Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa chemiczna utworzona przez połączenie między motoryczną płytką końcową włókna mięśniowego a zakończeniem aksonu neuronu ruchowego. Wykazano, że NMJ odgrywa kluczową rolę, gdy komunikacja między mięśniami a nerwami jest upośledzona, jak ma to miejsce w starzeniu się lub stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Ponieważ mięśnie i nerwy komunikują się w sposób dwukierunkowy^1,2, możliwość pomiaru wad NMJ oddzielnie od wad mięśniowych może dostarczyć nowych informacji na temat ich fizjologicznych wzajemnych oddziaływań. Rzeczywiście, ta ocena funkcjonalna może pomóc w ocenie, czy zmiany morfologiczne lub biochemiczne zmniejszają funkcjonalność sygnalizacji neurotransmisyjnej.

Porównanie reakcji skurczowej mięśni wywołanej przez stymulację nerwów i reakcji tego samego mięśnia wywołanej bezpośrednią stymulacją jego błony zostało zaproponowane jako pośredni pomiar funkcjonalności NMJ. Rzeczywiście, ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację neurotransmisyjną, wszelkie różnice w dwóch reakcjach skurczowych można przypisać zmianom w NMJ. To podejście zostało szeroko zaproponowane dla rats^3,4,5,6,7, a także używane do zbierania informacji o modelach myszy^8,9,10,11,12.

Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę wycinania i testowania dwóch preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. preparatów płaszczkowato-kulszowych i przeponowo-przeponowych. Korzystając z niestandardowego oprogramowania, zaprojektowaliśmy protokół ciągłego testowania, który łączy pomiar kilku parametrów charakteryzujących zarówno NMJ, jak i funkcjonalność mięśni, uzyskując w ten sposób kompleksową ocenę uszkodzenia NMJ oddzielnie od uszkodzenia mięśni. W szczególności protokół mierzy siłę skurczu, kinetykę mięśni, krzywą siła-częstotliwość dla stymulacji bezpośredniej i nerwowej, awarię neurotransmisji¹³ zarówno dla częstotliwości odpalania, jak i tężcowej, oraz zmęczenie śródtężcowe⁷.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Sapienza w Rzymie-Jednostki Histologii i Embriologii Medycznej i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualną wersją włoskiej ustawy o ochronie zwierząt.

1. Konfiguracja eksperymentalna

1. Skonfiguruj system eksperymentalny składający się z 1 siłownika/przetwornika, 2 stymulatorów, 1 aparatu mięśniowego in vitro, 1 kąpieli tkankowej do przygotowywania badań, 1 elektrody ssącej, 1 oscyloskopu cyfrowego, 1 mikroskopu stereoskopowego, 1 oświetlacza zimnego światła, 1 płytki akwizycyjnej, 1 bloku złączy i komputera osobistego.
   UWAGA: W tym przypadku oprogramowanie sterujące zostało zaprogramowane w LabView i zostało zaprojektowane tak, aby zagwarantować wysoką elastyczność, dokładność i powtarzalność stymulacji. Dla każdej stymulacji użytkownik może wybrać szerokość, częstotliwość, czas trwania impulsu i zdecydować, czy jest on dostarczany do błony, czy przez nerw. Użytkownik może również wybrać długość okresu odpoczynku przed każdą stymulacją.

