Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Funkcjonalność połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) odgrywa kluczową rolę podczas badania chorób, w których komunikacja między neuronem ruchowym a mięśniami jest zaburzona, takich jak starzenie się i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Tutaj opisujemy protokół eksperymentalny, który można wykorzystać do pomiaru funkcjonalności NMJ poprzez połączenie dwóch rodzajów stymulacji elektrycznej: bezpośredniej stymulacji błony mięśniowej i stymulacji przez nerw. Porównanie reakcji mięśni na te dwie różne stymulacje może pomóc w zdefiniowaniu, na poziomie funkcjonalnym, potencjalnych zmian w NMJ, które prowadzą do funkcjonalnego pogorszenia stanu mięśni.
Ex vivo preparaty są odpowiednie do dobrze kontrolowanych badań. Tutaj opisujemy intensywny protokół pomiaru kilku parametrów funkcjonalności mięśni i NMJ dla przygotowania nerwu płaszczkowato-kulszowego oraz dla przygotowania nerwu przeponowo-przeponowego. Protokół trwa około 60 minut i jest prowadzony w sposób nieprzerwany za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania, które mierzy właściwości kinetyki drgań, stosunek siły do częstotliwości zarówno dla stymulacji mięśni, jak i nerwów oraz dwa parametry specyficzne dla funkcjonalności NMJ, tj. awarię neurotransmisji i zmęczenie śródtężcowe. Metodologia ta została wykorzystana do wykrycia uszkodzeń w preparatach mięśniowo-nerwowych płaszczkowatych i przeponowych przy użyciu transgenicznej myszy SOD1G93A, eksperymentalnego modelu ALS, który wszechobecnie wykazuje nadekspresję zmutowanego enzymu przeciwutleniającego dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1).
Wprowadzenie
Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa chemiczna utworzona przez połączenie między motoryczną płytką końcową włókna mięśniowego a zakończeniem aksonu neuronu ruchowego. Wykazano, że NMJ odgrywa kluczową rolę, gdy komunikacja między mięśniami a nerwami jest upośledzona, jak ma to miejsce w starzeniu się lub stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Ponieważ mięśnie i nerwy komunikują się w sposób dwukierunkowy1,2, możliwość pomiaru wad NMJ oddzielnie od wad mięśniowych może dostarczyć nowych informacji na temat ich fizjologicznych wzajemnych oddziaływań. Rzeczywiście, ta ocena funkcjonalna może pomóc w ocenie, czy zmiany morfologiczne lub biochemiczne zmniejszają funkcjonalność sygnalizacji neurotransmisyjnej.
Porównanie reakcji skurczowej mięśni wywołanej przez stymulację nerwów i reakcji tego samego mięśnia wywołanej bezpośrednią stymulacją jego błony zostało zaproponowane jako pośredni pomiar funkcjonalności NMJ. Rzeczywiście, ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację neurotransmisyjną, wszelkie różnice w dwóch reakcjach skurczowych można przypisać zmianom w NMJ. To podejście zostało szeroko zaproponowane dla rats3,4,5,6,7, a także używane do zbierania informacji o modelach myszy8,9,10,11,12.
Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę wycinania i testowania dwóch preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. preparatów płaszczkowato-kulszowych i przeponowo-przeponowych. Korzystając z niestandardowego oprogramowania, zaprojektowaliśmy protokół ciągłego testowania, który łączy pomiar kilku parametrów charakteryzujących zarówno NMJ, jak i funkcjonalność mięśni, uzyskując w ten sposób kompleksową ocenę uszkodzenia NMJ oddzielnie od uszkodzenia mięśni. W szczególności protokół mierzy siłę skurczu, kinetykę mięśni, krzywą siła-częstotliwość dla stymulacji bezpośredniej i nerwowej, awarię neurotransmisji13 zarówno dla częstotliwości odpalania, jak i tężcowej, oraz zmęczenie śródtężcowe7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Sapienza w Rzymie – Jednostkę Histologii i Embriologii Medycznej i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualną wersją włoskiej ustawy o ochronie zwierząt.
