Sublimacja matrycy DAN do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w tkance mózgowej szczura do obrazowania MALDI Spektrometria mas

Spektrometria mas (IMS) z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą (MALDI) staje się bardzo poszukiwaną techniką wizualizacji przestrzennego rozkładu lipidów, peptydów i białek na nienaruszonych powierzchniach próbek. MALDI IMS była wcześniej znana jako technika analityczna dla wstępnie oczyszczonych analitów, ale w ostatnich latach przyciąga uwagę w wielu innych dyscyplinach ze względu na możliwość połączenia dokładności spektrometrii mas z wizualnymi/anatomicznymi punktami odniesienia o wysokiej rozdzielczości bez konieczności zewnętrznego znakowania. Wraz ze wzrostem liczby badaczy wykorzystujących tę technikę rośnie zapotrzebowanie na ustandaryzowane, łatwe do naśladowania protokoły, które pomogą w rozwoju i optymalizacji eksperymentów IMS. Gangliozydy, grupa lipidów błonowych występujących w dużych ilościach w ośrodkowym układzie nerwowym, są idealne do eksperymentów MALDI IMS, ponieważ ich lokalizacja, osadzona w błonie, uniemożliwia wykrycie niektórych gatunków za pomocą konwencjonalnego znakowania immunologicznego. Dodatkowo wykazaliśmy, używając MALDI IMS, że te lipidy, które działają między innymi jako modulatory sygnalizacji komórkowej, mają unikalne anatomiczne wzorce rozmieszczenia w mózgu zdrowego gryzonia, które są zmieniane po urazie mózgu ^3,4,5. Gangliozydy znajdują się w wyższym zakresie masowym w porównaniu z większością gatunków lipidów i dlatego najlepiej nadają się do platformy obrazowania MALDI.

Rysunek 1: Przebieg pracy w eksperymencie MALDI IMS. Diagram ogólnego przebiegu eksperymentu MALDI IMS z wykorzystaniem sublimacji. Tkanka zamrożona w temperaturze -80 °C jest cięta w kriostatu, a skrawki o wielkości 10 μm są rozmrażane na przewodzących szkiełkach ITO. Szkiełko jest następnie umieszczane w eksykatorze do momentu sublimacji. Preparaty są wprowadzane do aparatu sublimacyjnego, a na powierzchnię próbki tkanki nakładana jest równa warstwa matrycy. Próbki zamraża się przez noc w zamrażarce o temperaturze -20 °C, a następnie umieszcza w eksykatorze na 10 minut. Po nałożeniu wzorców próbki są umieszczane w instrumencie MALDI, gdzie laser jest kierowany na tkankę, powodując jonizację zdesorbowanych cząsteczek w matrycy. Jony przemieszczają się w dół rury przelotowej i rozdzielają się w zależności od ich masy (czas przelotu/TOF), aż dotrą do detektora. Informacje o obfitości jonowej analitów w określonym zakresie masy do ładunku (m/z) są wyświetlane zarówno jako obraz molekularny, jak i widmo masowe. Dane te można wykorzystać zarówno do wizualizacji, jak i ilościowego określenia obfitości jonów analitu będącego przedmiotem zainteresowania w obrazowanej tkance. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przygotowanie próbki do MALDI IMS jest bardzo zmienne, ponieważ każdy etap procesu musi być dostosowany do interesujących nas analitów. Cechą charakterystyczną eksperymentów opartych na MALDI jest zastosowanie powłoki matrycy osadzonej na powierzchni próbki przed analizą. Oprócz roli pochłaniania i przenoszenia energii promieniowania z lasera podczas procesu ablacji, matryca służy również do izolowania różnych analitów od próbki, ułatwiając w ten sposób analizę interesujących związków ^6,7. Jednorodne nałożenie matrycy na powierzchnię próbki jest najważniejszym krokiem w procesie przygotowania próbki. Niewłaściwe osadzanie matrycy może prowadzić do dużych heterogenicznych formacji kryształów matrycy i rozwoju artefaktów, niskiego sygnału jonowego i słabej odtwarzalności ⁷.

