Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55239

⸱

12 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

W tym artykule

Podsumowanie

Mutanty delecji genów generowane przez rekombinację homologiczną są złotym standardem w badaniach funkcji genów. Opisano metodę OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) służącą do szybkiego generowania konstruktów delecyjnych. Następuje przemiana grzybów za pośrednictwem Agrobacterium. Na koniec przedstawiono metodę potwierdzania delecji genów w transformantach grzybowych opartą na PCR.

Streszczenie

Precyzyjne usunięcie interesującego genu (genów), przy jednoczesnym pozostawieniu reszty genomu bez zmian, stanowi idealny produkt do określenia funkcji tego konkretnego genu w żywym organizmie. W protokole tym opisano metodę OSCAR polegającą na precyzyjnej i szybkiej budowie plazmidu delecyjnego. OSCAR opiera się na systemie klonowania, w którym przeprowadza się pojedynczą reakcję rekombinazy zawierającą oczyszczone, amplifikowane PCR 5' i 3' boki genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz dwa plazmidy, pA-Hyg OSCAR (wektor markerowy) i pOSCAR (wektor złożenia). Potwierdzenie prawidłowo zmontowanego wektora delecji odbywa się poprzez mapowanie trawienia restrykcyjnego, a następnie sekwencjonowanie. Agrobacterium tumefaciens jest następnie używany do pośredniczenia we wprowadzaniu konstruktu delecyjnego do zarodników grzybów (określanych jako ATMT). Na koniec opisano test PCR w celu określenia, czy konstrukt delecji jest zintegrowany przez rekombinację homologiczną czy niehomologiczną, wskazując odpowiednio na delecję genu lub integrację ektopową. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane do delecji wielu genów między innymi u Verticillium dahliae i Fusarium verticillioides.

Wprowadzenie

Analiza genetyczna to potężna metodologia określania funkcjonalnego znaczenia poszczególnych genów lub kombinacji genów. Standardowym podejściem do zrozumienia roli określonych genów jest produkcja mutantów pojedynczych genów, które nie uległy zmianie w żadnym innym genie. Najpotężniejszym i najmniej potencjalnie mylącym podejściem jest całkowita i precyzyjna delecja otwartej ramy odczytu genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI ORF) bez uszkodzenia jakiejkolwiek innej funkcji genu.

Ponieważ standardowe metody ligacji do generowania plazmidu delecji wymagają wielu etapów, uzasadnieniem dla OSCAR1 było stworzenie szybszego podejścia in vitro. Rysunek 1 przedstawia proces montażu w podejściu OSCAR. Opisana tutaj metoda ma tę zaletę, że łączy szybką budowę pojedynczych wektorów delecji genów w jednej wieloczęściowej reakcji w połączeniu z późniejszą transformacją za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (ATMT). OSCAR jest bardzo szybki i dobrze wypada w porównaniu z innymi strategiami, takimi jak użycie montażu Gibsona w yeast2. Metoda OSCAR jest z powodzeniem stosowana w przypadku kilku gatunków grzybów Ascomycota. Do gatunków tych należą: Fusarium verticillioides (niepublikowany), Verticillium dahliae3, Setosphaeria turcica4, Metarhizium robertsii5, Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum6, Pestalotiopsis microspora7, Colletotrichum higginsianum8 oraz Dothistroma septosporum9 i Sarocladium zeae (niepublikowane).

Ten protokół dostarcza instrukcje krok po kroku dotyczące metody, w tym projektowania startera, amplifikacji PCR z boku, reakcji OSCAR BP, potwierdzenia struktury konstruktu delecyjnego, transformacji Agrobacterium za pomocą konstruktu, a następnie transferu konstruktu delecji opartego na ATMT do komórek grzyba, a na końcu różnicowania mutantów delecji grzybów od tych z ektopowo zintegrowanymi konstrukcjami delecji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt startera do amplifikacji PCR boków genów

