Ostatnie odkrycia sugerują, że bakteryjne silniki wiciowe wyczuwają różne sygnały środowiskowe i w odpowiedzi na nie przebudowują się. Oczekuje się, że omówione tutaj testy perełkowe pomogą wyjaśnić rolę przebudowy w adaptacji komórek do stresorów środowiskowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rola silników wiciowych w ruchliwości bakterii i chemotaksji jest dobrze poznana. Ostatnie odkrycia sugerują, że silniki wiciowe są w stanie przebudować się w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe i są jednym z wyzwalaczy kolonizacji powierzchni i infekcji. Dokładne mechanizmy, za pomocą których silniki przebudowują się i promują adaptację komórkową, prawdopodobnie zależą od kluczowych atrybutów motorycznych. Zaprezentowana tu technika śledzenia koralików oparta na fotopowielaczu umożliwia dokładną biofizyczną charakterystykę funkcji motorycznych, w tym adaptacji prędkości motorycznych i dynamiki przełączania. Takie podejście ma tę zaletę, że umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym i możliwość badania zachowań motorycznych przez dłuższy czas. Omówione protokoły można łatwo rozszerzyć o badania silników wiciowych u różnych gatunków bakterii.
Wprowadzenie
Silniki wiciowe umożliwiają komórkom pływanie poprzez obracanie spiralnych włókien zewnątrzkomórkowych. Wielkość momentu obrotowego, jaki silnik może wygenerować dla danej długości wici (tj. obciążenie lepkie) określa prędkość pływania. Z drugiej strony, jego zdolność do zmiany kierunku rotacji kontroluje migrację komórek w odpowiedzi na chemikalia, proces znany jako chemotaksja. Chemotaksja i ruchliwość są czynnikami wirulencji 1-3, silniki wiciowe zostały dobrze scharakteryzowane na przestrzeni lat 4. Coraz więcej dowodów sugeruje, że silnik działa jak mechanoczujnik - mechanicznie wykrywa obecność stałych substratów 5,6. Ta zdolność prawdopodobnie pomaga w wywoływaniu kolonizacji powierzchni i infekcji 5,7. W związku z tym istotne są mechanizmy, za pomocą których zmysły motoryczne uwidaczniają się i inicjują sygnalizację 8,9.
Silnik wiciowy można łatwo zbadać, przywiązując wić do podłoża i obserwując rotację komórek. Takie wiązanie zostało po raz pierwszy osiągnięte przez Silvermana i Simona, którzy pracowali z mutantem polyhook w E. coli i z powodzeniem przymocowali haki do szklanych podłoży z przeciwciałami anty-hook 10. Test na komórkach uwięzi umożliwił naukowcom zbadanie reakcji przełącznika motorycznego na różne bodźce chemiczne. Na przykład Segall i jego współpracownicy chemicznie stymulowali komórki na uwięzi za pomocą pipet jonoforetycznych. Odpowiednie zmianyw odchyleniu CW (ułamek czasu, w którym silniki obracają się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, CW) umożliwiły im zmierzenie kinetyki adaptacji w sieci chemotaksji 11,12. Chociaż test komórek na uwięzi był skuteczny w badaniu reakcji przełączających, był w stanie zapewnić wgląd w mechanikę motoryczną tylko w ograniczonym zakresie obciążeń lepkich13. Aby przezwyciężyć ten problem, Ryu i jego współpracownicy umieścili kuliste, lateksowe koraliki do włókien na komórkach przyklejonych do powierzchni. Koraliki były następnie śledzone za pomocą interferometrii ogniskowej wstecznej ze słabymi pułapkami optycznymi 14. Pracując z koralikami o różnych rozmiarach, naukowcy mogli badać silnik w znacznie szerszym zakresie obciążeń. Test ten został później ulepszony przez Yuana i Berga, którzy opracowali technikę śledzenia koralików opartą na fotopowielaczu w połączeniu z laserowym oświetleniem ciemnego pola. Opracowana przez nich metoda umożliwiła śledzenie złotych nanokulek na uwięzi, które były tak małe (~ 60 nm), że zewnętrzne opory lepkości były niższe w porównaniu z wewnętrznymi oporami lepkości do obrotu 15,16. Doprowadziło to do pomiarów maksymalnych osiągalnych prędkości u E. coli (~ 300 Hz). U V. alginolyticus podobne testy perełkowe umożliwiły pomiary szybkości wirowania przy średnich obciążeniach lepkości (~ 700 Hz) 17. Umożliwiając pomiary reakcji motorycznych w całym możliwym zakresie obciążeń lepkich (od obciążenia zerowego do prawie przeciągnięcia), testy perełkowe dostarczyły ważnego narzędzia biofizycznego do zrozumienia procesu generowania momentu obrotowego 18,19.