Ze względu na powinowactwo niektórych matryc do izolowania określonych analitów, rodzaj matrycy wybranej do eksperymentu może znacząco zmienić wynik. Matryce używane do obrazowania białek i peptydów często różnią się od tych używanych do obrazowania lipidów, a proces ten jest dodatkowo skomplikowany ze względu na konieczność dodatkowych procedur, takich jak etapy mycia i nawadniania, w celu skutecznego wykrywania sygnałów z tkanki. Chociaż istnieją etapy płukania w celu wzmocnienia sygnałów lipidowych ⁸, nie są one warunkiem wstępnym do wykrycia większości gatunków lipidów. Wybierając matrycę do eksperymentu obrazowania lipidów, ważne jest, aby wziąć pod uwagę polarność interesującego lipidu, ponieważ zawęzi to zakres odpowiednich matryc. Na przykład gangliozydy zawierają reszty kwasu sjalowego, które nadają im ogólną ujemną polarność. Istnieje wiele matryc, które mogą skutecznie desorbować i jonizować gangliozydy z tkanki; Należy jednak wziąć pod uwagę takie czynniki, jak piki w widmie pochodzące z matrycy i stabilność matrycy w próżni. Matryca 1,5-diaminonaptalenu (DAN) jest wystarczająco stabilna w warunkach próżni instrumentu dla większości zastosowań obrazowania i wykazała wysoki stopień czułości na desorpcję lipidów i może być stosowana do analizy lipidów zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych 2. Macierz DAN, w porównaniu z innymi matrycami ujemnego powinowactwa lipidowego, takimi jak kwas dihydroksybenzoesowy (DHB), 9-aminoakrydyna (9-AA) i 5-chloro-2-merkaptobenzotiazol (CMBT), była w stanie najskuteczniej desorbować gangliozydy z tkanki mózgowej szczura w trybie jonów ujemnych (manuskrypt w przygotowaniu).

Wybór odpowiedniej metody osadzania matrycy jest równie ważny jak wybór samej matrycy. Metody osadzania na mokro, w których matryca stała jest rozpuszczana w rozpuszczalniku organicznym i osadzana przez pneumatyczne lub automatyczne opryskiwacze lub spottery, są szczególnie skuteczne w desorpcji białek i peptydów, gdy ciecz przenika do próbki, aby umożliwić ekstrakcję związków i kokrystalizację z matrycą. Chociaż techniki te mogą być również stosowane do zastosowań lipidowych, delokalizacja analitu i nierównomierne tworzenie się kryształów matrycy są częstym zjawiskiem ze względu na wysoką obfitość i rozpuszczalność lipidów w rozpuszczalnikach, szczególnie w tkankach ^2,9. Ponieważ lipidy są łatwo jonizowane z tkanki, techniki osadzania na suchej matrycy, takie jak sublimacja, stanowią prostą, opłacalną alternatywę dla opryskiwaczy, omijając jednocześnie wiele wad tych technik. Sukces sublimacji w eksperymentach MALDI IMS przypisuje się takim cechom, jak morfologia matrycy mikrokrystalicznej, która zwiększa powierzchnię wiązania matrycy z analitem, zwiększona czystość matrycy i jednorodne osadzanie matrycy, co prowadzi do zwiększenia odtwarzalności w porównaniu z technikami mokrej matrycy ^1,10.

