Artykuł metodologiczny

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

DOI:

10.3791/55227

⸱

6 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalność połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) odgrywa kluczową rolę podczas badania chorób, w których komunikacja między neuronem ruchowym a mięśniami jest zaburzona, takich jak starzenie się i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Tutaj opisujemy protokół eksperymentalny, który można wykorzystać do pomiaru funkcjonalności NMJ poprzez połączenie dwóch rodzajów stymulacji elektrycznej: bezpośredniej stymulacji błony mięśniowej i stymulacji przez nerw. Porównanie reakcji mięśni na te dwie różne stymulacje może pomóc w zdefiniowaniu, na poziomie funkcjonalnym, potencjalnych zmian w NMJ, które prowadzą do funkcjonalnego pogorszenia stanu mięśni.

Ex vivo preparaty są odpowiednie do dobrze kontrolowanych badań. Tutaj opisujemy intensywny protokół pomiaru kilku parametrów funkcjonalności mięśni i NMJ dla przygotowania nerwu płaszczkowato-kulszowego oraz dla przygotowania nerwu przeponowo-przeponowego. Protokół trwa około 60 minut i jest prowadzony w sposób nieprzerwany za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania, które mierzy właściwości kinetyki drgań, stosunek siły do częstotliwości zarówno dla stymulacji mięśni, jak i nerwów oraz dwa parametry specyficzne dla funkcjonalności NMJ, tj. awarię neurotransmisji i zmęczenie śródtężcowe. Metodologia ta została wykorzystana do wykrycia uszkodzeń w preparatach mięśniowo-nerwowych płaszczkowatych i przeponowych przy użyciu transgenicznej myszy SOD1G93A, eksperymentalnego modelu ALS, który wszechobecnie wykazuje nadekspresję zmutowanego enzymu przeciwutleniającego dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa chemiczna utworzona przez połączenie między motoryczną płytką końcową włókna mięśniowego a zakończeniem aksonu neuronu ruchowego. Wykazano, że NMJ odgrywa kluczową rolę, gdy komunikacja między mięśniami a nerwami jest upośledzona, jak ma to miejsce w starzeniu się lub stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS). Ponieważ mięśnie i nerwy komunikują się w sposób dwukierunkowy1,2, możliwość pomiaru wad NMJ oddzielnie od wad mięśniowych może dostarczyć nowych informacji na temat ich fizjologicznych wzajemnych oddziaływań. Rzeczywiście, ta ocena funkcjonalna może pomóc w ocenie, czy zmiany morfologiczne lub biochemiczne zmniejszają funkcjonalność sygnalizacji neurotransmisyjnej.

Porównanie reakcji skurczowej mięśni wywołanej przez stymulację nerwów i reakcji tego samego mięśnia wywołanej bezpośrednią stymulacją jego błony zostało zaproponowane jako pośredni pomiar funkcjonalności NMJ. Rzeczywiście, ponieważ stymulacja błony omija sygnalizację neurotransmisyjną, wszelkie różnice w dwóch reakcjach skurczowych można przypisać zmianom w NMJ. To podejście zostało szeroko zaproponowane dla rats3,4,5,6,7, a także używane do zbierania informacji o modelach myszy8,9,10,11,12.

Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę wycinania i testowania dwóch preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. preparatów płaszczkowato-kulszowych i przeponowo-przeponowych. Korzystając z niestandardowego oprogramowania, zaprojektowaliśmy protokół ciągłego testowania, który łączy pomiar kilku parametrów charakteryzujących zarówno NMJ, jak i funkcjonalność mięśni, uzyskując w ten sposób kompleksową ocenę uszkodzenia NMJ oddzielnie od uszkodzenia mięśni. W szczególności protokół mierzy siłę skurczu, kinetykę mięśni, krzywą siła-częstotliwość dla stymulacji bezpośredniej i nerwowej, awarię neurotransmisji13 zarówno dla częstotliwości odpalania, jak i tężcowej, oraz zmęczenie śródtężcowe7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Sapienza w Rzymie-Jednostki Histologii i Embriologii Medycznej i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualną wersją włoskiej ustawy o ochronie zwierząt.

1. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Skonfiguruj system eksperymentalny składający się z 1 siłownika/przetwornika, 2 stymulatorów, 1 aparatu mięśniowego in vitro, 1 kąpieli tkankowej do przygotowywania badań, 1 elektrody ssącej, 1 oscyloskopu cyfrowego, 1 mikroskopu stereoskopowego, 1 oświetlacza zimnego światła, 1 płytki akwizycyjnej, 1 bloku złączy i komputera osobistego.
    UWAGA: W tym przypadku oprogramowanie sterujące zostało zaprogramowane w LabView i zostało zaprojektowane tak, aby zagwarantować wysoką elastyczność, dokładność i powtarzalność stymulacji. Dla każdej stymulacji użytkownik może wybrać szerokość, częstotliwość, czas trwania impulsu i zdecydować, czy jest on dostarczany do błony, czy przez nerw. Użytkownik może również wybrać długość okresu odpoczynku przed każdą stymulacją.

2. Oceny właściwości kurczliwych mięśni płaszczkowatych i przepony NMJ

  1. Rozgrzewka systemu
    1. Przygotuj bufor Krebs Ringer14 i umieść go w kąpieli aparatu montażowego i przygotowawczej kąpieli tkankowej. Umieścić naczynie o średnicy 60 mm przygotowane z 4 ml krzemu w przygotowawczej kąpieli tkankowej.
    2. Włączyć łaźnię z wodą obiegową i ustawić temperaturę na 30 °C dla mięśnia płaszczkowatego i na 27 °C dla mięśnia przepony.
    3. Pozwolić, aby 95% mieszaniny O2 - 5% CO2 wpłynęło do obu kąpieli.
    4. Włącz siłownik/przetwornik i dwa stymulatory impulsów i ustaw wartości prądu na 300 mA dla stymulacji błony i na 5 mA dla stymulacji nerwów.
      UWAGA: Wcześniej wykazano, że wartość prądu 300 mA nie wywołuje żadnego znaczącego skurczu gałęzi nerwowych po dodaniu D-tubokuraryny do roztworu15. Wartość prądu 5 mA odpowiada ilości prądu potrzebnego do stymulacji mięśnia przez nerw bez nakładania się na stymulację błony wywołaną za pomocą roztworu. Ponieważ odległość między elektrodą ssącą a mięśniem zależy od długości nerwu, ta wartość prądu musi być dokładnie dostosowana przed każdym eksperymentem, jak opisano poniżej.
  2. Rozwarstwienie płaszczkowatego i przepony
    1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy, aby zminimalizować cierpienie, i natychmiast wytnij mięśnie do testów w następujący sposób.
    2. Przygotowanie, rozwarstwienie i ustawienie mięśnia płaszczkowatego - rwa kulszowa
      1. Rozpyl 70% etanolu na nogę myszy i usuń skórę pokrywającą nogę. Wykonaj nacięcie w górnej części nogi nożyczkami, a następnie mocno pociągnij skórę. Odizoluj ścięgno Achillesa od kości piszczelowej, a następnie przetnij ścięgno Achillesa nożyczkami.
      2. Mocno zaciśnij ścięgno za pomocą kleszczy i delikatnie pociągnij mięsień brzuchaty łydki razem z mięśniem płaszczkowatym. Gdy proksymalne ścięgno mięśnia płaszczkowatego zostanie odsłonięte, przetnij całą łydkę nożyczkami, nadal trzymając ścięgno Achillesa. Natychmiast umieścić próbkę tkanki w przygotowawczej kąpieli tkankowej.
      3. Umieść kąpiel przygotowawczą pod mikroskopem stereoskopowym i przymocuj cielę do silikonowej naczynia za pomocą kołków ze stali nierdzewnej o średnicy 0,20 mm. Za pomocą kleszczy zaciśnij proksymalne ścięgno płaszczkowatego i delikatnie pociągnij je, aby odsłonić unerwienie kulszowe.
      4. Po odsłonięciu unerwienia (Ryc. 1), ostrożnie usuń otaczającą tkankę, aby odsłonić około 5 mm nerwu. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć nerw. Mocno zaciskając płaszczkowaty na ścięgnie bliższym za pomocą kleszczy, pociągnij go ponownie i wytnij, przecinając ścięgno Achillesa nożyczkami.