Niedawno zmodyfikowaliśmy test Yuana-Berga, aby zawierał pęsety optyczne, które umożliwiły nam zastosowanie precyzyjnych bodźców mechanicznych do poszczególnych silników 6. Korzystając z tej techniki, wykazaliśmy, że generatory siły, które obracają silnik, są dynamicznymi mechanoczujnikami - przemodelowują się w odpowiedzi na zmiany obciążeń lepkich. Możliwe, że takie wykrywanie obciążenia wyzwala różnicowanie komórek w rojące się bakterie, chociaż mechanizmy pozostają niejasne. Jest również prawdopodobne, że silniki wiciowe u innych gatunków są również mechanowrażliwe 20, chociaż brakuje bezpośrednich dowodów. W tym miejscu omówiono podejście oparte na fotopowielaczu (PMT) do śledzenia rotacji kulek lateksowych przywiązanych do włókien wiciowych 15. W porównaniu ze śledzeniem za pomocą ultraszybkich kamer, konfiguracja fotopowielacza jest korzystna, ponieważ śledzenie pojedynczych kulek w czasie rzeczywistym i przez długi czas jest stosunkowo proste. Jest to szczególnie przydatne podczas badania długotrwałej przebudowy kompleksów motorycznych wici pod wpływem bodźców środowiskowych 21. Chociaż szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie dla E. coli, można je łatwo dostosować do badania silników wiciowych u innych gatunków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
- Przygotować nocne hodowle pożądanego szczepu niosącego lepki allel fliC 15,22 w bulionie tryptonowym (TB, 1% peptony, 0,5% NaCl), a następnie zaszczepić je w rozcieńczeniu 1:100 w 10 mL świeżego TB. Hodować kulturę w temperaturze 33 °C w inkubatorze z wytrząsaniem do osiągnięcia OD600 = 0,5.
- Osadzić komórki przez wirowanie przy 1 500 x g przez 5–7 min i energicznie resuspender osad w 10 mL filtrowanego, sterylnego buforu do ruchliwości (MB; 10 mM bufor fosforanowy: 0,05-0,06 M NaCl, 10-4 M EDTA, 1 µM metioniny, pH 7,0).
- Powtórzyć krok 1.2 jeszcze dwa razy i resuspender końcowy osad w 1 mL MB.
- Poddać zawiesinę ścinaniu, przepuszczając ją około 75 razy tam i z powrotem między dwiema strzykawkami z adapterami o rozmiarze od 21 do 23 G, połączonymi rurką polietylenową (długość 7–12 cm, średnica wewnętrzna 0,58 mm). Całkowity czas ścinania ograniczyć do 30–45 s.
- Odwirować ścięte komórki przy 1 500 x g przez 5–7 min i resuspender osad w 100–500 µL MB.
2. Przygotowanie preparatów
- Przygotuj komorę obrazowania, umieszczając dwie taśmy dwustronne między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywnym. W przypadku testów chemotaksji zastosuj dowolną komorę mikrofluidyczną umożliwiającą wymianę MB i stymulantów chemicznych.
- Do komory dodaj 0,01% roztwór poli-L-lizyny, a po 5 min delikatnie przepłucz powierzchnie za pomocą MB (80 - 100 µL).
- Do komory dodaj 40 µL zawiesiny komórkowej i odczekaj czas wystarczający do przytwierdzenia komórek do powierzchni szkła (7 - 8 min). Usuń nieprzytwierdzone komórki, dodając 100 µL MB z jednej strony komory i odciągając roztwór papierem filtracyjnym z drugiej strony.
- Do komory dodaj 10 - 15 µL kulek lateksowych i odczekaj czas odpowiedni dla osiadania i przytwierdzania kulek do komórek (7 - 8 min). Delikatnie przepłucz 100 µL MB, zgodnie z opisem w kroku 2.3, aby usunąć nieprzytwierdzone kulki. W eksperymentach stosuj różne rozmiary kulek, o ile zapewnia to odpowiedni kontrast.