1. Układ eksperymentalny
- Przygotuj układ eksperymentalny składający się z 1 aktuatora/przetwornika, 2 stymulatorów, 1 aparatu do badań mięśni in-vitro, 1 kąpieli preparatywnej, 1 elektrody ssącej, 1 oscyloskopu cyfrowego, 1 stereomikroskopu, 1 oświetlacza zimnym światłem, 1 karty akwizycji danych, 1 bloku złączy oraz komputera osobistego.
UWAGA: Oprogramowanie sterujące zostało zaprogramowane w środowisku LabView i zaprojektowano je w celu zapewnienia wysokiej elastyczności, dokładności i powtarzalności stymulacji. Dla każdej stymulacji użytkownik może wybrać szerokość impulsu, częstotliwość, czas trwania oraz zdecydować, czy stymulacja jest dostarczana do błony, czy poprzez nerw. Użytkownik może również wybrać długość okresu spoczynku przed każdą stymulacją.
2. Ocena właściwości kurczliwych NMJ mięśni soleus i przepony
- Rozgrzewanie systemu
- Przygotować bufor Krebsa-Ringera14 i umieścić go w kąpieli urządzenia montażowego oraz w preparatoryjnej kąpieli tkankowej. W preparatoryjnej kąpieli tkankowej umieścić szalkę o średnicy 60 mm z 4 ml silikonu.
- Włączyć wodną łaźnię cyrkulacyjną i ustawić temperaturę na 30 °C dla mięśnia płaszczowatego oraz 27 °C dla mięśnia przepony.
- Zapewnić dopływ mieszaniny 95% O2 - 5% CO2 do obu kąpieli.
- Włączyć siłownik/przetwornik oraz dwa stymulatory impulsowe i ustawić wartości prądu na 30 mA dla stymulacji błonowej oraz na 5 mA dla stymulacji nerwu.
UWAGA: Wcześniej wykazano, że wartość prądu 30 mA nie wywołuje żadnego istotnego skurczu gałęzi nerwowych po dodaniu d-tubokuraryny do roztworu15. Wartość prądu 5 mA odpowiada ilości prądu wymaganej do stymulacji mięśnia poprzez nerw bez nakładania się na stymulację błonową indukowaną za pomocą roztworu. Ponieważ odległość między elektrodą ssącą a mięśniem zależy od długości nerwu, wartość ta musi być ostrożnie dostosowana przed każdym eksperymentem, zgodnie z poniższym opisem.
- Disekcja mięśnia płaszczowatego i przepony
- Uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych w celu zminimalizowania cierpienia, a następnie niezwłocznie wyciąć mięśnie do badań w następujący sposób.
- Przygotowanie, disekcja i montaż kompleksu mięsień płaszczowaty-nerw kulszowy
- Spryskać nogę myszy 70% etanolem i usunąć skórę pokrywającą nogę. Wykonać nacięcie w górnej części nogi nożyczkami, a następnie mocno odciągnąć skórę. Odseparować ścięgno Achillesa od kości piszczelowej, a następnie przeciąć ścięgno Achillesa nożyczkami.
- Mocno uchwycić ścięgno pęsetą i delikatnie odciągnąć mięsień brzuchaty łydki wraz z mięśniem płaszczowatym. Po odsłonięciu proksymalnego ścięgna mięśnia płaszczowatego wyciąć całą łydkę nożyczkami, wciąż trzymając ścięgno Achillesa. Próbkę tkanki bezzwłocznie umieścić w preparatoryjnej kąpieli tkankowej.
- Umieścić kąpiel preparatoryjną pod stereomikroskopem i przymocować łydkę do silikonowej szalki za pomocą stalowych pinów o średnicy 0,20 mm. Używając pęsety, uchwycić proksymalne ścięgno mięśnia płaszczowatego i delikatnie odciągnąć je, aby odsłonić unerwienie kulszowe.
