Sublimacja matrycy DAN do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w tkance mózgowej szczura do obrazowania MALDI Spektrometria mas

Podsumowanie

Przedstawiono protokół sublimacji matrycy DAN na tkankę mózgową szczura w celu wykrycia gangliozydów za pomocą spektrometrii mas obrazowania MALDI.

Streszczenie

Przygotowanie próbki jest kluczem do optymalnego wykrywania i wizualizacji analitów w eksperymentach IMS z obrazowaniem laserowym wspomaganym desorpcją/jonizacją (MALDI). Określenie odpowiedniego protokołu, którego należy przestrzegać w całym procesie przygotowania próbki, może być trudne, ponieważ każdy krok musi być zoptymalizowany pod kątem zgodności z unikalnymi cechami analitów będących przedmiotem zainteresowania. Proces ten obejmuje nie tylko znalezienie kompatybilnej matrycy, która może skutecznie desorbować i jonizować interesujące cząsteczki, ale także wybór odpowiedniej techniki osadzania matrycy. Na przykład technika osadzania na mokro matrycy, która polega na rozpuszczeniu matrycy w rozpuszczalniku, jest lepsza w przypadku desorpcji większości białek i peptydów, podczas gdy techniki osadzania na suchej matrycy są szczególnie skuteczne w przypadku jonizacji lipidów. Sublimacja została opisana jako wysoce wydajna metoda osadzania na sucho w celu wykrywania lipidów w tkance przez MALDI IMS ze względu na jednorodność osadzania kryształów matrycy i minimalną delokalizację analitu w porównaniu z wieloma metodami osadzania na mokro ^1,2. Ogólnie rzecz biorąc, polega na umieszczeniu próbki i sproszkowanej matrycy w zamkniętej próżniowo komorze, w której próbki są dociśnięte do zimnej powierzchni. Aparat jest następnie zanurzany w podgrzewanej kąpieli (piasek lub olej), w wyniku której następuje sublimacja sproszkowanej matrycy na schłodzoną powierzchnię próbki tkanki. W tym miejscu opisujemy protokół sublimacji z wykorzystaniem matrycy 1,5-diaminonaftalenu (DAN) do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w mózgu szczura za pomocą MALDI IMS.

Wprowadzenie

Obrazowanie spektrometrią mas (IMS) z wykorzystaniem desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI) staje się niezwykle pożągną techniką wizualizacji przestrzennego rozkładu lipidów, peptydów i białek na powierzchniach nienaruszonych próbek. MALDI IMS znane było wcześniej jako technika analityczna dla wcześniej oczyszczonych analitów, jednak w ostatnich latach przyciąga uwagę w wielu innych dyscyplinach ze względu na możliwość połączenia dokładności spektrometrii mas z wysoką rozdzielczością punktów odniesienia wizualnych/anatomicznych bez konieczności stosowania zewnętrznego znakowania. Wraz ze wzrostem liczby naukowców wykorzystujących tę technikę, rośnie zapotrzebowanie na standaryzowane, łatwe do naśladowania protokoły, które pomogłyby w opracowaniu i optymalizacji eksperymentów IMS. Gangliozydy, grupa lipidów błonowych występujących w dużym stężeniu w ośrodkowym układzie nerwowym, są idealne do eksperymentów MALDI IMS, ponieważ ich lokalizacja wewnątrz błony sprawia, że niektóre gatunki są niemożliwe do wykrycia przy użyciu konwencjonalnego znakowania immunologicznego. Dodatkowo wykazaliśmy za pomocą MALDI IMS, że lipidy te, pełniące między innymi funkcje modulatorów sygnalizacji komórkowej, wykazują w zdrowym mózgu gryzoni unikalne wzorce rozkładu anatomicznego, które ulegają zmianie po urazie mózgu ^3,4,5. Gangliozydy charakteryzują się wyższym zakresem mas w porównaniu z większością gatunków lipidów, przez co są najlepiej dostosowane do platformy obrazowania MALDI.