      5. Przełóż nylonowy drut przez otwór w ramieniu dźwigni siłownika/przetwornika. Stwórz pętlę na końcu drutu i chwyć ścięgno Achillesa, a następnie pociągnij drut do tyłu, aż mięsień dotrze do kąpieli aparatu montażowego. Zacisnąć ścięgno proksymalne w stałym zacisku i zawiązać nylonowy drut wokół ramienia dźwigni. Pozwól mięśniom zrównoważyć się w roztworze.
      6. Określ początkową optymalną długość (L0).
        1. Najpierw rozciągnij mięsień, aby wstępnie obciążyć go przy 10 mN (ta wartość gwarantuje maksymalną siłę skurczu (na podstawie doświadczenia)). Następnie delikatnie rozciągnij mięsień, aby zmienić napięcie wstępne i stymuluj go serią pojedynczych impulsów. Optymalna długość uzyskuje się, gdy mierzona jest maksymalna siła drgania.
    3. Przygotowanie, rozwarstwienie i ustawienie membrany przeponowej
      1. Spryskaj skórę myszy 70% etanolem. Usuń skórę pokrywającą mięsień przepony, wykonując nacięcie nad mostkiem nożyczkami i mocno pociągając skórę.
      2. Nożyczkami przetnij brzuch poziomo poniżej mostka i delikatnie usuń jelito i narządy za pomocą kleszczy. Użyj grubych nożyczek, aby przeciąć kręgosłup.
      3. Przetnij żebra około 1 cm nad mostkiem i postępuj poziomo. Delikatnie usuń narządy zewnętrzne za pomocą kleszczy i przetnij kręgosłup, aby uzyskać okrągły pierścień żeber zawierający przeponę.
      4. Umyć preparat w naczyniu zawierającym bufor Ringera Krebsa, a następnie umieścić go w naczyniu silikonowym wewnątrz przygotowawczej kąpieli tkankowej, górną stroną skierowaną do góry i mostkiem skierowanym do przodu.
      5. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ostrożnie usuń płuca i pozostałe narządy; nerw przeponowy będzie widoczny po prawej stronie (Ryc. 2A).
      6. Przytnij żebra, aby pozostawić pierścień o długości około 2 mm wzdłuż membrany.
      7. Za pomocą kleszczy przymocuj jeden szpilkę ze stali nierdzewnej o średnicy 0,20 mm do środkowego ścięgna przepony w punkcie odpowiadającym unerwieniu nerwu przeponowego, a drugi szpilkę na żebrach na tej samej osi, aby zidentyfikować interesujący nas pasek przepony.
      8. Zamocuj dwa dodatkowe kołki na środkowym ścięgnie i kolejne dwa kołki na żebrach po obu stronach wybranego paska, aby ułożyć membranę. W razie potrzeby oczyść nerw przeponowy z otaczającej tkanki łącznej za pomocą kleszczy.
      9. Używając zakrzywionego ostrza, przetnij przeponę po obu stronach unerwienia, aby zidentyfikować pasek ścięgnisto-mięsień-żebro, jak pokazano na Rysunek 2B.
      10. Przełóż nylonowy drut przez otwór w ramieniu dźwigni siłownika/przetwornika. Stwórz pętlę na końcu drutu i chwyć ścięgno przed pociągnięciem drutu do tyłu, aż mięsień dotrze do kąpieli aparatu montażowego.
      11. Zacisnąć żebra w stałym zacisku i zawiązać nylonowy drut wokół ramienia dźwigni.
      12. Pozwól mięśniowi zrównoważyć się w roztworze i określ początkową optymalną długość (L0).
        1. Rozciągnij mięsień, aby wstępnie go załadować w czasie 5 mN. Delikatnie rozciągnij mięsień, aby zmienić napięcie wstępne i stymuluj go serią pojedynczych impulsów. Optymalna długość uzyskuje się, gdy mierzona jest maksymalna siła drgania.