- Po odsłonięciu unerwienia (Rycina 1) ostrożnie usunąć otaczającą tkankę, aby odsłonić około 5 mm nerwu. Przeciąć nerw precyzyjnymi nożyczkami. Trzymając mocno mięsień płaszczowaty za ścięgno proksymalne pęsetą, ponownie go odciągnąć i wyciąć poprzez przecięcie ścięgna Achillesa nożyczkami.
- Przeciągnąć nylonową nitkę przez otwór ramienia dźwigni siłownika/przetwornika. Wykonać pętlę na końcu nitki, chwycić ścięgno Achillesa, a następnie cofnąć nitkę, aż mięsień dotrze do kąpieli urządzenia montażowego. Zaciągnąć ścięgno proksymalne w uchwycie stałym i zawiązać nylonową nitkę wokół ramienia dźwigni. Pozostawić mięsień do wyrównania w roztworze.
- Wyznaczyć początkową długość optymalną (L0).
- Najpierw rozciągnąć mięsień, aby uzyskać obciążenie wstępne 10 mN (wartość ta gwarantuje maksymalną siłę skurczu pojedynczego na podstawie doświadczenia). Następnie delikatnie rozciągać mięsień, zmieniając obciążenie wstępne i stymulować go serią pojedynczych impulsów. Długość optymalna zostaje osiągnięta, gdy zmierzy się maksymalną siłę skurczu pojedynczego.
- Przygotowanie, disekcja i montaż kompleksu przepona-nerw przeponowy
- Spryskać skórę myszy 70% etanolem. Usunąć skórę pokrywającą mięsień przepony, wykonując nacięcie nad mostkiem nożyczkami i mocno odciągając skórę.
- Za pomocą nożyczek przeciąć brzuch poziomo poniżej mostka i delikatnie usunąć jelita oraz organy pęsetą. Użyć grubych nożyczek do przecięcia kręgosłupa.
- Przeciąć żebra około 1 cm nad mostkiem i kontynuować poziomo. Delikatnie usunąć organy zewnętrzne pęsetą i przeciąć kręgosłup, aby uzyskać kolisty pierścień żeber zawierający przeponę.
- Przepłukać preparat w szalce zawierającej bufor Krebsa-Ringera, a następnie umieścić go w silikonowej szalce wewnątrz preparatoryjnej kąpieli tkankowej, stroną górną do góry i mostkiem do przodu.
- Używając stereomikroskopu, ostrożnie usunąć płuca i pozostałe organy; nerw przeponowy będzie widoczny po prawej stronie (Rycina 2A).
- Przyciąć żebra tak, aby pozostawić pierścień o szerokości około 2 mm wzdłuż całej przepony.
- Używając pęsety, przymocować jeden stalowy pin o średnicy 0,20 mm do centralnego ścięgna przepony w punkcie odpowiadającym unerwieniu nerwu przeponowego oraz drugi pin do żeber na tej samej osi, aby zidentyfikować interesujący nas pas przepony.
- Przymocować dwa dodatkowe piny do ścięgna centralnego i dwa kolejne piny do żeber po obu stronach wybranego pasa, aby rozłożyć przeponę. W razie potrzeby oczyścić nerw przeponowy z otaczającej tkanki łącznej za pomocą pęsety.
- Używając zakrzywionego ostrza, przeciąć przeponę po obu stronach unerwienia, aby wyodrębnić pas ścięgno-mięsień-żebro, jak pokazano na Rycynie 2B.
- Przeciągnąć nylonową nitkę przez otwór ramienia dźwigni siłownika/przetwornika. Wykonać pętlę na końcu nitki, chwycić ścięgno, a następnie cofnąć nitkę, aż mięsień dotrze do kąpieli urządzenia montażowego.
- Zaciągnąć żebra w uchwycie stałym i zawiązać nylonową nitkę wokół ramienia dźwigni.
- Pozostawić mięsień do wyrównania w roztworze i wyznaczyć początkową długość optymalną (L0).