2. Oceny właściwości kurczliwych mięśni płaszczkowatych i przepony NMJ

1. Rozgrzewka systemu
   1. Przygotuj bufor Krebs Ringer¹⁴ i umieść go w kąpieli aparatu montażowego i przygotowawczej kąpieli tkankowej. Umieścić naczynie o średnicy 60 mm przygotowane z 4 ml krzemu w przygotowawczej kąpieli tkankowej.
   2. Włączyć łaźnię z wodą obiegową i ustawić temperaturę na 30 °C dla mięśnia płaszczkowatego i na 27 °C dla mięśnia przepony.
   3. Pozwolić, aby 95% mieszaniny O₂ - 5% CO₂ wpłynęło do obu kąpieli.
   4. Włącz siłownik/przetwornik i dwa stymulatory impulsów i ustaw wartości prądu na 300 mA dla stymulacji błony i na 5 mA dla stymulacji nerwów.
      UWAGA: Wcześniej wykazano, że wartość prądu 300 mA nie wywołuje żadnego znaczącego skurczu gałęzi nerwowych po dodaniu D-tubokuraryny do roztworu¹⁵. Wartość prądu 5 mA odpowiada ilości prądu potrzebnego do stymulacji mięśnia przez nerw bez nakładania się na stymulację błony wywołaną za pomocą roztworu. Ponieważ odległość między elektrodą ssącą a mięśniem zależy od długości nerwu, ta wartość prądu musi być dokładnie dostosowana przed każdym eksperymentem, jak opisano poniżej.
2. Rozwarstwienie płaszczkowatego i przepony
   1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy, aby zminimalizować cierpienie, i natychmiast wytnij mięśnie do testów w następujący sposób.
   2. Przygotowanie, rozwarstwienie i ustawienie mięśnia płaszczkowatego - rwa kulszowa
      1. Rozpyl 70% etanolu na nogę myszy i usuń skórę pokrywającą nogę. Wykonaj nacięcie w górnej części nogi nożyczkami, a następnie mocno pociągnij skórę. Odizoluj ścięgno Achillesa od kości piszczelowej, a następnie przetnij ścięgno Achillesa nożyczkami.
      2. Mocno zaciśnij ścięgno za pomocą kleszczy i delikatnie pociągnij mięsień brzuchaty łydki razem z mięśniem płaszczkowatym. Gdy proksymalne ścięgno mięśnia płaszczkowatego zostanie odsłonięte, przetnij całą łydkę nożyczkami, nadal trzymając ścięgno Achillesa. Natychmiast umieścić próbkę tkanki w przygotowawczej kąpieli tkankowej.
      3. Umieść kąpiel przygotowawczą pod mikroskopem stereoskopowym i przymocuj cielę do silikonowej naczynia za pomocą kołków ze stali nierdzewnej o średnicy 0,20 mm. Za pomocą kleszczy zaciśnij proksymalne ścięgno płaszczkowatego i delikatnie pociągnij je, aby odsłonić unerwienie kulszowe.
      4. Po odsłonięciu unerwienia (Ryc. 1), ostrożnie usuń otaczającą tkankę, aby odsłonić około 5 mm nerwu. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć nerw. Mocno zaciskając płaszczkowaty na ścięgnie bliższym za pomocą kleszczy, pociągnij go ponownie i wytnij, przecinając ścięgno Achillesa nożyczkami.
      5. Przełóż nylonowy drut przez otwór w ramieniu dźwigni siłownika/przetwornika. Stwórz pętlę na końcu drutu i chwyć ścięgno Achillesa, a następnie pociągnij drut do tyłu, aż mięsień dotrze do kąpieli aparatu montażowego. Zacisnąć ścięgno proksymalne w stałym zacisku i zawiązać nylonowy drut wokół ramienia dźwigni. Pozwól mięśniom zrównoważyć się w roztworze.
      6. Określ początkową optymalną długość (L₀).
         1. Najpierw rozciągnij mięsień, aby wstępnie obciążyć go przy 10 mN (ta wartość gwarantuje maksymalną siłę skurczu (na podstawie doświadczenia)). Następnie delikatnie rozciągnij mięsień, aby zmienić napięcie wstępne i stymuluj go serią pojedynczych impulsów. Optymalna długość uzyskuje się, gdy mierzona jest maksymalna siła drgania.
   3. Przygotowanie, rozwarstwienie i ustawienie membrany przeponowej
      1. Spryskaj skórę myszy 70% etanolem. Usuń skórę pokrywającą mięsień przepony, wykonując nacięcie nad mostkiem nożyczkami i mocno pociągając skórę.
      2. Nożyczkami przetnij brzuch poziomo poniżej mostka i delikatnie usuń jelito i narządy za pomocą kleszczy. Użyj grubych nożyczek, aby przeciąć kręgosłup.
      3. Przetnij żebra około 1 cm nad mostkiem i postępuj poziomo. Delikatnie usuń narządy zewnętrzne za pomocą kleszczy i przetnij kręgosłup, aby uzyskać okrągły pierścień żeber zawierający przeponę.
      4. Umyć preparat w naczyniu zawierającym bufor Ringera Krebsa, a następnie umieścić go w naczyniu silikonowym wewnątrz przygotowawczej kąpieli tkankowej, górną stroną skierowaną do góry i mostkiem skierowanym do przodu.
      5. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ostrożnie usuń płuca i pozostałe narządy; nerw przeponowy będzie widoczny po prawej stronie (Ryc. 2A).
      6. Przytnij żebra, aby pozostawić pierścień o długości około 2 mm wzdłuż membrany.
      7. Za pomocą kleszczy przymocuj jeden szpilkę ze stali nierdzewnej o średnicy 0,20 mm do środkowego ścięgna przepony w punkcie odpowiadającym unerwieniu nerwu przeponowego, a drugi szpilkę na żebrach na tej samej osi, aby zidentyfikować interesujący nas pasek przepony.
      8. Zamocuj dwa dodatkowe kołki na środkowym ścięgnie i kolejne dwa kołki na żebrach po obu stronach wybranego paska, aby ułożyć membranę. W razie potrzeby oczyść nerw przeponowy z otaczającej tkanki łącznej za pomocą kleszczy.
      9. Używając zakrzywionego ostrza, przetnij przeponę po obu stronach unerwienia, aby zidentyfikować pasek ścięgnisto-mięsień-żebro, jak pokazano na Rysunek 2B.
      10. Przełóż nylonowy drut przez otwór w ramieniu dźwigni siłownika/przetwornika. Stwórz pętlę na końcu drutu i chwyć ścięgno przed pociągnięciem drutu do tyłu, aż mięsień dotrze do kąpieli aparatu montażowego.
      11. Zacisnąć żebra w stałym zacisku i zawiązać nylonowy drut wokół ramienia dźwigni.
      12. Pozwól mięśniowi zrównoważyć się w roztworze i określ początkową optymalną długość (L0).
          1. Rozciągnij mięsień, aby wstępnie go załadować w czasie 5 mN. Delikatnie rozciągnij mięsień, aby zmienić napięcie wstępne i stymuluj go serią pojedynczych impulsów. Optymalna długość uzyskuje się, gdy mierzona jest maksymalna siła drgania.