figure-protocol-1
Rysunek 1 - Przygotowanie nerwu płaszczkowatego i kulszowego. Nerw płaszczkowaty-kulszowy podczas operacji chirurgicznej do testów funkcjonalnych. Rwa kulszowa jest odsłaniana za pomocą kleszczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2 - Przygotowanie nerwu przeponowo-przeponowego. Na zdjęciu przedstawiono fazę preparacji nerwu przeponowego (A) oraz pasek, który ma być zamontowany do badań funkcjonalnych (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pomiar właściwości NMJ oddzielnie od kurczliwości mięśni
    1. Ustaw najlepsze natężenie prądu dla stymulacji przez nerw i sprawdź, czy impulsy prądu dostarczane przez elektrodę ssącą nie wywołują skurczu mięśni przez rozprzestrzenianie się prądu w kąpieli.
      1. Umieść elektrodę ssącą w pobliżu mięśnia i wciągnij nerw do środka. Delikatnie zwiększając natężenie prądu (zaczynając od 5 mA), stymuluj mięsień serią pojedynczych impulsów. Optymalna wartość prądu jest określana, gdy siła drgania jest maksymalna.
      2. Wypchnij nerw z elektrody i dostarcz kilka pojedynczych impulsów. Upewnij się, że mięsień nie kurczy się z powodu nakładania się na stymulację błony za pomocą roztworu. Ponownie wciągnij nerwy.
    2. Uruchom program i wybierz plik wejściowy, aby uruchomić żądany protokół testowy.
      UWAGA: Plik wejściowy zawiera wszystkie parametry stymulacji potrzebne do uruchomienia całego protokołu. Chociaż ta sama struktura protokołu jest stosowana dla obu mięśni, parametry stymulacji różnią się w zależności od protokołu, odnosi się do mięśni płaszczkowatych lub przepony.
      1. Stymulacja nerwu płaszczkowatego i kulszowego (patrz Tabela 1)
        1. Do wszystkich stymulacji elektrycznych należy stosować następujące szerokości impulsów: 1,4 ms do stymulacji nerwu kulszowego i 0,1 ms do bezpośredniej stymulacji mięśnia płaszczkowatego. Pełny protokół trwa około 65 minut.
      2. Stymulacja nerwu przeponowego (patrz Tabela 2)
        1. Do wszystkich stymulacji elektrycznych należy stosować następujące szerokości impulsów: 1,8 ms do stymulacji nerwu przeponowego i 0,2 ms do bezpośredniej stymulacji przepony. Pełny protokół trwa około 55 minut.
      3. Na końcu protokołu doświadczalnego zmierz długość i mokrą masę mięśnia za pomocą suwmiarki analogowej o dokładności 0,05 mm i precyzyjnej skali z dokładnością odpowiednio 0,1 mg.
        1. Oblicz pole przekroju poprzecznego (CSA), dzieląc masę mięśniową przez iloczyn optymalnej długości włókien (Lf) i gęstości mięśni szkieletowych ssaków (1,06 mg/mm3)16,
          UWAGA: Lf uzyskuje się przez pomnożenie L0 przez stosunek długości włókna do długości mięśnia (0,71 dla mięśnia płaszczkowatego16 i 1 dla mięśnia przepony17).
szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. Rozdział szt.
Rodzaj eksperymentuczęstotliwośćczas trwaniaPowtórzeńStymulacja mięśni lub nerwówcel
(Hz)(s)
TwitchPojedynczy impuls1mięsieńSiła drgań i kinetyka
odpoczynekRozdział 30
TwitchPojedynczy impuls1nerw
odpoczynekRozdział 30
TwitchPojedynczy impuls1mięsień
odpoczynekRozdział 30
TwitchPojedynczy impuls1nerw
odpoczynek120
Tężec niezrośniętyRozdział 400,81nerwKrzywe siły/częstotliwości dla stymulacji nerwów i mięśni
odpoczynek180
Tężec niezrośnięty600,81mięsień
odpoczynek180
Tężec zrośniętyRozdział 800,81nerw
odpoczynek180
Tężec niezrośnięty200,81mięsień
odpoczynek180
Tężec niezrośnięty600,81nerw
odpoczynek180
Tężec zrośniętyRozdział 800,81mięsień
odpoczynek180
Tężec niezrośnięty200,81nerw
odpoczynek180
Tężec niezrośniętyRozdział 400,81mięsień
odpoczynek300
Paradygmat zmęczenia350,81 stymulacja mięśni, a następnie 14 stymulacji nerwów z czasem odpoczynku 1,2 s każda, powtórzone 20 razyNiewydolność neuroprzekaźnictwa (NF)
odpoczynek900
Paradygmat zmęczeniaRozdział 800,81 stymulacja mięśni, a następnie 14 stymulacji nerwów z czasem odpoczynku 1,2 s każda, powtórzone 20 razyNiewydolność neuroprzekaźnictwa (NF) i zmęczenie śródtężcowe (IF)