- Rozciągnąć mięsień, aby uzyskać obciążenie wstępne 5 mN. Delikatnie rozciągać mięsień, zmieniając obciążenie wstępne i stymulować go serią pojedynczych impulsów. Długość optymalna zostaje osiągnięta, gdy zmierzy się maksymalną siłę skurczu pojedynczego.
Rysunek 1 - Preparat mięśnia płatkowatego i nerwu kulszowego. Mięsień płatkowaty i nerw kulszowy podczas operacji chirurgicznej w celu przeprowadzenia testów funkcjonalnych. Nerw kulszowy zostaje odsłonięty za pomocą pęsety. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2 - Preparat przepony i nerwu przeponowego. Zdjęcie przedstawia etap wycięcia preparatu przepony i nerwu przeponowego (A) oraz pasek przygotowany do montażu w celu przeprowadzenia testów funkcjonalnych (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Pomiar właściwości NMJ oddzielnie od kurczliwości mięśnia
- Ustaw optymalną intensywność prądu dla stymulacji poprzez nerw i zweryfikuj, czy impulsy prądowe dostarczane przez elektrodę ssącą nie wywołują skurczu mięśnia w wyniku rozprzestrzeniania się prądu w kąpieli.
- Umieść elektrodę ssącą w pobliżu mięśnia i wciągnij nerw do środka. Powoli zwiększając intensywność prądu (zaczynając od 5 mA), stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów. Optymalną wartość prądu ustala się w momencie, gdy siła drgnięcia jest maksymalna.
- Wysuń nerw z elektrody i podaj kilka pojedynczych impulsów. Upewnij się, że mięsień nie kurczy się z powodu nakładania się stymulacji błony za pośrednictwem roztworu. Ponownie wciągnij nerw.
- Uruchom program i wybierz plik wejściowy, aby przeprowadzić wybrany protokół testowy.
UWAGA: Plik wejściowy zawiera wszystkie parametry stymulacji niezbędne do przeprowadzenia całego protokołu. Chociaż dla obu mięśni stosowana jest ta sama struktura protokołu, parametry stymulacji różnią się w zależności od tego, czy protokół odnosi się do mięśnia płaszczowatego, czy przepony.- Stymulacja mięsień płaszczowaty-nerw kulszowy (patrz Tabela 1)
- Dla wszystkich stymulacji elektrycznych stosuj następujące szerokości impulsów: 1,4 ms dla stymulacji nerwu kulszowego oraz 0,1 ms dla bezpośredniej stymulacji mięśnia płaszczowatego. Cały protokół trwa około 65 min.
- Stymulacja przepona-nerw przeponowy (patrz Tabela 2)
- Dla wszystkich stymulacji elektrycznych stosuj następujące szerokości impulsów: 1,8 ms dla stymulacji nerwu przeponowego oraz 0,2 ms dla bezpośredniej stymulacji przepony. Cały protokół trwa około 5 min.
- Po zakończeniu protokołu eksperymentalnego zmierz długość i masę mokrą mięśnia, odpowiednio za pomocą analogicznego suwmiarki o dokładności 0,05 mm i wagi precyzyjnej o dokładności 0,1 mg.
- Oblicz pole przekroju poprzecznego (CSA), dzieląc masę mięśnia przez iloczyn optymalnej długości włókien (Lf) i gęstości szkieletowego mięśnia ssaków (1,06 mg/mm3)16.
UWAGA: Lf otrzymuje się mnożąc L0 przez stosunek długości włókien do długości mięśnia (0,71 dla mięśnia płaszczowatego16 i 1 dla mięśnia przepony17).
- Oblicz pole przekroju poprzecznego (CSA), dzieląc masę mięśnia przez iloczyn optymalnej długości włókien (Lf) i gęstości szkieletowego mięśnia ssaków (1,06 mg/mm3)16.