Sublimacja polega na podgrzaniu sproszkowanej matrycy pod próżnią bezpośrednio pod schłodzoną powierzchnią próbki, co powoduje przejście sproszkowanej matrycy z fazy stałej do gazowej, po którym następuje osadzenie na powierzchni próbki tkanki. Podczas sublimacji osadzanie matrycy może być kontrolowane przez różne czynniki, takie jak czas, temperatura i ciśnienie, aby zapewnić wysoce powtarzalne wyniki. Pojedynczy eksperyment sublimacyjny może trwać od 5 do 20 minut, w zależności od wybranego rodzaju matrycy, która może być ponownie użyta kilka razy przed wyrzuceniem. Urządzenie można kupić w sprzedaży za ułamek ceny automatycznych opryskiwaczy i można je łatwo rozebrać w celu czyszczenia i konserwacji. Niski koszt i względna prostota tej techniki osadzania matrycy sprawiają, że jest ona idealna dla naukowców rozpoczynających lub rozwijających aplikacje obrazowania lipidów w MALDI IMS. Chociaż informacje szczegółowo opisujące protokoły sublimacji tkanek dla IMS zostały zgłoszone ¹¹, istnieje niewiele standardowych protokołów, które koncentrują się na podstawowym przepływie pracy związanym z przeprowadzeniem eksperymentu sublimacyjnego do obrazowania lipidów o dużej masie w trybie jonów ujemnych, co utrudnia ustalenie techniki bez rozległych prób i błędów. Poniżej znajduje się protokół eksperymentalny mający na celu wypełnienie tej luki w sublimacji matrycy DAN na skrawki mózgu szczura w celu obrazowania w wysokiej rozdzielczości i wykrywania gangliozydów.

Rysunek 2: Aparat do sublimacji. Zdjęcie (A) i schemat ideowy (B) aparatu sublimacyjnego. Pompa próżniowa jest podłączona gumową rurką do wymrażarki wypełnionej 300 ml etanolu. Wymrażarka jest następnie łączona gumową rurką z aparatem sublimacyjnym. Aparat składa się z dwóch oddzielnych kawałków szkła, które są uszczelnione metalowym złączem w kształcie litery U. W górnej połowie sublimatora znajduje się skraplacz, który jest wypełniony błotem pośniegowym. Płytkę próbki przykleja się taśmą do dna skraplacza, wewnątrz szczelnie zamkniętego szklanego aparatu. Dolna połowa aparatu sublimacyjnego zawiera matrycę DAN, rozłożoną równomiernie w kierunku płytki próbki. Podczas sublimacji szklany aparat umieszcza się na łaźni piaskowej podgrzanej do 140 °C przez płytę grzejną znajdującą się bezpośrednio pod nim. Sonda temperatury pomaga utrzymać stabilną temperaturę przez cały czas trwania eksperymentu sublimacyjnego poprzez sprzężenie zwrotne temperatury kąpieli piaskowej w porównaniu z temperaturą zadaną dla eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wszystkie procedury postępowania ze zwierzętami opisane poniżej są zgodne z zaleceniami komitetu ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Zachodniego Ontario (2016-014).