  1. Pobierz do pliku edytora tekstu region genomowy genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI), w tym otwartą ramkę odczytu (ORF) i co najmniej 2 kb flankujące gen z każdej strony, z FungiDB lub innego zasobu danych genomowych.
  2. Podświetl ORF przeznaczony do usunięcia i oznacz kodony start i stop.
  3. Zidentyfikuj i podświetl sąsiednie ORF-y w pobranej sekwencji.
  4. Użyj końca 2 kb 5' ORF GOI i narzędzia do projektowania startera (patrz Lista materiałów), aby zaprojektować parę starterów PCR O1 i O2 w celu wygenerowania iloczynu o minimalnym rozmiarze 1 kb. Uważaj, aby nie wpływać na sąsiednie ORF-y.
    1. Wklej bok o długości 2 kb 5' w oknie "Wprowadzanie sekwencji". Kliknij pole "Pokaż parametry niestandardowe". Wprowadź następujące niestandardowe parametry projektowe: podkład TM 58 (min), 60 (opcjonalnie) i 62 (maks.); Grunt GC 40 (min), 50 (opcjonalnie) i 60 (maks.); Rozmiar podkładu 22 (min), 24 (opcjonalnie) i 26 (maks.); Rozmiar amplikonu 1250 (min), 1500 (opcjonalnie) i 2000 (maks.).
    2. Wybierz wynik, który umieszcza odwrócony starter (O2) najbliżej ORF. Uchwyć zrzut ekranu testów, a następnie skopiuj i wklej sekwencje elementarne do dokumentu edytora tekstu.
    3. Powtórz proces dla flanki 3', aby wygenerować startery O3 i O4, tym razem wybierz wynik, umieszczając przednią spłonkę (O3) najbliżej docelowego ORF.
  5. Dodaj odpowiednie miejsca mocowania na końcach 5' podkładów od 1 do 4 (patrz Tabela 1).
  6. Należy również zaprojektować i zamówić startery specyficzne dla ORF, które będą używane do potwierdzania usunięcia w sekcji 4 poniżej. Parametry powinny być takie same jak w kroku 1.4.1, z wyjątkiem użycia Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) i 1000 (max), dostosowując długość ORF, jeśli to konieczne. Wreszcie, aby potwierdzić homologiczne rekombinanty, wygeneruj startery 5' out i 3' out znajdujące się tuż za bokami chromosomu. Te "wyjściowe" startery będą używane odpowiednio z hygR (210) i hygF (850) (rys. 2).
  7. Zamów podkłady.

2. Produkcja konstrukcji OSCAR

  1. Używając Taq hi-fidelity, przeprowadź dwie reakcje, po jednej dla boków 5' i 3', używając starterów (100 μM) O1 i O2 w jednej reakcji oraz starterów O3 i O4 w drugiej. Mieszanina reakcyjna zawiera: 29,5 μl sterylnej wody destylowanej (SDW), 5 μl 10x LA bufor PCR, 8 μL 2,5 mM mieszaniny dNTP, 5 μL 25 mM MgCl2, 1 μL matrycy (50 ng/μL), 0,5 μL Hi-fidelity Taq, 0,5 μL Primer O1 i 0,5 μL Primer O2 na 5' flank (lub 0,5 μL Primer O3 i 0,5 μL Primer O4 na 3Warunki reakcji należy stosować w następujący sposób: 94 °C przez 1 minutę, następnie 30 cykli po 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 2 minuty, następnie końcowe etapy 72 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w nieskończoność w temperaturze 10 °C.
  2. Przeprowadzić elektroforezę żelową 0,8% agarozy 1x TAE (40 mM octan Tris pH 8,3, 1 mM EDTA) przez około 125 Vh w standardowym aparacie miniżelowym, aby określić wielkość produktu i względne stężenie. Po zabarwieniu żelu barwnikiem bez etydyny zgodnie z instrukcją producenta. Wizualizacja na oświetlaczu UV.
  3. Jeśli produkty 5' i 3' flankowe są w mniej więcej równym stężeniu, połącz je i użyj zestawu kolumn powinowactwa (lub PEG wytrącanie 90 μl połączonych produktów PCR, 240 μl buforu TE pH 7,5, 160 μl 30% glikolu polietylenowego PEG8000 30 mM MgCl2) w celu współoczyszczania produktów PCR zgodnie z protokołem producenta. Jeżeli nie mają jednakowego stężenia, należy połączyć cały produkt o niskim stężeniu z oszacowaną równą ilością produktu z reakcji o wyższej wydajności.
  4. Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA.
  5. Przeprowadzić reakcję BP, mieszając następujące elementy: 1 μl 60 ng/μL pOSCAR, 2 μL 60 ng/μL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL 60 ng/μL połączonych boków, 1 μL klonazy. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 25 °C. Zakończyć reakcję przez dodanie 0,5 μl proteinazy K i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Transformacja komórek E. coli o wysokich kompetencjach. Zarówno dostępne na rynku kompetentne ogniwa, jak i kompetentne komórki DH5α CaCl2 domowej produkcji były z powodzeniem stosowane jako biorcy, zgodnie z instrukcjami producenta. Płytka o niskiej zawartości sodu (0,5 g/l NaCl) LB zawierająca 100 μg/ml spektynomycyny (Spec).
  7. Zidentyfikuj poprawny konstrukt, wykonując minipreps DNA10 kolonii wygenerowanych powyżej. Przeprowadzić podwójne roztwarzanie za pomocą HindIII i KpnI w następujący sposób: odpipetować 5 μl DNA, 2 M każdego enzymu, 2 μL odpowiedni 10x bufor z SDW do całkowitej objętości 20 μL. Powoduje to uwolnienie insertu (ok. 4,5 kb z bokami genu 1,5 kb) z wektora (ok. 7 kb) i nacięcie wszelkich miejsc po bokach, które mogą dać przewidywalne rozmiary pasm.
  8. Sequence11 wybierz klony wykazujące odpowiedni wzór pasmowania.