- Stymulacja mięsień płaszczowaty-nerw kulszowy (patrz Tabela 1)
- Ustaw optymalną intensywność prądu dla stymulacji poprzez nerw i zweryfikuj, czy impulsy prądowe dostarczane przez elektrodę ssącą nie wywołują skurczu mięśnia w wyniku rozprzestrzeniania się prądu w kąpieli.
| Typ eksperymentu | Częstotliwość | Czas trwania | Powtórzenia | Stymulacja mięśnia lub nerwu | Cel |
| (Hz) | (s) | ||||
| Skurcz pojedynczy | Pojedynczy impuls | 1 | Mięsień | Siła i kinetyka skurczu pojedynczego | |
| Odpoczynek | 30 | ||||
| Skurcz pojedynczy | Pojedynczy impuls | 1 | Nerw | ||
| Odpoczynek | 30 | ||||
| Skurcz pojedynczy | Pojedynczy impuls | 1 | Mięsień | ||
| Odpoczynek | 30 | ||||
| Skurcz pojedynczy | Pojedynczy impuls | 1 | Nerw | ||
| Odpoczynek | 120 | ||||
| Tężec niecałkowity | 40 | 0.8 | 1 | Nerw | Krzywe siła/częstotliwość dla stymulacji nerwu i mięśnia |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec niecałkowity | 60 | 0.8 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec całkowity | 80 | 0.8 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec niecałkowity | 20 | 0.8 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec niecałkowity | 60 | 0.8 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec całkowity | 80 | 0.8 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec niecałkowity | 20 | 0.8 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec niecałkowity | 40 | 0.8 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 30 | ||||
| Paradygmat zmęczeniowy | 35 | 0.8 | 1 stymulacja mięśnia, po której następuje 14 stymulacji nerwu z czasem odpoczynku 1.2 s każda, powtórzone 20 razy | Zaburzenie neurotransmisji (NF) | |
| Odpoczynek | 90 | ||||
| Paradygmat zmęczeniowy | 80 | 0.8 | 1 stymulacja mięśnia, po której następuje 14 stymulacji nerwu z czasem odpoczynku 1.2 s każda, powtórzone 20 razy | Zaburzenie neurotransmisji (NF) i zmęczenie wewnątrz tężcowe (IF) | |
Tabela 1 - Protokół stymulacji mięśnia soleusa i nerwu kulszowego. Tabela przedstawia sekwencję testów, które tworzą pełny protokół badania preparatów mięśnia soleusa i nerwu kulszowego.
| Typ eksperymentu | Częstość | Czas trwania | Powtórzenia | Stymulacja mięśni lub nerwów | Cel |
| (Hz) | (s) | ||||
| Drganie | Pojedynczy impuls | 1 | Mięśnie | Siła i kinetyka skurczu pojedynczego | |
| Odpoczynek | 30 | ||||
| Drganie | Pojedynczy impuls | 1 | Nerw | ||
| Odpoczynek | 30 | ||||
| Drganie mięśnia | Pojedynczy impuls | 1 | Mięśnie | ||
| Odpoczynek | 30 | ||||
| drganie | Pojedynczy impuls | 1 | Nerw | ||
| Odpoczynek | 120 | ||||
| Niezlane tężec | 60 | 0.5 | 1 | Nerw | Krzywe siła/częstotliwość dla stymulacji nerwów i mięśni |
| Odpoczynek | 120 | ||||
| Tężec zlewający się | 100 | 0.5 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Tężec niefuzyjny | 40 | 0.5 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 120 | ||||
| Tężec niepołączony | 20 | 0.5 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 120 | ||||
| Niezwiązany tężec | 80 | 0.5 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 150 | ||||
| Niespojoną tężca | 80 | 0.5 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 150 | ||||
| Niespojoną tężca | 20 | 0.5 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 120 | ||||
| Tężec zlepny | 100 | 0.5 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 150 | ||||
| Tężec zlewający | 100 | 0.5 | 1 | Nerw | |
| Odpoczynek | 180 | ||||
| Niefuzyjny tężec | 60 | 0.5 | 1 | Mięsień | |
| Odpoczynek | 300 | ||||
| Paradygmat zmęczenia | 35 | 0.33 | 1 stymulacja mięśnia, po której następuje 14 stymulacji nerwu z czasem odpoczynku 0,67 s po każdej z nich, powtórzone 20 razy | Zaburzenia neurotransmisji (NF) | |
| Odpoczynek | 900 | ||||
| Paradygmat zmęczenia | 80 | 0.33 | 1 stymulacja mięśnia, po której następuje 14 stymulacji nerwu z czasem odpoczynku 0,67 s każda, powtórzone 20 razy | Zaburzenia neurotransmisji (NF) i zmęczenie wewnątrztetaniczne (IF) | |
Tabela 2 – Protokół stymulacji nerwu przeponowego i przepony. Tabela przedstawia sekwencję testów tworzących kompletny protokół badania preparatów nerwu przeponowego i przepony.