Rysunek 1 - Przygotowanie nerwu płaszczkowatego i kulszowego. Nerw płaszczkowaty-kulszowy podczas operacji chirurgicznej do testów funkcjonalnych. Rwa kulszowa jest odsłaniana za pomocą kleszczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2 - Przygotowanie nerwu przeponowo-przeponowego. Na zdjęciu przedstawiono fazę preparacji nerwu przeponowego (A) oraz pasek, który ma być zamontowany do badań funkcjonalnych (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Pomiar właściwości NMJ oddzielnie od kurczliwości mięśni
   1. Ustaw najlepsze natężenie prądu dla stymulacji przez nerw i sprawdź, czy impulsy prądu dostarczane przez elektrodę ssącą nie wywołują skurczu mięśni przez rozprzestrzenianie się prądu w kąpieli.
      1. Umieść elektrodę ssącą w pobliżu mięśnia i wciągnij nerw do środka. Delikatnie zwiększając natężenie prądu (zaczynając od 5 mA), stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów. Optymalna wartość prądu jest określana, gdy siła drgania jest maksymalna.
      2. Wypchnij nerw z elektrody i dostarcz kilka pojedynczych impulsów. Upewnij się, że mięsień nie kurczy się z powodu nakładania się na stymulację błony za pomocą roztworu. Ponownie wciągnij nerwy.
   2. Uruchom program i wybierz plik wejściowy, aby uruchomić żądany protokół testowy.
      UWAGA: Plik wejściowy zawiera wszystkie parametry stymulacji potrzebne do uruchomienia całego protokołu. Chociaż ta sama struktura protokołu jest stosowana dla obu mięśni, parametry stymulacji różnią się w zależności od protokołu, odnosi się do mięśni płaszczkowatych lub przepony.
      1. Stymulacja nerwu płaszczkowatego i kulszowego (patrz Tabela 1)
         1. Do wszystkich stymulacji elektrycznych należy stosować następujące szerokości impulsów: 1,4 ms do stymulacji nerwu kulszowego i 0,1 ms do bezpośredniej stymulacji mięśnia płaszczkowatego. Pełny protokół trwa około 65 minut.
      2. Stymulacja nerwu przeponowego (patrz Tabela 2)
         1. Do wszystkich stymulacji elektrycznych należy stosować następujące szerokości impulsów: 1,8 ms do stymulacji nerwu przeponowego i 0,2 ms do bezpośredniej stymulacji przepony. Pełny protokół trwa około 55 minut.
      3. Na końcu protokołu doświadczalnego zmierz długość i mokrą masę mięśnia za pomocą suwmiarki analogowej o dokładności 0,05 mm i precyzyjnej skali z dokładnością odpowiednio 0,1 mg.
         1. Oblicz pole przekroju poprzecznego (CSA), dzieląc masę mięśniową przez iloczyn optymalnej długości włókien (L_f) i gęstości mięśni szkieletowych ssaków (1,06 mg/mm³)¹⁶,
            UWAGA: L_f uzyskuje się przez pomnożenie L₀ przez stosunek długości włókna do długości mięśnia (0,71 dla mięśnia płaszczkowatego¹⁶ i 1 dla mięśnia przepony¹⁷).