Rycina 1: Schemat eksperymentu MALDI IMS. Schemat ogólnego przebiegu eksperymentu MALDI IMS z wykorzystaniem sublimacji. Tkanka zamrożona w temperaturze -80 °C poddawany jest kriosekcjonowaniu w kriostacie i 10 µm przekroje są montowane po rozmrożeniu na przewodzących szkiełkach ITO. Następnie szkiełko umieszcza się w deskryptyku do momentu sublimacji. Szkiełka wprowadza się do aparatu do sublimacji, a na powierzchnię próbki tkanki nakłada się równomierną warstwę matrycy. Próbki są mrożone przez noc w -20 °C zamrażarka, a następnie umieszczone w eksykatorem na 10 min. Po naniesieniu standardów próbki są wprowadzane do instrumentu MALDI, w którym laser jest kierowany na tkankę, powodując jonizację desorbujących się cząsteczek w matrycy. Jony przemieszczają się w rurce wylotowej i rozdzielają się na podstawie swojej masy (czas przelotu/TOF), aż dotrą do detektora. Informacje o obfitości jonowej analitów w określonym zakresie stosunku masy do ładunku (m/z) są prezentowane w formie obrazu molekularnego oraz widma masowego. Dane te mogą być wykorzystane zarówno do wizualizacji, jak i do ilościowego oznaczenia obfitości jonowej interesującego analitu w obrazowanej tkance. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Przygotowanie próbek do MALDI IMS jest bardzo zróżnicowane, ponieważ każdy etap procesu musi być dostosowany do analizowanych substancji. Charakterystyczną cechą eksperymentów opartych na metodzie MALDI jest zastosowanie powłoki matrycy naniesionej na powierzchnię próbki przed analizą. Oprócz roli pochłaniania i przekazywania energii promieniowania z lasera podczas procesu ablacji, matryca służy również do izolowania poszczególnych analitytów z próbki, co ułatwia analizę interesujących związków ^6,7. Homogeniczne naniesienie matrycy na powierzchnię próbki jest najistotniejszym etapem procesu przygotowania próbki. Nieprawidłowe nanoszenie matrycy może prowadzić do powstania dużych, heterogenicznych kryształów matrycy oraz pojawienia się artefaktów, niskiego sygnału jonowego i słabej powtarzalności ⁷.

Ze względu na powinowactwo określonych macierzy do izolowania konkretnych analitów, rodzaj macierzy wybranej do eksperymentu może znacząco wpłynąć na wynik. Macierze stosowane do obrazowania białek i peptydów często różnią się od tych używanych do obrazowania lipidów, a proces ten jest dodatkowo komplikowany przez konieczność przeprowadzenia dodatkowych procedur, takich jak etapy płukania i rehydratacji, w celu skutecznego wykrycia sygnałów z tkanki. Chociaż istnieją etapy płukania służące wzmocnieniu sygnałów lipidowych ⁸, nie są one warunkiem koniecznym do wykrycia większości gatunków lipidów. Przy wyborze macierzy do eksperymentu z obrazowaniem lipidów należy wziąć pod uwagę polarność interesującego nas lipidu, co pozwoli zawęzić zakres odpowiednich macierzy. Na przykład gangliozydy zawierają reszty kwasu sialowego, które nadają im ogólną polarność ujemną. Istnieje szereg macierzy, które mogą skutecznie desorbować i jonizować gangliozydy z tkanki; jednak należy uwzględnić takie czynniki, jak piki pochodzące z macierzy w widmie oraz stabilność macierzy w próżni. Macierz 1,5-diaminonaftalenu (DAN) jest wystarczająco stabilna w warunkach próżni instrumentu dla większości zastosowań w obrazowaniu, wykazuje wysoki stopień czułości w desorpcji lipidów i może być stosowana do analizy lipidów zarówno w dodatnim, jak i ujemnym trybie jonów ². Macierz DAN, w porównaniu z innymi macierzami o powinowactwie do lipidów ujemnych, takimi jak kwas dihydroksybenzoowy (DHB), 9-aminoakrydyna (9-AA) i 5-chloro-2-merkaptobenzotiazol (CMBT), była w stanie najskuteczniej desorbować gangliozydy z tkanki mózgowej szczura w ujemnym trybie jonów (manuskrypt w przygotowaniu).