3. Analiza danych
UWAGA: Na koniec protokołu oblicz wszystkie pożądane parametry w następujący sposób.
- Z pojedynczej stymulacji impulsem
- Oblicz siłę skurczu pojedynczego (mN; maksymalna aktywna siła generowana podczas skurczu pojedynczego) oraz specyficzną siłę skurczu pojedynczego (mN/mm²).2Oblicz tę wartość, odejmując wartość początkowego obciążenia wstępnego od maksymalnej siły wygenerowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę drgnienia jako stosunek siły drgnienia do pola przekroju poprzecznego (CSA) mięśnia.
- Oblicz czas do osiągnięcia maksymalnego napięcia (TTP) (ms) jako czas od zwolnienia impulsu do uzyskania siły skurczu.
- Oblicz połowę czasu relaksacji (1/2RT) (ms) jako czas od wystąpienia siły skurczu do osiągnięcia 50% siły skurczu.
- Oblicz dF/dt (mN/ms) jako wartość maksymalną pochodnej siły podczas fazy skurczu.
- Oblicz -dF/dt (mN/ms) jako maksymalną wartość pochodnej siły w fazie rozluźnienia.
- Z serii impulsowych stymulacji
- Oblicz siłę niespojoną (mN) i specyficzną siłę niespojoną (mN/mm²)2). Oblicz ją, odejmując wartość początkowego obciążenia wstępnego od maksymalnej siły wygenerowanej przez mięsień. Oblicz swoistą siłę niefuzyjną jako iloraz siły niefuzyjnej i przekroju poprzecznego (CSA) mięśnia.
UWAGA: Siła niezsumowana to maksymalna siła aktywna generowana podczas serii impulsów o częstotliwości niższej niż częstotliwość tężcowa. - Oblicz siłę tetaniczną (mN) oraz swoistą siłę tetaniczną (mN/mm2); siła maksymalna to maksymalna aktywna siła wygenerowana podczas serii impulsów dostarczonych z częstotliwością tetaniczną. Oblicz ją, odejmując początkową wartość obciążenia wstępnego od maksymalnej siły wygenerowanej przez mięsień. Oblicz swoistą siłę tetaniczną jako iloraz siły tetanicznej i pola przekroju poprzecznego (CSA) mięśnia.
- Oblicz krzywą siła-częstotliwość. Przedstaw na wykresie wartość siły (lub siły specyficznej) uzyskanej dla każdej stymulacji w funkcji rosnącej częstotliwości stymulacji. Zazwyczaj proces ten rozpoczyna się od stymulacji pojedynczym impulsem i kończy na częstotliwości tężcowej.
- Oblicz siłę niespojoną (mN) i specyficzną siłę niespojoną (mN/mm²)2). Oblicz ją, odejmując wartość początkowego obciążenia wstępnego od maksymalnej siły wygenerowanej przez mięsień. Oblicz swoistą siłę niefuzyjną jako iloraz siły niefuzyjnej i przekroju poprzecznego (CSA) mięśnia.