3. Przemiana za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (ATMT) grzybów

  1. Przekształć szczep Agrobacterium tumefaciens AGL1 za pomocą definicji delecji OSCAR construct12.
  2. Przekształć grzyba za pomocą AGL1 zawierającego plazmid delecji GOI OSCAR. Aby to zrobić, wykonaj następujące kroki:
    1. Przygotować zawiesinę zarodników grzybów ze sterylną wodą o stężeniu 2 x 106 zarodników/ml. Określ ilościowo zarodniki na hemocytometrze lub automatycznym liczniku komórek. Umieść 500 μl tego w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ten zestaw jest przeznaczony dla 4 płyt transformacyjnych.
    2. Użyj niebieskiej sterylnej jednorazowej pętli, aby dodać łatwo widoczną porcję (powinna pokrywać około 20% średnicy pętli) plazmidu delecyjnego zawierającego AGL1 z 2-3 dniowej pożywki LB-Spec 100 (patrz Lista materiałów dla składu) zawierającej płytki i wymieszać z zawiesiną zarodników. Wirować, aż komórki bakteryjne będą dobrze rozproszone (ok. 5 min średnia prędkość).
    3. Odpipetować 100 μl zawiesiny conidia-Agro na środek celulozowego filtra membranowego umieszczonego na każdej z czterech 6 cm szalek Petriego zawierających pożywkę do wspólnej uprawy12.
    4. Rozprowadzić zawiesinę za pomocą sterylnych kulek szklanych (około 4), aby pokryć całą powierzchnię filtra membranowego. Alternatywnie rozprowadzić zawiesinę za pomocą tradycyjnego narzędzia do rozsiewania. Pozostaw filtr membranowy do wyschnięcia w okapie na około 10 minut, owiń folią parafinową. Powtórz kroki 3.2.2 i 3.2.3, aby skonfigurować wiele przekształceń.
    5. Inkubuj płytkę przez 2 dni w temperaturze pokojowej, odwróconej.
    6. Przenieść filtr membranowy na 6 cm pożywkę selekcyjną Aspergillus12 płytek zawierających higromycynę B (Hyg) 150 μg/ml, 200 mM cefotaksymu i 100 μg/ml moksaltamu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-7 dni przed odizolowaniem kolonii odpornych na Hyg.
    7. Za pomocą sterylnych wykałaczek przenieś przypuszczalne transformanty na 6 cm płytki z agarem ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) zawierające 150 μg/ml Hyg, 100 μg/ml kanamycyny.