Wybór odpowiedniej metody nanoszenia matrycy jest równie istotny, co wybór samej matrycy. Metody mokrego nanoszenia matrycy, w których stała matryca jest rozpuszczana w rozpuszczalniku organicznym i nanoszona za pomocą pneumatycznych lub zautomatyzowanych natrysków bądź aplikatorów punktowych, są szczególnie skuteczne w przypadku desorpcji białek i peptydów, ponieważ ciecz przenika do próbki, umożliwiając ekstrakcję związków i współkrystalizację z matrycą. Chociaż techniki te mogą być również stosowane w analizach lipidów, często dochodzi do delokalizacji analitów i nierównomiernego tworzenia się kryształów matrycy ze względu na wysoką zawartość i rozpuszczalność lipidów w rozpuszczalnikach, szczególnie w tkankach ^2,9. Ponieważ lipidy łatwo ulegają jonizacji z tkanki, techniki suchego nanoszenia matrycy, takie jak sublimacja, stanowią prostą i kosztowo efektywną alternatywę dla natrysków, pozwalając jednocześnie uniknąć wielu wad tych metod. Sukces sublimacji w eksperymentach MALDI IMS przypisuje się takim cechom jak mikrokrystaliczna morfologia matrycy, która zwiększa powierzchnię wiązania matrycy z analitem, zwiększona czystość matrycy oraz homogeniczne nanoszenie, co prowadzi do wyższej powtarzalności w porównaniu z technikami mokrymi ^1,10.

Sublimacja polega na ogrzewaniu sproszkowanej matrycy w próżni bezpośrednio pod ochłodzoną powierzchnią próbki, co prowadzi do przejścia matrycy ze stanu stałego w fazę gazową, a następnie do jej osadzania się na powierzchni próbki tkanki. Podczas sublimacji proces osadzania matrycy można kontrolować poprzez zmianę takich czynników jak czas, temperatura i ciśnienie, aby uzyskać wysoce powtarzalne wyniki. Pojedynczy eksperyment sublimacyjny może trwać od 5 do 20 min, w zależności od wybranego rodzaju matrycy, którą można wykorzystać kilkukrotnie przed utylizacją. Aparatura może być zakupiona komercyjnie za ułamek ceny zautomatyzowanych natryskiwaczy i jest łatwo demontowalna w celu czyszczenia i konserwacji. Niski koszt i względna prostota tej techniki osadzania matrycy sprawiają, że jest ona idealna dla badaczy rozpoczynających lub rozszerzających zastosowania obrazowania lipidów w MALDI IMS. Chociaż w literaturze opisano protokoły sublimacji tkanek dla IMS ¹, istnieje niewiele standaryzowanych procedur skupiających się na podstawowym przebiegu eksperymentu sublimacyjnego w celu obrazowania lipidów o wysokiej masie w trybie jonów ujemnych, co utrudnia wdrożenie tej techniki bez szeroko zakrojonych prób i błędów. Poniższy protokół eksperymentalny ma na celu wypełnienie tej luki w zakresie sublimacji matrycy DAN na skrawki mózgu szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości obrazowania i detekcji gangliozydów.

Rysunek 2: Aparatura do sublimacji. Fotografia (A) oraz schemat (B) aparatury do sublimacji. Pompa próżniowa jest połączona za pomocą gumowego wężyka z pułapką zimna wypełnioną 30 ml etanolu. Pułapka zimna jest następnie połączona gumowym wężykiem z aparaturą do sublimacji. Aparatura składa się z dwóch oddzielnych elementów szklanych, które są uszczelnione za pomocą metalowego złącza w kształcie litery U. Górna część sublimatora zawiera kondensator wypełniony mieszanką lodu z wodą. Płytka z próbką jest przyklejona taśmą do dna kondensatora, wewnątrz uszczelnionej aparatury szklanej. Dolna część aparatury do sublimacji zawiera matrycę DAN, rozłożoną równomiernie przodem do płytki z próbką. Podczas sublimacji aparaturę szklaną umieszcza się na łaźni piaskowej nagrzanej do 140 °C przez płytkę grzewczą umieszczoną bezpośrednio pod nim. Sonda temperatury pomaga utrzymać stabilną temperaturę w trakcie całego eksperymentu sublimacyjnego dzięki sprzężeniu zwrotnemu temperatury kąpieli piaskowej w odniesieniu do temperatury zadanej dla eksperymentu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Protokół

Wszystkie procedury postępowania ze zwierzętami opisane poniżej są zgodne z zaleceniami komitetu ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Zachodniego Ontario (2016-014).