- Z paradygmatów zmęczeniowych
- Oblicz awarię neurotransmisji (NF) według wzoru:
gdzie MF to spadek siły po stymulacji mięśnia, a F to spadek siły po stymulacji nerwu, pomierzony podczas pierwszej serii impulsów po stymulacji mięśnia. - Obliczyć zmęczenie wewnątrztetaniczne (IF) według wzoru:
gdzie Flp jest siłą generowaną przez mięsień przy ostatnim impulsie stymulacji, a Fm stanowi maksymalną siłę generowaną przez mięsień podczas tego samego pociągu impulsów. W odniesieniu do stymulacji nerwu należy obliczyć zmęczenie wewnątrztetaniczne dla pierwszego pociągu impulsów bezpośrednio po stymulacji bezpośredniej.
- Oblicz awarię neurotransmisji (NF) według wzoru:
4. Analiza statystyczna
UWAGA: Modele analizy statystycznej muszą zostać dobrane w zależności od tego, czy odpowiedź mięśni na stymulację nerwową i błonową jest porównywana w obrębie tego samego modelu zwierzęcego, czy pomiędzy dwoma różnymi modelami zwierzęcymi18,19.
- W przypadku porównywania wyłącznie odpowiedzi mięśni na stymulację bezpośrednią i pośrednią w odniesieniu do TTP, 1/2RT, dF/dt oraz -dF/dt, należy zastosować test t Student’a. W przypadku porównywania preparatów mięśniowych otrzymanych od dwóch różnych szczepów myszy należy zastosować dwuczynnikową analizę wariancji (2-way ANOVA), przyjmując typ stymulacji oraz szczep myszy jako czynniki stałe. Gdy 2-way ANOVA wykaże istotny wynik, należy zastosować testy porównań wielokrotnych w celu poszukiwania różnic statystycznych.
- W przypadku krzywej siła-częstotliwość (jeśli porównywane są wyłącznie odpowiedzi mięśni na stymulację bezpośrednią i pośrednią) należy zastosować 2-way ANOVA z typem stymulacji i częstotliwością stymulacji jako czynnikami stałymi. W razie potrzeby należy zastosować testy porównań wielokrotnych.
- Jeśli porównywane są preparaty mięśniowe otrzymane od dwóch różnych szczepów myszy, należy zastosować trójczynnikową analizę wariancji (3-way ANOVA) z typem stymulacji, częstotliwością stymulacji i szczepem myszy jako czynnikami stałymi.
- Gdy 3-way ANOVA wykaże istotny efekt czynników takich jak szczep zwierzęcia i typ stymulacji, należy zastosować 2-way ANOVA, aby zidentyfikować istotne różnice między dwiema grupami na raz. Można na przykład ocenić różnice w odpowiedzi mięśniowej dwóch grup na stymulację błony lub różnice między odpowiedzią mięśnia na stymulację bezpośrednią a pośrednią w obrębie jednej grupy.
- Jeśli porównywane są preparaty mięśniowe otrzymane od dwóch różnych szczepów myszy, należy zastosować trójczynnikową analizę wariancji (3-way ANOVA) z typem stymulacji, częstotliwością stymulacji i szczepem myszy jako czynnikami stałymi.
- Zmęczenie intratetaniczne
UWAGA: Ponieważ protokół został zaprojektowany tak, aby wywołać zmęczenie w odpowiedzi na stymulację nerwu nawet u myszy kontrolnych, parametr ten może być wykorzystany wyłącznie do badania różnic między dwoma szczepami myszy; analiza statystyczna w obrębie jednej grupy zawsze wykaże różnice istotne.- Aby porównać dwie grupy, należy zastosować 3-way ANOVA z typem stymulacji, czasem i szczepem myszy jako czynnikami stałymi. Gdy 3-way ANOVA wykaże istotny efekt czynników takich jak szczep zwierzęcia i typ stymulacji, należy zastosować 2-way ANOVA, aby zidentyfikować istotne różnice między dwiema grupami na raz, analogicznie jak w przypadku krzywej siła-częstotliwość.
- W przypadku niewydolności neurotransmisji należy zastosować 2-way ANOVA ze szczepem zwierzęcia i czasem jako czynnikami stałymi. Jeśli analiza wykaże istotne wyniki, należy zastosować testy porównań wielokrotnych w celu poszukiwania różnic statystycznych.