3. Śledzenie kulek
- Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i przeskanuj powierzchnię w poszukiwaniu kulek przyczepionych do silników. Do obserwacji użyj obiektywu fazowego 40X, choć mikroskopia fazowa nie jest niezbędna. Alternatywnie można zastosować obrazowanie w polu jasnym, pod warunkiem zachowania wystarczającego kontrastu, aby wyraźnie odróżnić jasną kulkę na ciemnym tle.
- Po wybraniu kulki przesuń stolik bocznie, aby umieścić ją w określonym narożniku, jak pokazano na Rysunku 1B. Umieszczaj kulki w tym samym narożniku, aby mieć pewność co do kierunku ich obrotu. Idealna trajektoria kulki jest w przybliżeniu kołowa, jednak dopuszczalne są również trajektorie eliptyczne.
- Utrzymuj częstotliwość próbkowania wyższą niż dwukrotność częstotliwości obrotowej silnika, aby uniknąć błędów związanych z aliasingiem. W niniejszej pracy wykorzystano silnik obracający się z częstotliwością 50 Hz i próbkowano z częstotliwościami 10-krotnie wyższymi (500 Hz), aby uzyskać gładki sygnał.
4. Analiza danych
- W razie potrzeby wycentrować i przeskalować napięcia wyjściowe PMT oraz skorygować eliptyczność trajektorii za pomocą przekształceń afinicznych 23. Do wyznaczenia prędkości rotacji należy wykorzystać analizę widma mocy 17.
- Wyznaczyć kąty polarne, θ(t) = atan (y(t)/x(t)). Zmiany prędkości silników oraz przełączenia w czasie należy określić poprzez obliczenie ω
14. - Zastosować filtr medianowy w celu wygładzenia danych dotyczących prędkości silników. Zalecane jest zastosowanie okna filtra obejmującego dwa pełne obroty 23,24.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Układ fotopowielaczy przedstawiono na Rysunku 1A. Istotne jest, aby fotopowielacze (PMT) charakteryzowały się wysoką czułością w zakresie długości fal rozpraszanych przez analizowane kuleczki. Zastosowane tutaj PMT pracują w zakresach widzialnym i bliskiej podczerwieni i były w stanie wykryć światło rozproszone przez kuleczki oświetlone halogenowym źródłem światła. Optymalne warunki oświetlenia i napięcia zasilania będą się różnić w zależności od konkretnego układu. Dla k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W celu ułatwienia śledzenia stopki na uwięzi i prawidłowego oszacowania momentów obrotowych silnika, należy zapoznać się z poniższymi informacjami. Podczas wykonywania tych pomiarów na komórkach wiciowców ścinanie jest krytycznym krokiem. Ścinanie redukuje włókno wiciowe do zwykłego kikuta, zapewniając w ten sposób, że obciążenie lepkości silnika jest głównie spowodowane stopką i można je oszacować z dokładnością do 10% błędu 16. Ścinanie zwiększa również szanse na znalezienie trajektorii kołowych o ciasno roz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Howardowi Bergowi za dar mikroskopu śledzącego koraliki/fotopowielacze oraz Texas A&M Engineering Experiment Station za fundusze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwór poli-L-lizyny (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead | Microspheres Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml strzykawka z końcówką Luer Slip Tip | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter | Rurki polietylenowe Becton, Dickinson and Company o rozmiarze 23 Becton, Dickinson and Company | 427565 http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp | |
| Aparat Harvard | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html | |
| Fotopowielacz Lampy | Hamamatsu | R7400U-20 | Zakres odpowiedzi spektralnej od 300 do 920 nm, Szczytowa długość fali 630 nm, Czas odpowiedzi 0,78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm precyzyjne szczeliny | Edmund Optics | NT39-908 | 2 szczeliny zamontowane pod kątem prostym do siebie na lampach fotopowielacza |
| Oscyloskop | Tektronix | TBS 1032B | Dopuszczalne są alternatywne marki. Oscyloskop cyfrowy, Seria TBS 1000B, 2 analogowe, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8-biegunowy filtr LP/HP | Krohn-Hite | 3384 | Dopuszczalne są alternatywne marki. Zalecany jest zakres częstotliwości od 0,1 Hz do 200 kHz. Mikroskop http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot | Nikon | NA | Można użyć dowolnego mikroskopu pionowego lub odwróconego mikroskopu fazowego. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Rozdzielacz wiązki sześcienny | ThorLabs | BS013 |
Bibliografia
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