1. Przygotowanie i sekcja tkanek

1. Wyodrębnij tkankę mózgową od szczura w procesie znanym jako "Fresh Frozen Extraction" (FFE).
   1. Poddaj szczura eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu sodu i monitoruj odruchy w kończynach. Gdy wszystkie odruchy ustaną, odetnij głowę szczura za pomocą gilotyny.
   2. Ostrożnie oddziel mięśnie i inne tkanki od czaszki za pomocą skalpela. Użyj kleszczy do cięcia kości, aby rozbić czaszkę, aby odsłonić mózg, zaczynając od podstawy czaszki (otwór wielki) do przedniej części.
   3. Gdy mózg zostanie odsłonięty, ostrożnie zgarnij go szpatułką chirurgiczną i natychmiast umieść na pokruszonym suchym lodzie w celu błyskawicznego zamrożenia.
      UWAGA: Mózg będzie bardzo plastyczny. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas umieszczania mózgu na suchym lodzie. Jeśli mózg zostanie zmiażdżony lub przyciśnięty do powierzchni, zmieni swój kształt i zamarznie w tej pozycji.
2. Wyjąć świeżo zamrożoną tkankę (nie przesiąkniętą formaldehydem ani nie zatopioną w OCT) z zamrażarki o temperaturze -80°C i umieścić na suchym lodzie.
3. Umieść kilka kropli wody na uchwycie kriostatu i umieść na suchym lodzie lub kostce do zamrażania kriostatu. Lekko dociśnij tkankę do uchwytu kriostatu, gdy zacznie zamarzać i przytrzymaj, aż woda zamarznie wokół podstawy tkanki i zakotwiczy ją na miejscu. W razie potrzeby dodaj więcej wody, aby dodatkowo zabezpieczyć chusteczkę na uchwycie.
   UWAGA: Do mocowania tkanki zamiast pożywki OCT używa się wody, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki związkami, które mogą wpływać na wykrywanie pożądanego sygnału.
4. Umieść tkankę w kriostacie. Przekrój tkankę do pożądanej lokalizacji anatomicznej. Upewnij się, że grubość cięcia wynosi od 8 do 12 μm.
   UWAGA: Podczas cięcia tkanek w komunalnych urządzeniach kriostatowych konieczne jest stosowanie oddzielnych materiałów, takich jak ostrza, szczotki, stabilizatory i uchwyty, aby uniknąć zanieczyszczenia związkami osadzającymi. Wnętrze kriostatu należy również dokładnie wyczyścić etanolem przed użyciem.
5. Za pomocą stabilizatora kriostatu powoli przecinaj spłaszczone odcinki tkanek. lub ślady na tkance mogą wystąpić, jeśli umieszczenie pałąka jest nieprawidłowe lub ostrze jest. Przesuń chusteczkę na środek platformy do krojenia za pomocą czystych pędzli.
6. Montażu
   1. Zamroź szkiełka przewodzące lub metalowe płytki, umieszczając je w kriostacie podczas krojenia. Gdy szkiełko jest całkowicie zamrożone, ostrożnie przesuń podzieloną tkankę na przewodzącą powierzchnię szkiełka za pomocą czystych pędzli. Gdy wszystkie skrawki tkanki zostaną prawidłowo umieszczone na szkiełku, umieść palec pod szkiełkiem, naprzeciwko tkanki i dociśnij, aż sekcja się rozmrozi.
      UWAGA: Sekcje mogą się składać lub zwijać podczas procesu rozmrażania przy użyciu tej metody montażu. Można to zmniejszyć, utrzymując szkiełko w kriostacie podczas rozmrażania tkanki. Jeśli te problemy staną się problematyczne, poniżej wymieniono alternatywną metodę montażu na gorąco.
   2. Alternatywnie, weź szkiełko z tlenku indu i cyny (ITO) o temperaturze pokojowej (lub metalową płytkę) i lekko dociśnij zamrożoną część tkanki na powierzchni platformy do krojenia, przewodzącą stroną do dołu. Doprowadzi to do równomiernego rozmrożenia wycinka tkanki na powierzchni szkiełka przy niewielkim zwijaniu lub fałdowaniu tkanki.
      UWAGA: Podczas montażu tą metodą pod sekcją może pojawić się kondensacja, która może prowadzić do utraty niektórych białek i lipidów.
7. Umieścić szkiełka z chusteczką w eksykatorze na 5 - 10 minut.

2. Konfiguracja aparatury sublimatora

UWAGA: Wykonaj te kroki w dygestorium.