Tabela 1 - Protokół stymulacji nerwu płaszczkowatego i kulszowego. W tabeli wymieniono sekwencję testów, które tworzą kompletny protokół badania preparatów nerwu płaszczkowato-kulszowego.

szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt. Rozdział pkt. szt. pkt.
Rodzaj eksperymentuczęstotliwośćczas trwaniaPowtórzeńStymulacja mięśni lub nerwówcel
(Hz)(s)
TwitchPojedynczy impuls1mięsieńSiła drgań i kinetyka
odpoczynekRozdział 30
TwitchPojedynczy impuls1nerw
odpoczynekRozdział 30
TwitchPojedynczy impuls1mięsień
odpoczynekRozdział 30
TwitchPojedynczy impuls1nerw
odpoczynek120
Tężec niezrośnięty600,51nerwKrzywe siły/częstotliwości dla stymulacji nerwów i mięśni
odpoczynek120
Tężec zrośnięty1000,51mięsień
odpoczynek180
Tężec niezrośniętyRozdział 400,51nerw
odpoczynek120
Tężec niezrośnięty200,51mięsień
odpoczynek120
Tężec niezrośniętyRozdział 800,51nerw
odpoczynek150
Tężec niezrośniętyRozdział 800,51mięsień
odpoczynek150
Tężec niezrośnięty200,51nerw
odpoczynek120
Tężec zrośnięty1000,51mięsień
odpoczynek150
Tężec zrośnięty1000,51nerw
odpoczynek180
Tężec niezrośnięty600,51mięsień
odpoczynek300
Paradygmat zmęczenia350,331 stymulacja mięśni, a następnie 14 stymulacji nerwów z czasem odpoczynku 0,67 s każda, powtórzone 20 razyNiewydolność neuroprzekaźnictwa (NF)
odpoczynek900
Paradygmat zmęczeniaRozdział 800,331 stymulacja mięśni, a następnie 14 stymulacji nerwów z czasem odpoczynku 0,67 s każda, powtórzone 20 razyNiewydolność neuroprzekaźnictwa (NF) i zmęczenie śródtężcowe (IF)

Tabela 2 - Protokół stymulacji nerwu przeponowo-przeponowego. W tabeli przedstawiono sekwencję testów, które składają się na kompletny protokół badania preparatów nerwu przeponowo-przeponowego.

3. Analiza danych

UWAGA: Na końcu protokołu oblicz wszystkie żądane parametry w następujący sposób.

  1. Od stymulacji pojedynczym impulsem
    1. Oblicza siłę drgania (mN; maksymalna siła czynna generowana podczas drgania) i właściwą siłę drgania (mN/mm2). Oblicz to, odejmując początkową wartość napięcia wstępnego od maksymalnej siły generowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę drgania jako siłę drgania podzieloną przez CSA mięśnia.
    2. Oblicz czas do szczytowego napięcia (TTP) (ms) jako czas od zwolnienia impulsu do siły drgania.
    3. Oblicz czas połowy relaksacji (1/2RT) (ms) jako czas od siły drgania do 50% siły drgania.
    4. Oblicz dF/dt (mN/ms) jako maksymalną wartość pochodnej siły w fazie skurczu.
    5. Oblicz -dF/dt (mN/ms) jako maksymalną wartość pochodnej siły podczas fazy relaksacji.
  2. Ze stymulacji ciągu pulsacyjnego
    1. Oblicz siłę niestopioną (mN) i siłę właściwą niestopioną (mN/mm2). Oblicz to, odejmując początkową wartość napięcia wstępnego od maksymalnej siły generowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę niestopioną jako siłę niestopioną podzieloną przez mięsień CSA.
      UWAGA: Siła niestopiona to maksymalna siła czynna generowana podczas ciągu impulsów o częstotliwości niższej niż częstotliwość tężcowa.
    2. Oblicz siłę tężcową (mN) i siłę właściwą tężcową (mN/mm2); siła maksymalna to maksymalna siła czynna generowana podczas ciągu impulsów dostarczanych z częstotliwością tężcową. Oblicz to, odejmując początkową wartość napięcia wstępnego od maksymalnej siły generowanej przez mięsień. Oblicz właściwą siłę tężcową jako siłę tężcową podzieloną przez CSA mięśnia.
    3. Oblicz krzywą siła-częstotliwość. Wykreśl wartość siły (lub siły właściwej) uzyskaną dla każdej stymulacji w funkcji rosnącej częstotliwości stymulacji. Zazwyczaj zaczyna się od stymulacji pojedynczym impulsem, a kończy na częstotliwości tężcowej.
  3. Z paradygmatów zmęczeniowych
    1. Obliczać niewydolność neurotransmisji (NF) jako:
      figure-protocol-3
      gdzie MF to spadek siły po stymulacji mięśni, a F to spadek siły po stymulacji nerwów, mierzony na pierwszym ciągu impulsów po stymulacji mięśni.
    2. Obliczać zmęczenie śródtężcowe (IF) jako:
      figure-protocol-4
      gdzie Flp to siła generowana przez mięsień podczas ostatniego impulsu stymulacji, a Fm to maksymalna siła generowana przez mięsień podczas tego samego ciągu impulsów. Jeśli chodzi o stymulację nerwów, oblicz zmęczenie śródtężcowe w pierwszym ciągu impulsów natychmiast po bezpośredniej stymulacji.