UWAGA: Ponieważ parametr ten dostarcza tylko jednej wartości dla każdego szczepu myszy, pozwala on na porównywanie różnych modeli mysich. - W przypadku masy, długości i CSA mięśnia należy zastosować test t Student’a w celu zbadania różnic podczas porównywania preparatów mięsień-nerw z różnych modeli zwierzęcych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany protokół dostarcza informacji na temat funkcjonalnej denervacji w przypadku różnych chorób neuromięśniowych lub sarkopenii związanej z wiekiem. Protokół ten może być wykorzystany do ustalenia, czy (i jeśli tak, na jakim poziomie) zmiany mięśniowe wynikają z wybiórczych zmian zachodzących w samym mięśniu czy w przekazywaniu sygnału nerwowo-mięśniowego. Dane przedstawione poniżej są wynikami wcześniejszej pracy naszego zespołu18, przeprowadzonej na transgenic...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej protokół eksperymentalny zapewnia idealny sposób pomiaru i rozróżniania wszelkich zmian funkcjonalnych, które wystąpiły bezpośrednio w mięśniu lub pośrednio na poziomie połączenia nerwowo-mięśniowego. Ponieważ technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności NMJ, nie można jej wykorzystać do ustalenia, czy jakakolwiek wada jest związana ze zmianami morfologicznymi czy zmianami biochemicznymi. W przeciwieństwie do tego, zapewnia skuteczny sposób określenia, czy jakiekolwiek zmiany morfologiczne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca w laboratorium autorów była wspierana przez Fondazione Roma i Telethon (grant nr. GGP14066).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System dźwigni dwutrybowych | Aurora Scientific Inc. | Siłownik/przetwornik | 300B |
| Stymulator dwufazowy dużej mocy | Aurora Scientific Inc. | 701B | Stymulator impulsów (nerw) |
| Stymulator dwufazowy o dużej mocy | Aurora Scientific Inc. | 701C | (mięsień) |
| Aparat mięśniowy in vitro | Aurora Scientific Inc. | 800A Przygotowawcza | |
| kąpiel tkankowa | Radnoti | 158400 | |
| Monopolarna elektroda ssąca | A-M Systems | 573000 | z domowym odniesieniem |
| Oscyloskop | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomikroskop | Nikon | SMZ 800 | |
| Oświetlacz zimnego światła | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Płytka akwizycyjna | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Blok złączy | National Instruments | NI 2110 | |
| Komputer osobisty | AMD Phenom II x4 970 | Procesor 3,50 Ghz z oprogramowaniem Windows 7 | |
| LabView 2012 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Wodorowęglan Bufor | Sigma-Aldrich | K4002 | bufor fizjologiczny |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Chlorek wapnia CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | bezwodny, proszek, ≥ 97% |
| Bufor HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥ 99,5% (miareczkowanie) |
| Naczynia 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polistyren |
| Silikon | Sylgard | 184 Silikon | Zestaw elastomerów 0,5 kg. |
| Termostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pompa | Newa Mini | MN 606 | do akwarium |
| Odporność na ciepło Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Wiadro | dowolne 10 litrów | Polipropylen | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Kleszcze | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Nożyczki sprężynowe - ostrza 8 mm | Fine Science Tools | 15024-10 | wycinanie nerwów |
| Ostre nożyczki | Narzędzia naukowe | 14059-11 | usuwanie mięśni |
| Delikatne nożyczki | Wagner | 02.06.32 | zewnętrzna |
| rękojeść skalpela studenckiego #3 | Narzędzia do nauki pięknej | 91003-12 | |
| Ostrza skalpela #10 | Narzędzia do nauki pięknej | 10010-00 | |
| Ostrza skalpela #11 | Narzędzia do nauki pięknej | 10011-00 | |
| drut nylonowy i Oslash; 0,16 mm | dowolna |
Bibliografia
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