1. Umieść kąpiel piaskową w aluminiowym pojemniku na płycie grzejnej, tak aby płyta grzejna znajdowała się na metalowym podnośniku nożycowym o odpowiedniej powierzchni (tj. większej niż płyta grzejna). Włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 140 °C.
   UWAGA: Temperatura topnienia matrycy DAN wynosi od 187 do 190 °C. Nie przekraczaj tej temperatury na płycie grzejnej.
   1. Jeśli płyta grzejna jest wyposażona w sondę sprzężenia zwrotnego temperatury, użyj jej do monitorowania temperatury piasku przez cały czas trwania eksperymentu i zapewnienia stałej temperatury. Ta funkcja może pomóc w odtwarzalności eksperymentów w różnych eksperymentach sublimacyjnych.
      UWAGA: Kąpiel piaskowa powinna znajdować się w aluminiowym pojemniku, ponieważ szklany pojemnik może pęknąć w wysokich temperaturach.
2. Umieścić 300 mg matrycy DAN na dolnej powierzchni aparatu sublimacyjnego. Umieść matrycę na środku aparatu i rozłóż równą warstwą na przybliżonej szerokości i długości sublimowanego szkiełka.
   UWAGA: Macierz DAN jest toksyczna. Dlatego ważne jest, aby podczas pracy ze sproszkowaną matrycą zawsze nosić rękawice, maski i okulary ochronne. DAN powinien być przechowywany w ciemności, ponieważ jest wrażliwy na światło.
3. Przyklej metalową płytkę do wewnętrznej powierzchni aparatu, tak aby płytka miała bezpośredni kontakt z dnem skraplacza w celu zapewnienia równomiernego rozprowadzenia chłodzenia temperaturowego na całej powierzchni szkiełka podczas sublimacji. Alternatywnie przeszlifuj spód skraplacza, aby zapewnić płaską powierzchnię.
   1. Umieść taśmę wzdłuż zewnętrznych krawędzi płyty i przyklej do boków wewnętrznego szkła. Jeśli taśma zostanie umieszczona pod płytą i przylega do dolnej części wewnętrznej powierzchni szkła, rozkład temperatury może nie być równomierny i może spowodować nierównomierne rozprowadzenie matrycy na powierzchni szkiełka.
   2. Przyklej półfabrykat (testowy) szkiełko po przekątnej po powierzchni metalowej płytki z taśmą ponownie umieszczoną na zewnętrznych krawędziach szkiełka.
4. Połącz górną i dolną część urządzenia za pomocą gumowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym pośrodku, aby zapewnić pełne uszczelnienie.
5. Umieść metalowy przegub w kształcie litery U wokół środka aparatu i dokręć imadła, aż górna i dolna połowa aparatu zostaną szczelnie ze sobą połączone. Umieść w metalowym O-ringu nad kąpielą piaskową.
6. Weź garść pokruszonego lodu i umieść go w skraplaczu. Napełnij skraplacz od 1/4 do 1/2 zimną wodą, aby utworzyć lodową breję. Błoto pośniegowe ochłodzi metalową płytkę po wewnętrznej stronie aparatu, a następnie przylgnie do niej szkiełko. Odczekaj co najmniej 5 minut, aż temperatura osiągnie stan ustalony.
7. Wlej 300 ml etanolu do pojemnika wymrażarki i umieść w nim szkło. Wrzuć 2-3 małe kawałki suchego lodu do etanolu na dnie pojemnika wymrażarki. Wejście wymrażarki ma szklaną rurkę biegnącą do dna cylindra, podczas gdy wyjście nie.
8. Podłącz pompę próżniową do wyjścia wymrażarki za pomocą gumowej rurki. Użyj innego kawałka gumowej rurki, aby podłączyć wejście wymrażarki do aparatu sublimacyjnego. Upewnij się, że rurka jest szczelnie zabezpieczona za pomocą metalowych clamps, jeśli są dostępne.
9. Użyj pompy próżniowej, aby dostarczyć próżnię 30 - 50 mT. Pozwól pompie pracować przez co najmniej 5 minut w celu zrównoważenia ciśnienia. Imadła na pierścieniu U aparatu sublimacyjnego mogą wymagać ponownego dokręcenia po włączeniu pompy próżniowej z powodu zmniejszonego ciśnienia w aparacie.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przymocowanie wakuometru do pompy w celu monitorowania ciśnienia próżni podczas eksperymentu i testowania nieszczelności ciśnienia w celu osiągnięcia najwyższej możliwej powtarzalności między eksperymentami. Jednak większość pomp jest zaprojektowana tak, aby utrzymywać stałe ciśnienie, dlatego manometr może nie być niezbędny dla doświadczonych użytkowników. Dodatkowo można zastosować smar do uszczelnień próżniowych, aby pomóc w utrzymaniu podciśnienia.