1. Przygotowanie i sekcja tkanek

1. Wyodrębnij tkankę mózgową od szczura w procesie znanym jako "Fresh Frozen Extraction" (FFE).
   1. Poddaj szczura eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu sodu i monitoruj odruchy w kończynach. Gdy wszystkie odruchy ustaną, odetnij głowę szczura za pomocą gilotyny.
   2. Ostrożnie oddziel mięśnie i inne tkanki od czaszki za pomocą skalpela. Użyj kleszczy do cięcia kości, aby rozbić czaszkę, aby odsłonić mózg, zaczynając od podstawy czaszki (otwór wielki) do przedniej części.
   3. Gdy mózg zostanie odsłonięty, ostrożnie zgarnij go szpatułką chirurgiczną i natychmiast umieść na pokruszonym suchym lodzie w celu błyskawicznego zamrożenia.
      UWAGA: Mózg będzie bardzo plastyczny. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas umieszczania mózgu na suchym lodzie. Jeśli mózg zostanie zmiażdżony lub przyciśnięty do powierzchni, zmieni swój kształt i zamarznie w tej pozycji.
2. Wyjąć świeżo zamrożoną tkankę (nie przesiąkniętą formaldehydem ani nie zatopioną w OCT) z zamrażarki o temperaturze -80°C i umieścić na suchym lodzie.
3. Umieść kilka kropli wody na uchwycie kriostatu i umieść na suchym lodzie lub kostce do zamrażania kriostatu. Lekko dociśnij tkankę do uchwytu kriostatu, gdy zacznie zamarzać i przytrzymaj, aż woda zamarznie wokół podstawy tkanki i zakotwiczy ją na miejscu. W razie potrzeby dodaj więcej wody, aby dodatkowo zabezpieczyć chusteczkę na uchwycie.
   UWAGA: Do mocowania tkanki zamiast pożywki OCT używa się wody, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanki związkami, które mogą wpływać na wykrywanie pożądanego sygnału.
4. Umieść tkankę w kriostacie. Przekrój tkankę do pożądanej lokalizacji anatomicznej. Upewnij się, że grubość cięcia wynosi od 8 do 12 μm.
   UWAGA: Podczas cięcia tkanek w komunalnych urządzeniach kriostatowych konieczne jest stosowanie oddzielnych materiałów, takich jak ostrza, szczotki, stabilizatory i uchwyty, aby uniknąć zanieczyszczenia związkami osadzającymi. Wnętrze kriostatu należy również dokładnie wyczyścić etanolem przed użyciem.
5. Za pomocą stabilizatora kriostatu powoli przecinaj spłaszczone odcinki tkanek. lub ślady na tkance mogą wystąpić, jeśli umieszczenie pałąka jest nieprawidłowe lub ostrze jest. Przesuń chusteczkę na środek platformy do krojenia za pomocą czystych pędzli.
6. Montażu
   1. Zamroź szkiełka przewodzące lub metalowe płytki, umieszczając je w kriostacie podczas krojenia. Gdy szkiełko jest całkowicie zamrożone, ostrożnie przesuń podzieloną tkankę na przewodzącą powierzchnię szkiełka za pomocą czystych pędzli. Gdy wszystkie skrawki tkanki zostaną prawidłowo umieszczone na szkiełku, umieść palec pod szkiełkiem, naprzeciwko tkanki i dociśnij, aż sekcja się rozmrozi.
      UWAGA: Sekcje mogą się składać lub zwijać podczas procesu rozmrażania przy użyciu tej metody montażu. Można to zmniejszyć, utrzymując szkiełko w kriostacie podczas rozmrażania tkanki. Jeśli te problemy staną się problematyczne, poniżej wymieniono alternatywną metodę montażu na gorąco.
   2. Alternatywnie, weź szkiełko z tlenku indu i cyny (ITO) o temperaturze pokojowej (lub metalową płytkę) i lekko dociśnij zamrożoną część tkanki na powierzchni platformy do krojenia, przewodzącą stroną do dołu. Doprowadzi to do równomiernego rozmrożenia wycinka tkanki na powierzchni szkiełka przy niewielkim zwijaniu lub fałdowaniu tkanki.
      UWAGA: Podczas montażu tą metodą pod sekcją może pojawić się kondensacja, która może prowadzić do utraty niektórych białek i lipidów.
7. Umieścić szkiełka z chusteczką w eksykatorze na 5 - 10 minut.