4. Analiza statystyczna

UWAGA: Modele analizy statystycznej muszą być wybrane w zależności od tego, czy reakcja mięśni na stymulację nerwów i błon jest porównywana w obrębie tego samego modelu zwierzęcego, czy między 2 różnymi modelami zwierzęcymi18,19.

  1. Użyj testu t Studenta dla TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt, jeśli porównujesz tylko reakcje mięśni na stymulacje bezpośrednie i pośrednie. Porównując preparaty mięśniowe uzyskane z 2 różnych szczepów myszy, użyj 2-way ANOVA z typem stymulacji i szczepem myszy jako stałymi czynnikami. Gdy dwukierunkowa ANOVA zwróci istotny wynik, użyj wielu testów porównawczych, aby wyszukać różnice statystyczne.
  2. Dla krzywej siła-częstotliwość (jeśli porównuje się tylko reakcje mięśni na stymulacje bezpośrednie i pośrednie), użyj 2-kierunkowej ANOVA z typem stymulacji i częstotliwością stymulacji jako stałymi czynnikami. W razie potrzeby użyj wielu testów porównawczych.
    1. Porównując preparaty mięśniowe uzyskane z 2 różnych szczepów myszy, użyj 3-way ANOVA z typem stymulacji, częstotliwością stymulacji i szczepem myszy jako stałymi czynnikami.
      1. Gdy 3-kierunkowa ANOVA daje znaczący wpływ czynników szczepu zwierzęcia i rodzaju stymulacji, użyj 2-kierunkowej ANOVA, aby zidentyfikować znaczące różnice między 2 grupami jednocześnie. Na przykład można ocenić różnice między reakcją mięśni 2 grup na stymulację błonową lub między reakcją mięśni na stymulacje bezpośrednie i pośrednie w jednej grupie.
  3. Zmęczenie śródtężcowe
    UWAGA: Ponieważ protokół został zaprojektowany tak, aby wywoływać zmęczenie w odpowiedzi na stymulację nerwów nawet u myszy kontrolnych, parametr ten może być używany tylko do badania różnic między 2 szczepami myszy, a analiza statystyczna w jednej grupie zawsze przyniesie znaczące różnice.
    1. Aby porównać dwie grupy, użyj 3-kierunkowej ANOVA z typem stymulacji, czasem i obciążeniem myszy jako stałymi czynnikami. Gdy 3-kierunkowa ANOVA daje znaczący wpływ czynników szczepu zwierzęcia i rodzaju stymulacji, użyj dwukierunkowej ANOVA, aby zidentyfikować znaczące różnice między 2 grupami jednocześnie, jeśli chodzi o krzywą siła-częstotliwość.
  4. W przypadku niewydolności neurotransmisji należy użyć 2-kierunkowej ANOVA ze szczepem zwierzęcym i czasem jako stałymi czynnikami. Jeśli zwraca znaczące wyniki, użyj wielu testów porównawczych, aby wyszukać różnice statystyczne.
    UWAGA: Ponieważ ten parametr zwraca tylko jedną wartość dla każdego szczepu myszy, umożliwia porównywanie różnych modeli myszy.
  5. W przypadku masy mięśniowej, długości i CSA użyj testu t Studenta, aby zbadać różnice podczas porównywania preparatów mięśniowo-nerwowych z różnych modeli zwierzęcych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany przez nas protokół dostarcza informacji na temat funkcjonalnego odnerwienia w kilku chorobach nerwowo-mięśniowych lub sarkopenii starzenia. Protokół ten można wykorzystać do określenia, czy (a jeśli tak, to na jakim poziomie) zmiany w mięśniach są spowodowane selektywnymi zmianami zachodzącymi w samym mięśniu lub w przekaźnictwie nerwowo-mięśniowym. Poniższe dane są wynikami wcześniejszych prac naszej grupy18, przeprowadzonych na transgenicznym mysim modelu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół eksperymentalny zapewnia idealny sposób pomiaru i rozróżniania wszelkich zmian funkcjonalnych, które wystąpiły