3. Sublimacja

1. Upewnij się, że temperatura łaźni piaskowej ustabilizowała się na poziomie 140 °C i że urządzenie jest zamocowane w metalowym pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym nad kąpielą piaskową z podłączonymi wszystkimi rurkami i włączonym próżnią.
2. Ustaw minutnik na 7 minut, ale nie uruchamiaj timera. Powoli podnieś podnośnik nożycowy i kąpiel piaskową do aparatu sublimacyjnego, aż złącze w kształcie litery U sublimatora znajdzie się znacznie powyżej metalowego O-ringu. Ta dodatkowa przestrzeń pozwala na regulację aparatu na piasku.
   1. Szybko delikatnie dociśnij sublimator do powierzchni piasku, aby upewnić się, że urządzenie jest równomiernie osadzone na piasku, a następnie natychmiast uruchom stoper.
3. Gdy zabrzmi timer, wyłącz pompę próżniową i ostrożnie opuść podnośnik nożycowy, aż sublimator przestanie dotykać kąpieli piaskowej i będzie bezpiecznie osadzony w metalowym pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym.
   1. Powoli poluzuj zawór mikroodpowietrzający, aby uwolnić ciśnienie w aparacie. Poluzuj metalowy zacisk wokół gumowej rurki aparatu sublimacyjnego i powoli zacznij luzować rurkę. Po lekkim poluzowaniu gumowej rurki zegnij rurkę na bok, aby umożliwić ucieczkę ciśnienia resztkowego.
   2. Gdy ciśnienie otoczenia powróci, ostrożnie wyjmij gumową rurkę z aparatu sublimacyjnego.
4. Poluzuj imadła na przegubie w kształcie litery U urządzenia i wyjmij. Ostrożnie oddziel dwie połówki aparatu do sublimacji i zdejmij szkiełko z górnej części wewnętrznego szkła. Sprawdź slajd, aby potwierdzić równomierny rozkład macierzy.
   UWAGA: Jeśli matryca jest nierówna, sproszkowaną matrycę na dnie sublimatora można przestawić lub aparat sublimatora można umieścić w piasku na następny slajd. Proces sublimacji można powtórzyć kilka razy przy użyciu tej samej matrycy, jednak matryca ostatecznie stanie się ciemniejsza od wielokrotnej ekspozycji na ciepło, a ilość proszku zmniejszy się tak, że czas sublimacji będzie musiał zostać nieznacznie dostosowany, aby to skompensować. Z tego powodu ważne jest, aby monitorować ilość matrycy poddawanej sublimacji po każdym eksperymencie, aby zapewnić spójność osadzania matrycy między szkiełkami
5. Jeżeli rozkład i ilość sublimowanej matrycy jest wystarczająca, przykleić nowy szkiełko z tkanką do wnętrza sublimatora i powtórzyć czynności opisane w sekcji 3.
   UWAGA: Dla celów kontroli jakości (QC) ilość sublimowanej matrycy można zmierzyć po każdym eksperymencie, ważąc szkiełko przed i po sublimacji i dzieląc wagę sublimowanej matrycy przez pole powierzchni szkiełka ², należy zauważyć, że ze względu na brak precyzji większości skal powyżej 4 miejsc po przecinku i zmienność między skalami, pomiary te powinny być stosowane wyłącznie jako wskazówka dla optymalnego osadzania matrycy, a nie jako w pełni kwantyfikowalny sposób kontroli jakości, chyba że używana jest waga o wysokiej precyzji (patrz rysunek 3).