4. Identyfikacja mutantów usuwanych metodą PCR

  1. Ekstrakcja DNA do PCR z transformantów metodą termolizy13.
    1. Gdy transformanty utworzą kolonie na PDA z kroku 3.2.7, użyj sterylnej wykałaczki, aby przenieść niewielką ilość (2 mm x 2 mm) grzybni lub komórek drożdży z kolonii do 100 μl roztworu do lizy (50 mM fosforanu sodu, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glicerolu) w probówce do mikrowirówki.
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 85-90 °C przez 20-30 minut. Przechowywać surowy ekstrakt zawierający genomowe DNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia w kroku 4.2.
  2. Przeprowadzić 4 reakcje PCR na transformant, po jednej w każdej w celu wykrycia homologicznej rekombinacji odpowiednio boków 5' i 3', jedną dla wybranego markera (w tym przypadku fosfotransferazy higromycyny) i jedną dla ORF.
    UWAGA: Zazwyczaj używamy niedrogiego Taq o niskiej wierności do tych reakcji. Warunki reakcji są zgodne z opisem w kroku 2.1 powyżej i zawierają SDW 20 μL, 10x bufor Taq 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, domowej roboty Taq14, 0,5 μL, Primer A (100 μM) 0,5 μL, Primer B (100 μM) 0,5 μL, Template 0,5 μL. Równie dobrze można stosować startery o niższym stężeniu (10 μM).
  3. Uruchom żel agarozowy (np. 0,8%) produktów PCR. Mutanty delecyjne wytworzą pasmo Hyg, ale nie produkt ORF. Integranty ektopowe pokażą oba pasma. Typ dziki wytworzy tylko pasmo ORF.
  4. Trwale przechowuj mutanty usuwające (i jeden lub dwa transformatory ektopowe dla kontroli) do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: 15% glicerol służy do długoterminowego przechowywania naszych szczepów w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda OSCAR w ramach jednej reakcji generuje plazmid zawierający flanki genu docelowego, który ma zostać usunięty, otaczające kasetę markera selekcyjnego. Produkcja konstruktów delecyjnych za pomocą OSCAR jest bardzo wydajna. System ten może jednak generować konstrukty częściowe, zawierające niektóre, ale nie wszystkie trzy fragmenty (dwie flanki genu i marker selekcyjny). Zazwyczaj większość transformantów E. coli zawiera prawidłowy konstrukt OSCAR. Na przykład Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednoetapowa konstrukcja plazmidów gotowych do rekombinacji Agrobacterium (OSCAR) została z powodzeniem zastosowana w przypadku stale rosnącej liczby grzybów Ascomycota. Metoda ta powinna być również łatwo stosowana do Basidiomycota i gatunków z innych typów grzybów (z odpowiednimi promotorami napędzającymi selekcjonowane geny markerowe), zakładając, że możliwa jest transformacja za pośrednictwem Agrobacterium i rekombinacja homologiczna. Wygenerowano dodatkowe wektory markerowe, aby zróżnicować wybór z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują następującym studentom studiów licencjackich i licealnych za ich pracę nad wygenerowaniem mutantów OSCAR w Fusarium verticillioiodes: Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez, Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum, Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin, Thi Ngoc Le i Angel Pham.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Baza danych FungiDB/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuestIDTPrimer projektowanie oprogramowania online/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft WordSekwencja manipulacja plikami
Low Na LB Spec 100 średniE. coli selekcja transformantów, skład: 1% trypton, 0,05% NaCl, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1,5% agar dla podłoża stałego
PożywkaIndukcja przemiany ATMT (odniesienie 12)
Minimalna pożywka Aspergillus z higromycynąSelekcja transformantów grzybów
Pożywka PDAAcumedia7149A Rurkiskośne z pojedynczymi zarodnikami
PDA-Hyg-Kan pożywkaIzolacja ransformantów grzybów, PDA zawierająca 150 μ g/ml higromycyny B i 100 μ g / ml Kanamycyna
Koraliki szklaneGenlantisC400100Rozprowadzanie płytek
Filtry nitrocelulozowe (47 mm)Fisher09-719-555Hodowla dla ATMT
Różne probówki ceżkowe wielokrotneprzygotowanie
Płytki Petriego (różne)Hodowla bakterii i grzybów
pA-Hyg OSCARAddgene29640Wektor znacznika
do wyboru pOSCARAddgene29639Wektor montażowy
DH5α One Shot Kompetentne E. coli komórkiLife Technologies 12297-016Transformacja reakcji BP
ccdB przeżycie komórek E. coliLife Technologies A10460Konserwacja pOSCAR
Drewniane patyczki transferowe Smugikolonii
WykałaczkiZbieranie kolonii
MikrowirówkaGranulowanie Bakterie, etc.
WirówkaZbieranie zarodników grzybów
preparacyjnyPojedynczy izolacja zarodników
Automatyczny licznikObliczanie zawiesiny zarodników
MikroskopHemocytometr zliczanie komórek
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Qiagen28104Oczyszczanie genu PCR z flanki
TaKaRa LA Taq Takara Bio USARR002AHi Fidelity taq polimeraza do generacji flankowej OSCAR
Hygromycyna BInvivoGenant-hg-5
SpectinomycinSigma22189-32-8
CefotaksymTCI AmericaC2224
Kanamycyna11815032
MoxalactamSigma-Aldrich43963
ŻelCzerwony  Phenix Research ProductsRGB-4103Żele agarozowe po barwieniu
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Kat. Nr 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R lub One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R firmy Invitrogen) Thermo Fisher ScientificC862003
Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymówThermo Fisher Scientific11789020Służy do składania konstrukcji delecji w pOSAR
do kouprawy preparatywna Mikroskop komórek złożony

Bibliografia

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960(2015).
  9. Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
  10. Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172(1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

delecja genukonstrukcja plazmiduzarodniki grzybówanaliza PCRtrawienie restrykcyjnerekombinacja homologicznaintegracja ektopowaoporność na hygromycynęmetoda OSCAR
Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.