2. Konfiguracja aparatury sublimatora

UWAGA: Wykonaj te kroki w dygestorium.

1. Umieść kąpiel piaskową w aluminiowym pojemniku na płycie grzejnej, tak aby płyta grzejna znajdowała się na metalowym podnośniku nożycowym o odpowiedniej powierzchni (tj. większej niż płyta grzejna). Włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 140 °C.
   UWAGA: Temperatura topnienia matrycy DAN wynosi od 187 do 190 °C. Nie przekraczaj tej temperatury na płycie grzejnej.
   1. Jeśli płyta grzejna jest wyposażona w sondę sprzężenia zwrotnego temperatury, użyj jej do monitorowania temperatury piasku przez cały czas trwania eksperymentu i zapewnienia stałej temperatury. Ta funkcja może pomóc w odtwarzalności eksperymentów w różnych eksperymentach sublimacyjnych.
      UWAGA: Kąpiel piaskowa powinna znajdować się w aluminiowym pojemniku, ponieważ szklany pojemnik może pęknąć w wysokich temperaturach.
2. Umieścić 300 mg matrycy DAN na dolnej powierzchni aparatu sublimacyjnego. Umieść matrycę na środku aparatu i rozłóż równą warstwą na przybliżonej szerokości i długości sublimowanego szkiełka.
   UWAGA: Macierz DAN jest toksyczna. Dlatego ważne jest, aby podczas pracy ze sproszkowaną matrycą zawsze nosić rękawice, maski i okulary ochronne. DAN powinien być przechowywany w ciemności, ponieważ jest wrażliwy na światło.
3. Przyklej metalową płytkę do wewnętrznej powierzchni aparatu, tak aby płytka miała bezpośredni kontakt z dnem skraplacza w celu zapewnienia równomiernego rozprowadzenia chłodzenia temperaturowego na całej powierzchni szkiełka podczas sublimacji. Alternatywnie przeszlifuj spód skraplacza, aby zapewnić płaską powierzchnię.
   1. Umieść taśmę wzdłuż zewnętrznych krawędzi płyty i przyklej do boków wewnętrznego szkła. Jeśli taśma zostanie umieszczona pod płytą i przylega do dolnej części wewnętrznej powierzchni szkła, rozkład temperatury może nie być równomierny i może spowodować nierównomierne rozprowadzenie matrycy na powierzchni szkiełka.
   2. Przyklej półfabrykat (testowy) szkiełko po przekątnej po powierzchni metalowej płytki z taśmą ponownie umieszczoną na zewnętrznych krawędziach szkiełka.
4. Połącz górną i dolną część urządzenia za pomocą gumowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym pośrodku, aby zapewnić pełne uszczelnienie.
5. Umieść metalowy przegub w kształcie litery U wokół środka aparatu i dokręć imadła, aż górna i dolna połowa aparatu zostaną szczelnie ze sobą połączone. Umieść w metalowym O-ringu nad kąpielą piaskową.
6. Weź garść pokruszonego lodu i umieść go w skraplaczu. Napełnij skraplacz od 1/4 do 1/2 zimną wodą, aby utworzyć lodową breję. Błoto pośniegowe ochłodzi metalową płytkę po wewnętrznej stronie aparatu, a następnie przylgnie do niej szkiełko. Odczekaj co najmniej 5 minut, aż temperatura osiągnie stan ustalony.
7. Wlej 300 ml etanolu do pojemnika wymrażarki i umieść w nim szkło. Wrzuć 2-3 małe kawałki suchego lodu do etanolu na dnie pojemnika wymrażarki. Wejście wymrażarki ma szklaną rurkę biegnącą do dna cylindra, podczas gdy wyjście nie.
8. Podłącz pompę próżniową do wyjścia wymrażarki za pomocą gumowej rurki. Użyj innego kawałka gumowej rurki, aby podłączyć wejście wymrażarki do aparatu sublimacyjnego. Upewnij się, że rurka jest szczelnie zabezpieczona za pomocą metalowych clamps, jeśli są dostępne.
9. Użyj pompy próżniowej, aby dostarczyć próżnię 30 - 50 mT. Pozwól pompie pracować przez co najmniej 5 minut w celu zrównoważenia ciśnienia. Imadła na pierścieniu U aparatu sublimacyjnego mogą wymagać ponownego dokręcenia po włączeniu pompy próżniowej z powodu zmniejszonego ciśnienia w aparacie.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przymocowanie wakuometru do pompy w celu monitorowania ciśnienia próżni podczas eksperymentu i testowania nieszczelności ciśnienia w celu osiągnięcia najwyższej możliwej powtarzalności między eksperymentami. Jednak większość pomp jest zaprojektowana tak, aby utrzymywać stałe ciśnienie, dlatego manometr może nie być niezbędny dla doświadczonych użytkowników. Dodatkowo można zastosować smar do uszczelnień próżniowych, aby pomóc w utrzymaniu podciśnienia.