4. Magazynowanie/nawadnianie tkanek

1. Po sublimacji przechowuj szkiełka w szczelnie zamkniętym pojemniku lub małej kasecie w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.
2. Inkubować szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez 2 godziny lub przez noc.
   UWAGA: Celem procesu zamrażania jest działanie jako etap rehydratacji w celu desorpcji materiałów tkankowych do matrycy. Wykazano również, że proces zamrażania zapobiega degradacji sygnałów lipidowych przez okres do 1 tygodnia, gdy jest przechowywany w temperaturze -80 °C ¹². Z tego powodu czas przechowywania próbek w zamrażarce może być do pewnego stopnia zróżnicowany, aby dostosować go do potrzeb eksperymentatora bez znaczącej zmiany detekcji sygnału (jak zaobserwowano w naszym laboratorium). Zauważyliśmy jednak pewne odbarwienia matrycy, gdy próbki są zamrażane na dłużej niż 24 godziny w temperaturze -20 °C. Dlatego zalecamy obrazowanie sublimowanej tkanki przed tym czasem lub przechowywanie tkanki w temperaturze -80 °C przez dłuższe okresy inkubacji.
3. Wyjmij szkiełka z zamrażarki (i pojemnika) i umieść w eksykatorze na 5 - 10 minut.

5. Obrazowanie i analiza

1. Wyjmij szkiełka z eksykatora i zastosuj wzorce instrumentu, aby zapewnić dokładność masy instrumentu MALDI podczas obrazowania. Rodzaj norm będzie się różnić w zależności od oprzyrządowania. Wzorce są zazwyczaj nakładane równomiernie na całym szkiełku, otaczając tkankę, która ma być zobrazowana (ryc. 3D).
2. Włóż szkiełko do instrumentu MALDI i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi eksperymentów obrazowych (metody przyrządu powinny być zoptymalizowane dla zakresu mas 1,000 - 2,000). Reprezentatywny wynik (ryc. 4) uzyskano w trybie negatywu reflektronowego z rastrem 70 μm i 20 ujęciami/widmo (czas akwizycji ~ 2 h).

Po zakończeniu eksperymentu sublimacji, dwie połówki szklanego aparatu są oddzielane w dygestoriach, a szkiełko, przyklejone taśmą do kondensatora, może zostać usunięte (Rysunek 3A). W tym momencie szkiełko powinno zostać sprawdzone pod kątem nierównomiernego rozkładu matrycy, a czas, temperatura lub umieszczenie aparatu w kąpieli piaskowej mogą wymagać dostosowania do następnego slajdu. Udany eksperyment sublimacyjny DAN spowoduje równomierne pokrycie szaro-brązowej matrycy wzdłuż powierzchni szkiełka, gdzie cechy anatomiczne tkanki mogą być wyraźnie uwidocznione, a ilość matrycy na szkiełku jest podobna do ilości na tkance (ryc. 3B). Na przykład, jeśli zbyt dużo matrycy zostało sublimowane na tkance, grubość matrycy pokryje cechy tkanki i będzie można dostrzec tylko ogólny kształt. Jeśli jednak sublimacji podda się zbyt mała ilość matrycy, tkanka będzie miała ciemniejszy wygląd niż reszta szkiełka (ryc. 3C). Zarówno za dużo, jak i za mało matrycy będzie skutkowało słabym sygnałem w instrumencie MALDI. W celu kontroli jakości Thomas i in. zważyli ilość matrycy osadzonej na szkiełku i podzielili wagę przez powierzchnię szkiełka. Stwierdzili optymalną ilość osadzania matrycy dla kilku matryc, w tym DAN (110 μg/cm²) 2. Chociaż większość wag nie ma precyzji potrzebnej do powtórzenia takich wyników, wypróbowaliśmy tę metodę kontroli jakości; jednakże, ze względu na wysoki stopień zmienności, możemy jedynie zalecić odpowiedni zakres osadzania matrycy, który okazał się powiązany z udanymi i nieudanymi eksperymentami sublimacyjnymi z matrycą DAN, określony przez detekcję sygnału w instrumencie. Pomiar matrycowy poniżej 100 μg/cm² wiązał się z "zbyt małymi" warunkami matrycy, podczas gdy pomiar powyżej 140 μg/cm² był związany z "zbyt dużymi". Stwierdzono, że osadzanie matrycy między 100 a 140 μg/cm² jest optymalną wielkością do obrazowania za pomocą matrycy DAN. Wzorce kalibracyjne powinny być nanoszone na szkiełko podstawowe wokół próbek tkanek, aby zapewnić dokładność masową wykrytych sygnałów IMS (rysunek 3D)