Tabela 1 - Protokół stymulacji nerwu płaszczkowatego i kulszowego. W tabeli wymieniono sekwencję testów, które tworzą kompletny protokół badania preparatów nerwu płaszczkowato-kulszowego.

Tabela 2 - Protokół stymulacji nerwu przeponowo-przeponowego. W tabeli przedstawiono sekwencję testów, które składają się na kompletny protokół badania preparatów nerwu przeponowo-przeponowego.

3. Analiza danych

UWAGA: Na końcu protokołu oblicz wszystkie żądane parametry w następujący sposób.

1. Od stymulacji pojedynczym impulsem
   1. Oblicza siłę drgania (mN; maksymalna siła czynna generowana podczas drgania) i właściwą siłę drgania (mN/mm²). Oblicz to, odejmując początkową wartość napięcia wstępnego od maksymalnej siły generowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę drgania jako siłę drgania podzieloną przez CSA mięśnia.
   2. Oblicz czas do szczytowego napięcia (TTP) (ms) jako czas od zwolnienia impulsu do siły drgania.
   3. Oblicz czas połowy relaksacji (1/2RT) (ms) jako czas od siły drgania do 50% siły drgania.
   4. Oblicz dF/dt (mN/ms) jako maksymalną wartość pochodnej siły w fazie skurczu.
   5. Oblicz -dF/dt (mN/ms) jako maksymalną wartość pochodnej siły podczas fazy relaksacji.
2. Ze stymulacji ciągu pulsacyjnego
   1. Oblicz siłę niestopioną (mN) i siłę właściwą niestopioną (mN/mm²). Oblicz to, odejmując początkową wartość napięcia wstępnego od maksymalnej siły generowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę niestopioną jako siłę niestopioną podzieloną przez mięsień CSA.
      UWAGA: Siła niestopiona to maksymalna siła czynna generowana podczas ciągu impulsów o częstotliwości niższej niż częstotliwość tężcowa.
   2. Oblicz siłę tężcową (mN) i siłę właściwą tężcową (mN/mm2); siła maksymalna to maksymalna siła czynna generowana podczas ciągu impulsów dostarczanych z częstotliwością tężcową. Oblicz to, odejmując początkową wartość napięcia wstępnego od maksymalnej siły generowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę tężcową jako siłę tężcową podzieloną przez CSA mięśnia.
   3. Oblicz krzywą siła-częstotliwość. Wykreśl wartość siły (lub siły właściwej) uzyskaną dla każdej stymulacji w funkcji rosnącej częstotliwości stymulacji. Zazwyczaj zaczyna się od stymulacji pojedynczym impulsem, a kończy na częstotliwości tężcowej.
3. Z paradygmatów zmęczeniowych
   1. Obliczać niewydolność neurotransmisji (NF) jako:
      
      gdzie MF to spadek siły po stymulacji mięśni, a F to spadek siły po stymulacji nerwów, mierzony na pierwszym ciągu impulsów po stymulacji mięśni.
   2. Obliczać zmęczenie śródtężcowe (IF) jako:
      
      gdzie F_lp to siła generowana przez mięsień podczas ostatniego impulsu stymulacji, a F_m to maksymalna siła generowana przez mięsień podczas tego samego ciągu impulsów. Jeśli chodzi o stymulację nerwów, oblicz zmęczenie śródtężcowe w pierwszym ciągu impulsów natychmiast po bezpośredniej stymulacji.

4. Analiza statystyczna

UWAGA: Modele analizy statystycznej muszą być wybrane w zależności od tego, czy reakcja mięśni na stymulację nerwów i błon jest porównywana w obrębie tego samego modelu zwierzęcego, czy między 2 różnymi modelami zwierzęcymi^18,19.

