Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Summary

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Abstract

Funkcjonalność połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) odgrywa kluczową rolę podczas badania chorób, w których komunikacja między neuronem ruchowym a mięśniami jest zaburzona, takich jak starzenie się i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Tutaj opisujemy protokół eksperymentalny, który można wykorzystać do pomiaru funkcjonalności NMJ poprzez połączenie dwóch rodzajów stymulacji elektrycznej: bezpośredniej stymulacji błony mięśniowej i stymulacji przez nerw. Porównanie reakcji mięśni na te dwie różne stymulacje może pomóc w zdefiniowaniu, na poziomie funkcjonalnym, potencjalnych zmian w NMJ, które prowadzą do funkcjonalnego pogorszenia stanu mięśni.

Ex vivo preparaty są odpowiednie do dobrze kontrolowanych badań. Tutaj opisujemy intensywny protokół pomiaru kilku parametrów funkcjonalności mięśni i NMJ dla przygotowania nerwu płaszczkowato-kulszowego oraz dla przygotowania nerwu przeponowo-przeponowego. Protokół trwa około 60 minut i jest prowadzony w sposób nieprzerwany za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania, które mierzy właściwości kinetyki drgań, stosunek siły do częstotliwości zarówno dla stymulacji mięśni, jak i nerwów oraz dwa parametry specyficzne dla funkcjonalności NMJ, tj. awarię neurotransmisji i zmęczenie śródtężcowe. Metodologia ta została wykorzystana do wykrycia uszkodzeń w preparatach mięśniowo-nerwowych płaszczkowatych i przeponowych przy użyciu transgenicznej myszy SOD1^G93A, eksperymentalnego modelu ALS, który wszechobecnie wykazuje nadekspresję zmutowanego enzymu przeciwutleniającego dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1).

Introduction

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa chemiczna utworzona przez połączenie między motoryczną płytką końcową włókna mięśniowego a zakończeniem aksonu neuronu ruchowego. Wykazano, że NMJ odgrywa kluczową rolę, gdy komunikacja między mięśniami a nerwami jest upośledzona, jak ma to miejsce w starzeniu się lub stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Ponieważ mięśnie i nerwy komunikują się w sposób dwukierunkowy^1,2, możliwość pomiaru wad NMJ oddzielnie od wad mięśniowych może dostarczyć nowych informacji na temat ich fizjologicznych wzajemnych oddziaływań. Rzeczywiście, ta ocena funkcjonalna może pomóc w oceni....

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Sapienza w Rzymie-Jednostki Histologii i Embriologii Medycznej i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualną wersją włoskiej ustawy o ochronie zwierząt.

1. Konfiguracja eksperymentalna

1. Skonfiguruj system eksperymentalny składający się z 1 siłownika/przetwornika, 2 stymulatorów, 1 aparatu mięśniowego in vitro, 1 kąpieli tkankowej do przygotowywania badań, 1 elektrody ssącej, 1 oscyloskopu cyfrowego, 1 mikroskopu stereoskopowego, 1 oświetlacza zimnego światła, 1 płytki akwizycyjnej, 1 bloku złączy i komputera osobistego.
   UWAGA....

Results

Opisany przez nas protokół dostarcza informacji na temat funkcjonalnego odnerwienia w kilku chorobach nerwowo-mięśniowych lub sarkopenii starzenia. Protokół ten można wykorzystać do określenia, czy (a jeśli tak, to na jakim poziomie) zmiany w mięśniach są spowodowane selektywnymi zmianami zachodzącymi w samym mięśniu lub w przekaźnictwie nerwowo-mięśniowym. Poniższe dane są wynikami wcześniejszych prac naszej grupy¹⁸, przeprowadzonych na transgenicznym mysim modelu.......

Discussion

Opisany powyżej protokół eksperymentalny zapewnia idealny sposób pomiaru i rozróżniania wszelkich zmian funkcjonalnych, które wystąpiły bezpośrednio w mięśniu lub pośrednio na poziomie połączenia nerwowo-mięśniowego. Ponieważ technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności NMJ, nie można jej wykorzystać do ustalenia, czy jakakolwiek wada jest związana ze zmianami morfologicznymi czy zmianami biochemicznymi. W przeciwieństwie do tego, zapewnia skuteczny sposób określenia, czy jakiekolwiek zmiany morfologiczne.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System dźwigni dwutrybowych	Aurora Scientific Inc.	Siłownik/przetwornik	300B
Stymulator dwufazowy dużej mocy	Aurora Scientific Inc.	701B	Stymulator impulsów (nerw)
Stymulator dwufazowy o dużej mocy	Aurora Scientific Inc.	701C	(mięsień)
Aparat mięśniowy in vitro	Aurora Scientific Inc.	800A Przygotowawcza
kąpiel tkankowa	Radnoti	158400
Monopolarna elektroda ssąca	A-M Systems	573000	z domowym odniesieniem
Oscyloskop	Tektronix	TDS2014
Stereomikroskop	Nikon	SMZ 800
Oświetlacz zimnego światła	Photonic Optics	PL 3000
Płytka akwizycyjna	National Instruments	NI PCIe-6353
Blok złączy	National Instruments	NI 2110
Komputer osobisty	AMD Phenom II x4 970		Procesor 3,50 Ghz z oprogramowaniem Windows 7
LabView 2012	National Instruments
Krebs-Ringer Wodorowęglan Bufor	Sigma-Aldrich	K4002	bufor fizjologiczny
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
Chlorek wapnia CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	bezwodny, proszek, ≥ 97%
Bufor HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	≥ 99,5% (miareczkowanie)
Naczynia 60mm x 15mm	Falcon	353004	Polistyren
Silikon	Sylgard	184 Silikon	Zestaw elastomerów  0,5 kg.
Termostat	Dennerle	DigitalDuomat 1200
Pompa	Newa Mini	MN 606	do akwarium
Odporność na ciepło Thermocable	Lucky Reptile	61403-1	50/60Hz 50W
Wiadro	dowolne 10 litrów		Polipropylen
O2 + 5%CO2	siad		Mix gas
#5 Kleszcze	Fine Science Tools	11252-20	2 items
Nożyczki sprężynowe - ostrza 8 mm	Fine Science Tools	15024-10	wycinanie nerwów
Ostre nożyczki	Narzędzia naukowe	14059-11	usuwanie mięśni
Delikatne nożyczki	Wagner	02.06.32	zewnętrzna
rękojeść skalpela studenckiego #3	Narzędzia do nauki pięknej	91003-12
Ostrza skalpela #10	Narzędzia do nauki pięknej	10010-00
Ostrza skalpela #11	Narzędzia do nauki pięknej	10011-00
drut nylonowy i Oslash; 0,16 mm	dowolna