W eksperymencie IMS MALDI obraz molekularny pozwala na wizualizację przestrzennego rozkładu interesującego analitu wraz z nieznanymi gatunkami, które mogą być obecne w danym zakresie masy. Obrazy molekularne gangliozydów w tym eksperymencie zostały nałożone za pomocą oprogramowania ImageJ, aby pokazać anatomiczny rozkład kilku gatunków gangliozydów w korowych i podkorowych obszarach mózgu szczura (Figura 4A). Najliczniejszymi gangliozydami w mózgu są gatunki serii A GD1a i GM1, ale zawierają również gangliozydy GM2 i GM3, które można znaleźć w zakresie mas 1000-2000 m / z, wyższym zakresie masowym niż większość powszechnych lipidów mózgowych, dzięki czemu te gangliozydy są łatwe do zidentyfikowania w całym spektrum (Figura 4B). Obfitość jonów każdego gatunku gangliozydów może być wykorzystana do częściowego ilościowego określenia różnic lub zmian w gatunkach gangliozydów na tym samym obrazie. Ponieważ w IMS nie można uniknąć pewnej zmienności w przygotowaniu próbek, porównania między skanami są uważane za półilościowe.

Rysunek 3. DAN Sublimacja. Reprezentatywne wyniki sublimacji matrycy DAN na tkance mózgowej szczura. (A) Po zakończeniu sublimacji, dwie połówki aparatu są rozdzielane, a szkiełko jest wyjmowane z kondensatora. (B) Macierz DAN rozprowadza się równomiernie na wielu skrawkach tkanki mózgowej szczura na powierzchni szkiełka, aby umożliwić uzyskanie wysoce powtarzalnych wyników (między 100 - 150 μg/cm²). (C) Przykłady nieudanych eksperymentów sublimacyjnych, w których zdeponowano zbyt mało matrycy (po lewej - <90 μg/cm²) lub za dużo matrycy (po prawej - >150 μg/cm²). Zbyt mała ilość matrycy spowoduje niewystarczającą desorpcję analitów, natomiast zbyt duża matryca nie pozwoli laserowi wniknąć w tkankę podczas akwizycji, co spowoduje detekcję niskich ilości jonów. (D) Szkiełko zawierające skrawki tkanki mózgowej szczura sublimowane matrycą DAN i zastosowanymi wzorcami kalibracyjnymi jest gotowe do wprowadzenia do instrumentu MALDI w celu obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. MALDI IMS gangliozydów w mózgu szczura. Reprezentatywny obraz molekularny MALDI IMS i widmo masowe gangliozydów w mózgu szczura po sublimacji matrycą DAN. Obraz molekularny jest złożeniem wielu gatunków gangliozydów w widmie, nałożonych i pseudokolorowanych przy użyciu oprogramowania Image J, aby pokazać unikalne anatomiczne rozmieszczenie gatunków gangliozydów w mózgu. Reprezentowane są gatunki GM1d18:1 (czerwony, masa ~1,547 Da), GM1d20:1 (zielony, masa ~1,573 Da), GM3d18:1 (niebieski, masa ~1,178 Da) i GM3d20:1 (turkusowy, masa ~1,207 Da). Widmo masowe pokazuje obfitość jonową analitów w zakresie mas 1,000 - 2,000. Główne gangliozydy serii A są oznaczone wzdłuż spektrum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.