1. Użyj testu t Studenta dla TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt, jeśli porównujesz tylko reakcje mięśni na stymulacje bezpośrednie i pośrednie. Porównując preparaty mięśniowe uzyskane z 2 różnych szczepów myszy, użyj 2-way ANOVA z typem stymulacji i szczepem myszy jako stałymi czynnikami. Gdy dwukierunkowa ANOVA zwróci istotny wynik, użyj wielu testów porównawczych, aby wyszukać różnice statystyczne.
2. Dla krzywej siła-częstotliwość (jeśli porównuje się tylko reakcje mięśni na stymulacje bezpośrednie i pośrednie), użyj 2-kierunkowej ANOVA z typem stymulacji i częstotliwością stymulacji jako stałymi czynnikami. W razie potrzeby użyj wielu testów porównawczych.
   1. Porównując preparaty mięśniowe uzyskane z 2 różnych szczepów myszy, użyj 3-way ANOVA z typem stymulacji, częstotliwością stymulacji i szczepem myszy jako stałymi czynnikami.
      1. Gdy 3-kierunkowa ANOVA daje znaczący wpływ czynników szczepu zwierzęcia i rodzaju stymulacji, użyj 2-kierunkowej ANOVA, aby zidentyfikować znaczące różnice między 2 grupami jednocześnie. Na przykład można ocenić różnice między reakcją mięśni 2 grup na stymulację błonową lub między reakcją mięśni na stymulacje bezpośrednie i pośrednie w jednej grupie.
3. Zmęczenie śródtężcowe
   UWAGA: Ponieważ protokół został zaprojektowany tak, aby wywoływać zmęczenie w odpowiedzi na stymulację nerwów nawet u myszy kontrolnych, parametr ten może być używany tylko do badania różnic między 2 szczepami myszy, a analiza statystyczna w jednej grupie zawsze przyniesie znaczące różnice.
   1. Aby porównać dwie grupy, użyj 3-kierunkowej ANOVA z typem stymulacji, czasem i obciążeniem myszy jako stałymi czynnikami. Gdy 3-kierunkowa ANOVA daje znaczący wpływ czynników szczepu zwierzęcia i rodzaju stymulacji, użyj dwukierunkowej ANOVA, aby zidentyfikować znaczące różnice między 2 grupami jednocześnie, jeśli chodzi o krzywą siła-częstotliwość.
4. W przypadku niewydolności neurotransmisji należy użyć 2-kierunkowej ANOVA ze szczepem zwierzęcym i czasem jako stałymi czynnikami. Jeśli zwraca znaczące wyniki, użyj wielu testów porównawczych, aby wyszukać różnice statystyczne.
   UWAGA: Ponieważ ten parametr zwraca tylko jedną wartość dla każdego szczepu myszy, umożliwia porównywanie różnych modeli myszy.
5. W przypadku masy mięśniowej, długości i CSA użyj testu t Studenta, aby zbadać różnice podczas porównywania preparatów mięśniowo-nerwowych z różnych modeli zwierzęcych.

Opisany przez nas protokół dostarcza informacji na temat funkcjonalnego odnerwienia w kilku chorobach nerwowo-mięśniowych lub sarkopenii starzenia. Protokół ten można wykorzystać do określenia, czy (a jeśli tak, to na jakim poziomie) zmiany w mięśniach są spowodowane selektywnymi zmianami zachodzącymi w samym mięśniu lub w przekaźnictwie nerwowo-mięśniowym. Poniższe dane są wynikami wcześniejszych prac naszej grupy18, przeprowadzonych na transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego SOD1G93A w końcowym stadium choroby20. Transgeniczna mysz SOD1G93A wszechobecnie wykazuje nadekspresję zmutowanego enzymu przeciwutleniającego dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1). Ryciny 3 i 4 pokazują wartości dF/dt i siły tężcowej dla preparatów nerwu płaszczkowato-kulszowego (po lewej) i dla preparatów nerwu przeponowo-przeponowego (po prawej). Wyniki te pokazują zdolność proponowanej tutaj techniki do wykrywania funkcjonalnych defektów w mięśniach transgenicznych, które są związane z NMJ, w przeciwieństwie do tych ściśle związanych z samym mięśniem. Rzeczywiście, zarówno w przypadku siły dF/dt, jak i tężcowej, mięśnie płaszczkowate SOD1G93A wykazywały zmniejszoną reakcję skurczową w porównaniu z mięśniem kontrolnym, gdy były stymulowane bezpośrednio, i wykazywały dalszą redukcję, gdy były stymulowane przez nerw. W przeciwieństwie do tego, łagodne zmiany zaobserwowano w tych dwóch parametrach, gdy paski mięśni przepony były stymulowane przez błonę, podczas gdy znaczące zmiany wykryto, gdy mięsień przepony był stymulowany przez nerw.