bezpośrednio w mięśniu lub pośrednio na poziomie połączenia nerwowo-mięśniowego. Ponieważ technika ta opiera się na pośrednim pomiarze funkcjonalności NMJ, nie można jej wykorzystać do ustalenia, czy jakakolwiek wada jest związana ze zmianami morfologicznymi czy zmianami biochemicznymi. W przeciwieństwie do tego, zapewnia skuteczny sposób określenia, czy jakiekolwiek zmiany morfologiczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium autorów była wspierana przez Fondazione Roma i Telethon (grant nr. GGP14066).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System dźwigni dwutrybowych Aurora Scientific Inc.Siłownik/przetwornik300B
Stymulator dwufazowy dużej mocy Aurora Scientific Inc.701BStymulator impulsów (nerw)
Stymulator dwufazowy o dużej mocy Aurora Scientific Inc.701C(mięsień)
Aparat mięśniowy in vitro Aurora Scientific Inc.800A Przygotowawcza
kąpiel tkankowaRadnoti158400
Monopolarna elektroda ssącaA-M Systems573000z domowym odniesieniem 
Oscyloskop TektronixTDS2014
StereomikroskopNikonSMZ 800
Oświetlacz zimnego światła Photonic OpticsPL 3000
Płytka akwizycyjnaNational InstrumentsNI PCIe-6353
Blok złączyNational InstrumentsNI 2110
Komputer osobistyAMD Phenom II x4 970Procesor 3,50 Ghz z oprogramowaniem Windows 7
LabView 2012National Instruments
Krebs-Ringer Wodorowęglan Bufor Sigma-AldrichK4002 bufor fizjologiczny
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761 
Chlorek wapnia CaCl2Sigma-AldrichC4901bezwodny, proszek, ≥ 97%
Bufor HEPESSigma-AldrichH3375≥ 99,5% (miareczkowanie)
Naczynia 60mm x 15mmFalcon353004Polistyren
SilikonSylgard 184 Silikon Zestaw elastomerów  0,5 kg.
TermostatDennerleDigitalDuomat 1200
PompaNewa MiniMN 606do akwarium
Odporność na ciepło ThermocableLucky Reptile61403-150/60Hz 50W
Wiadrodowolne 10 litrówPolipropylen
O2 + 5%CO2siadMix gas
#5 Kleszcze Fine Science Tools11252-202 items
Nożyczki sprężynowe - ostrza 8 mmFine Science Tools15024-10wycinanie nerwów
Ostre nożyczki Narzędzia naukowe 14059-11usuwanie mięśni
Delikatne nożyczkiWagner02.06.32zewnętrzna
rękojeść skalpela studenckiego #3Narzędzia do nauki pięknej 91003-12 
Ostrza skalpela #10Narzędzia do nauki pięknej 10010-00
Ostrza skalpela #11Narzędzia do nauki pięknej 10011-00
drut nylonowy i Oslash; 0,16 mmdowolna
Stymulator impulsów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
  3. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
  4. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  5. Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
  6. Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
  7. Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
  8. Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
  9. Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
  10. Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
  11. Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
  12. Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
  13. Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
  14. Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
  15. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
  16. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
  17. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
  18. Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
  19. Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
  20. Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

Powiązane artykuły