki. Kilka ograniczeń tej techniki obejmuje brak wiedzy specjalistycznej w zakresie analizowania próbek w celu oddzielenia CL, WJ, CPJ i FP; mała liczebność próby, co skutkuje niską wydajnością WJ; i opóźnione przetwarzanie - próbki muszą zostać przetworzone w ciągu 2-4 godzin od pobrania, aby uniknąć utraty odzysku komórek.

Złotym standardem w charakterystyce MSCs jest zdolność do przylegania do plastiku, tworzenia fenotypu fibroblastycznego i różnicowania się w wiele linii. Są to również powszechnie stosowane kryteria definiowania MSC zgodnie z opisem ISCT35. W tym badaniu komórki wyizolowane ze wszystkich czterech źródeł przylegały do plastiku i miały dodatnią ekspresję markerów MSC (CD29, CD44, CD73, CD90 i CD105), ale ujemną ekspresję markera hematopoetycznego CD45. Ponadto wykazywały one ekspresję ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) klasy I, ale były ujemne dla HLA klasy II. W porównaniu z BM-MSC, komórki pochodzące z WJ i CPJ były wyższe. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi raportami MSC wywodzącymi się z UC 33,36,37,38. Ponadto nasze wyniki wykazały, że CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs wyrażają geny pluripotencji, takie jak OCT4, NANOG i SOX2; jednak ich ekspresja była niższa niż w przypadku ESC, jak podano wcześniej39. Wyniki te były również zgodne z poprzednim badaniem, w którym stwierdzono ekspresję markerów pluripotencji w komórkach pochodzących okołoporodowo40. Co ciekawe, zaobserwowano, że ekspresja markera pluripotencjalnego była wyższa w CPJ-MSC niż w komórkach wyizolowanych z innych źródeł. Zauważono również, że UC-MSCs wykazywały większy potencjał samoodnawiania się niż BM-MSCs41. Co ciekawe, pomimo podobieństwa w charakterystyce fenotypowej, komórki wyizolowane z czterech źródeł miały zmienne wartości CFE. Jednak z wyjątkiem FP-MSC, wszystkie miały lepsze wartości CFE niż BMC. CPJ-MSC-MESC miały najwyższą wartość CFE i tempo proliferacji w porównaniu ze wszystkimi innymi MSC. Ponadto WJ- i CPJ-MSC wykazywały wyższy potencjał różnicowania niż BM-MSC. CL-MSC wykazywały najmniejszy potencjał różnicowania we wszystkich trzech liniach (tj. adipogennej, chondrogenicznej i osteogennej), podczas gdy CPJ-MSC miały najwyższy potencjał różnicowania trójliniowego, a FP-MSC wykazywały najmniejszy potencjał różnicowania adipogennego.

Podsumowując, nasze wyniki wykazały, że jakość i ilość wyizolowanych MSCs różniła się między czterema źródłami w próbce pępowiny/łożyska. CPJ-MSC miały większą zdolność do proliferacji i większy potencjał samoodnawiania. Były również silne w różnicowaniu się w trójliniowe typy komórek. Ze względu na krótki czas podwajania, CPJ-MSC mogą być szybko rozbudowywane 1000-krotnie i wykorzystywane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków lub biomateriałów. Komórki te mogą być bardziej obiecującym źródłem zastosowań w terapii komórkowej i medycynie regeneracyjnej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie było wspierane przez OU-WB ISCRM, Oakland University oraz Michigan Head and Spine Institute. N. Beeravolu i C. McKee otrzymali Provost Graduate Research Award od Oakland University. Dziękujemy S. Bakshi za zrecenzowanie manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM z 4,500 mg / ml glukozyInvitrogen11995065
FBSAleken BiologicalsFBSS500
Izobutylo-metyloksantynaSigmaI5879-250mg
DeksametazonSigmaD4902-100mg
InsulinaProspecCYT-270
IndometacynaSigmaI7378-5G
TGFβ 1ProspecCYT-716
Kwas askorbinowySigmaA-7631
2-fosforan askorbinianuSigmaA-8960
β-glicerofosforanSigmaG-6251
TrypLEInvitrogen50591419
zestaw do oczyszczania RNAGeneJET Thermo ScientificK0732
DNasePromegaM6101
iScript kitBiorad1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix KitBiorad1725274
4% paraformaldehydAffymetrix19943
OCTThermo ScientificSH75-125D
Oil Red O Amerykański MasterTech ScientificSTORO100
Błękit toluidynowyThermo ScientificS71363
Kryształowy fioletSigmaC3886
Czerwona plama alizarynyThermo ScientificS25131
APC Mysz anty-ludzka CD29BD Biosciences 
Mysz APC anty-ludzka CD34BD Biosciences 
Mysz FITC anty-ludzka CD44BD Biosciences 
Mysz FITC anty-ludzka CD45BD Biosciences 
Mysz APC anty-ludzka CD73BD Biosciences 
Mysz FITC anty-ludzka CD90BD Biosciences 
Mysz APC anty-ludzka CD105BD Biosciences 
WirówkaIEC93522M-2
Inkubator CO2Thermo ScientificHera Cell 150i
Mikroskop świetlny (LM)Nikon Instruments Inc.Olympus
Thermo Scientific0267151B
KriostatLeicaCM3050 S
FACS, Canto II i oprogramowanie Diva, BD Biosciences Pieśń II 
TermocyklerMJ Research Inc.PTC-100
 Bio-RadCFX96
559883555824555478555482560847561969562408Hemacytometr , , System PCR w czasie rzeczywistym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1(2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029(2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10(2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24(2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425(2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215(2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134(2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487(2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika hodowli eksplantat wz cze p powiny i o yskagalaretka Whartonawy ci ka p powinywydajno tworzenia koloniianaliza cytometrycznar nicowanie tr jliniowe

Powiązane artykuły