Rysunek 3 - Kinetyka kurczliwości. Średnia ± SEM dF/dt dla preparatów mięśniowatego płaszczkowatego (A) i diafragmy (B). Próbki płaszczkowate wykazywały znaczne spowolnienie przy bezpośredniej stymulacji (-27%) i dalszy spadek po stymulacji przez nerw (-58%). Próbki przepony wykazywały spowolnienie tylko wtedy, gdy były stymulowane przez nerw (-30%). Na podstawie Rizzuto et al. 18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4 - Siła tężcowa. Średnia ± SEM tężcowej siły właściwej dla preparatów płaszczkowatego (A) i membrany (B). Próbki płaszczkowate wykazywały znaczne spowolnienie przy bezpośredniej stymulacji (-26%) i dalszy spadek po stymulacji przez nerw (-50%). Próbki przepony wykazywały zmniejszenie siły tylko wtedy, gdy były stymulowane przez nerw (-44%). Na podstawie Rizzuto et al. 18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ocena zmęczenia śródtężcowego i niewydolności neurotransmisji pozwoliła na zmierzenie parametrów specyficznych dla NMJ. Rysunek 5 pokazuje średnie wartości zmęczenia śródtężcowego (IF) mierzone podczas paradygmatu zmęczenia tężcowego dla mięśni płaszczkowatych (Rysunek 5A) i pasków przepony (Rysunek 5B). Jak podano w sekcji Protokół, zastosowany przez nas paradygmat zmęczenia został opracowany w taki sposób, aby obciążać NMJ, ale nie mięsień. W rezultacie, IF mierzony dla bezpośredniej stymulacji mięśni nigdy nie został zmieniony. Rzeczywiście, IF obliczony dla stymulacji nerwów jest parametrem, który należy wziąć pod uwagę przy porównaniach między różnymi szczepami myszy. Nasze wyniki pokazują, że IF był znacznie niższy zarówno w transgenicznych mięśniach płaszczkowatych, jak i przeponowych niż w odpowiednikach kontrolnych. Różnica ta była większa w przeponie, w której wykryto niewielki ubytek mięśniowy, a mniejsza w płaszczkowatej, w której zmierzono już znaczne uszkodzenie mięśni. Należy pamiętać, że ponieważ transgeniczny mięsień płaszczkowaty został znacznie uszkodzony, ocena NMJ była prawidłowa tylko dla maksymalnie 8 minut stymulacji, czyli czasu potrzebnego mięśniom transgenicznym na zwrócenie zerowej wartości siły podczas stymulacji. Wartości IF mięśnia płaszczkowatego transgenicznego po 8 minutach stymulacji w zasadzie wyrażają hałas.

Rysunek 5 - Zmęczenie śródtężcowe. Śródtężcowe zmęczenie mięśni płaszczkowatych (A) i przepony (B) wykazało znaczny spadek transgenicznej funkcjonalności NMJ. Wartości są średnie ± SEM. Na podstawie Rizzuto et al. 18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6 pokazuje awarię neurotransmisji przy częstotliwości tężcowej mierzonej w próbkach płaszczkowatego (Rysunek 6A) i przepony (Rysunek 6B). Zgodnie z wynikami IF, nie stwierdzono defektu przekaźnictwa nerwowego w mięśniu płaszczkowatym, podczas gdy próbki mięśni przepony wykazywały znaczny wzrost męczliwości połączeń nerwowo-mięśniowych.

Rysunek 6 - Awaria neurotransmisji. Niewydolność neuroprzekaźnictwa nie wykazywała żadnych zmian w mięśniach płaszczkowatych (A), natomiast podkreślała znaczny spadek funkcjonalności NMJ w transgenicznych paskach przepony (B). Wartości są średnie ± SEM. Na podstawie Rizzuto et al. 18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.