3. Sublimacja

1. Upewnij się, że temperatura łaźni piaskowej ustabilizowała się na poziomie 140 °C i że urządzenie jest zamocowane w metalowym pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym nad kąpielą piaskową z podłączonymi wszystkimi rurkami i włączonym próżnią.
2. Ustaw minutnik na 7 minut, ale nie uruchamiaj timera. Powoli podnieś podnośnik nożycowy i kąpiel piaskową do aparatu sublimacyjnego, aż złącze w kształcie litery U sublimatora znajdzie się znacznie powyżej metalowego O-ringu. Ta dodatkowa przestrzeń pozwala na regulację aparatu na piasku.
   1. Szybko delikatnie dociśnij sublimator do powierzchni piasku, aby upewnić się, że urządzenie jest równomiernie osadzone na piasku, a następnie natychmiast uruchom stoper.
3. Gdy zabrzmi timer, wyłącz pompę próżniową i ostrożnie opuść podnośnik nożycowy, aż sublimator przestanie dotykać kąpieli piaskowej i będzie bezpiecznie osadzony w metalowym pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym.
   1. Powoli poluzuj zawór mikroodpowietrzający, aby uwolnić ciśnienie w aparacie. Poluzuj metalowy zacisk wokół gumowej rurki aparatu sublimacyjnego i powoli zacznij luzować rurkę. Po lekkim poluzowaniu gumowej rurki zegnij rurkę na bok, aby umożliwić ucieczkę ciśnienia resztkowego.
   2. Gdy ciśnienie otoczenia powróci, ostrożnie wyjmij gumową rurkę z aparatu sublimacyjnego.
4. Poluzuj imadła na przegubie w kształcie litery U urządzenia i wyjmij. Ostrożnie oddziel dwie połówki aparatu do sublimacji i zdejmij szkiełko z górnej części wewnętrznego szkła. Sprawdź slajd, aby potwierdzić równomierny rozkład macierzy.
   UWAGA: Jeśli matryca jest nierówna, sproszkowaną matrycę na dnie sublimatora można przestawić lub aparat sublimatora można umieścić w piasku na następny slajd. Proces sublimacji można powtórzyć kilka razy przy użyciu tej samej matrycy, jednak matryca ostatecznie stanie się ciemniejsza od wielokrotnej ekspozycji na ciepło, a ilość proszku zmniejszy się tak, że czas sublimacji będzie musiał zostać nieznacznie dostosowany, aby to skompensować. Z tego powodu ważne jest, aby monitorować ilość matrycy poddawanej sublimacji po każdym eksperymencie, aby zapewnić spójność osadzania matrycy między szkiełkami
5. Jeżeli rozkład i ilość sublimowanej matrycy jest wystarczająca, przykleić nowy szkiełko z tkanką do wnętrza sublimatora i powtórzyć czynności opisane w sekcji 3.
   UWAGA: Dla celów kontroli jakości (QC) ilość sublimowanej matrycy można zmierzyć po każdym eksperymencie, ważąc szkiełko przed i po sublimacji i dzieląc wagę sublimowanej matrycy przez pole powierzchni szkiełka ², należy zauważyć, że ze względu na brak precyzji większości skal powyżej 4 miejsc po przecinku i zmienność między skalami, pomiary te powinny być stosowane wyłącznie jako wskazówka dla optymalnego osadzania matrycy, a nie jako w pełni kwantyfikowalny sposób kontroli jakości, chyba że używana jest waga o wysokiej precyzji (patrz rysunek 3).

4. Magazynowanie/nawadnianie tkanek

1. Po sublimacji przechowuj szkiełka w szczelnie zamkniętym pojemniku lub małej kasecie w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.
2. Inkubować szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez 2 godziny lub przez noc.
   UWAGA: Celem procesu zamrażania jest działanie jako etap rehydratacji w celu desorpcji materiałów tkankowych do matrycy. Wykazano również, że proces zamrażania zapobiega degradacji sygnałów lipidowych przez okres do 1 tygodnia, gdy jest przechowywany w temperaturze -80 °C ¹². Z tego powodu czas przechowywania próbek w zamrażarce może być do pewnego stopnia zróżnicowany, aby dostosować go do potrzeb eksperymentatora bez znaczącej zmiany detekcji sygnału (jak zaobserwowano w naszym laboratorium). Zauważyliśmy jednak pewne odbarwienia matrycy, gdy próbki są zamrażane na dłużej niż 24 godziny w temperaturze -20 °C. Dlatego zalecamy obrazowanie sublimowanej tkanki przed tym czasem lub przechowywanie tkanki w temperaturze -80 °C przez dłuższe okresy inkubacji.
3. Wyjmij szkiełka z zamrażarki (i pojemnika) i umieść w eksykatorze na 5 - 10 minut.

5. Obrazowanie i analiza

1. Wyjmij szkiełka z eksykatora i zastosuj wzorce instrumentu, aby zapewnić dokładność masy instrumentu MALDI podczas obrazowania. Rodzaj norm będzie się różnić w zależności od oprzyrządowania. Wzorce są zazwyczaj nakładane równomiernie na całym szkiełku, otaczając tkankę, która ma być zobrazowana (ryc. 3D).
2. Włóż szkiełko do instrumentu MALDI i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi eksperymentów obrazowych (metody przyrządu powinny być zoptymalizowane dla zakresu mas 1,000 - 2,000). Reprezentatywny wynik (ryc. 4) uzyskano w trybie negatywu reflektronowego z rastrem 70 μm i 20 ujęciami/widmo (czas akwizycji ~ 2 h).

Wyniki

Po zakończeniu eksperymentu z sublimacją, dwie połowy szklanego aparatu są rozdzielane w dygestorium, a przyklejone do kondensatora szkiełko może zostać wyjęte (Rysunek 3A). Na tym etapie należy zbadać szkiełko pod kątem nierównomiernego rozmieszczenia matrycy; czas, temperatura lub ułożenie aparatury w łaźni piaskowej mogą wymagać korekty przy kolejnym szkiełku. Pomyślny eksperyment z sublimacją DAN skutkuje równomierną powłoką szaro-brązowej matrycy na powierzchni szkie...

Dyskusja

Praca ta szczegółowo opisuje znormalizowany protokół sublimacji matrycy na tkance w celu wykrywania ujemnie naładowanych lipidów, takich jak gangliozydy, w eksperymentach MALDI IMS. Przygotowanie próbki do MALDI IMS jest bardzo zmienne i musi być dostosowane do unikalnych właściwości badanego analitu. Nakładanie matrycy na powierzchnię próbki tkanki jest kluczowym aspektem procesu przygotowania próbki w odniesieniu do jakości wyników w IMS. Szczególną ostrożność należy zachować przy doborze matryc, upewniając się, że mat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sublimator	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
Matryca 1,5-diaminonaptalenu (DAN)	Sigma-Aldrich	D21200	100 gramów
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
Płyta grzejna ze sprzężeniem zwrotnym	temperatury Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Podnośnik
ze stali nierdzewnej	Thermo-Fisher Scientific	2216479	10x10
próżniowa	Franklin Electric	1102180403	Dwustopniowe prowadnice Savant VP100
tlenku indu i cyny (ITO)	Hudson Surface Technology	PSI 1111000	typ II, 1,1 mm/25 każda
Instrument MALDI TOF/TOF 5800 Eksykator	AB Sciex
	Sigma-Aldrich	D2797

Pompa zbudowana na zamówienie z