Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55265

⸱

7 marca 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, 3Department of Physiology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste mają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania do wielu linii, co czyni je atrakcyjnym źródłem do generowania komórek progenitorowych trzustki, które mogą być wykorzystane do badań i przyszłego leczenia cukrzycy. W artykule przedstawiono czteroetapowy protokół różnicowania mający na celu generowanie komórek progenitorowych trzustki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Protokół ten można zastosować do wielu linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Podejście przyjęte do wygenerowania komórek progenitorowych trzustki polega na różnicowaniu hESC w celu dokładnego modelowania kluczowych etapów rozwoju trzustki. Rozpoczyna się to od indukcji ostatecznej endodermy, którą osiąga się poprzez hodowlę komórek w obecności aktywiny A, podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i CHIR990210. Dalsze różnicowanie i modelowanie za pomocą czynnika wzrostu fibroblastów 10 (FGF10) i Dorsomorphiny generuje komórki przypominające tylne jelito przednie. Dodatek kwasu retinowego, NOGGIN, SANT-1 i FGF10 różnicuje komórki tylnego jelita przedniego w komórki charakterystyczne dla endodermy trzustki. Wreszcie, połączenie naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), nikotynamidu i NOGGIN prowadzi do wydajnego wytwarzania komórek PDX1+/NKX6-1+. Cytometria przepływowa jest wykonywana w celu potwierdzenia ekspresji określonych markerów na kluczowych etapach rozwoju trzustki. Progenitorzy trzustki PDX1 + / NKX6-1 + pod koniec etapu 4 są zdolni do generowania dojrzałych komórek β po przeszczepieniu myszom z niedoborem odporności i mogą być dalej różnicowane w celu wytworzenia komórek produkujących insulinę in vitro. W związku z tym wydajne wytwarzanie komórek progenitorowych trzustki PDX1+/NKX6-1+, jak wykazano w niniejszym protokole, ma ogromne znaczenie, ponieważ stanowi platformę do badania rozwoju trzustki człowieka in vitro i stanowi źródło komórek o potencjale różnicowania się do komórek β, które ostatecznie mogłyby zostać wykorzystane w leczeniu cukrzycy.

Wprowadzenie

Częstość występowania cukrzycy wzrasta i według Kanadyjskiego Towarzystwa Diabetologicznego szacuje się, że ponad 11 milionów osób w Kanadzie ma cukrzycę lub stan przedcukrzycowy, przy czym 5-10% tych osób ma cukrzycę typu 1 (T1D)1. Cukrzyca typu 1 jest chorobą autoimmunologiczną, która jest spowodowana zniszczeniem β komórek produkujących insulinę, które znajdują się na wyspach Langerhans. Obecnie osoby żyjące z cukrzycą typu 1 wymagają egzogennych źródeł insuliny2. Pomimo postępów w insulinoterapii, pacjenci z cukrzycą typu 1 nadal mają trudności z regulacją poziomu glukozy we krwi i nadal cierpią zarówno na hipo- jak i hiperglikemię. Obiecującą formą leczenia w celu przywrócenia normoglikemii w cukrzycy typu 1 jest wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), które mogą być wykorzystane do wygenerowania nieograniczonej ilości komórek β produkujących insulinę zarówno in vivo, jak i in vitro3,4,5,6,7. Różnicowanie komórek hESC w komórki podobne do β może umożliwić badanie cukrzycy in vitro, co pozwoli na identyfikację nowych celów terapeutycznych w cukrzycy typu 2 i dostarczenie komórek do przeszczepów pacjentom z cukrzycą typu 1.

Najbardziej udaną próbą generowania komórek produkujących insulinę z hESC in vitro jest podsumowanie zdarzeń embrionalnych, które zachodzą podczas rozwoju trzustki4,5. Wiąże się to z manipulowaniem odrębnymi szlakami sygnałowymi w celu dokładnego modelowania kluczowych etapów rozwoju trzustki. Rozwój trzustki rozpoczyna się od indukcji ostatecznej endodermy, która charakteryzuje się ekspresją CXCR4 i CD117 (c-KIT)8,9. Precyzyjna regulacja ostatecznej organizacji endodermy jest wymagana do powstania cewy jelitowej, która następnie ulega ukształtowaniu od przodu do tyłu i brzuszno-grzbietowo. Grzbietowe i brzuszne zawiązki trzustki wyłaniają się z obszaru tylnego jelita przedniego, który wyraża gen homeoboksu trzustki i dwunastnicy (Pdx1), który jest niezbędny do rozwoju trzustki10. Pączki grzbietowe i brzuszne łączą się, tworząc trzustkę, która następnie ulega rozległej przebudowie i ekspansji nabłonka11. Przywiązaniu do linii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej towarzyszy wytwarzanie multipotencjalnych komórek progenitorowych (MPC), które wyrażają m.in. czynniki transkrypcyjne Pdx1, Nkx6.1 i Ptf1a12,13. MPC, które staną się komórkami endokrynnymi i przewodowymi, nadal wyrażają Nkx6-1, jednocześnie zmniejszając ekspresję Ptf1a. W przeciwieństwie do tego, komórki linii zewnątrzwydzielniczej stracą ekspresję Nkx6-1 i zachowają wyrażenie Ptf1a12.

Czynnik transkrypcyjny Nkx6-1 odgrywa kluczową rolę w rozwoju trzustki, szczególnie podczas różnicowania komórek progenitorowych endokrynnych do komórek β. Jak opisano wcześniej, delecja Nkx6-1 powoduje upośledzenie tworzenia komórek β podczas rozwoju trzustki14. Dlatego wytwarzanie komórek β produkujących insulinę zarówno in vitro, jak i in vivo wymaga skutecznej indukcji Nkx6-1.

Niedawno opracowaliśmy protokół do efektywnego generowania komórek progenitorowych trzustki PDX1+/NKX6-1+ z komórek progenitorowych hPSC. Te komórki progenitorowe trzustki pochodzące z hPSC generują dojrzałe komórki β po przeszczepieniu myszom z niedoborem odporności3. Protokół różnicowania można podzielić na 4 etapy charakterystyczne: 1) ostateczna indukcja endodermy, 2) wzorzec tylnego jelita przedniego, 3) specyfikacja trzustki i 4) indukcja NKX6-1. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis każdego etapu ukierunkowanego różnicowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie rozwiązań i mediów

UWAGA: Przygotuj wszystkie podłoża do hodowli komórkowej w sterylnym środowisku. Media muszą być natychmiast wyprodukowane i zużyte. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w tabeli materiałów.

  1. Zróżnicowane media
    1. Przygotuj pożywkę różnicującą dnia 0: Pożywka RPMI z 1% glutaminą, 2 μM CHIR 99021, 100 ng/ml aktywiny A, 104 M MTG.
    2. Przygotuj pożywkę różnicującą dzień 1-2: Pożywka RPMI z 1% glutaminą, 100 ng / ml aktywiny A, 104 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 μg / ml kwasu askorbinowego.
    3. Przygotuj pożywkę różnicującą dzień 3-5: Pożywka RPMI z 1% glutaminy, 1% B27, 104 M MTG, 0,75 μM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
    4. Przygotuj dzień 6-7 Pożywki różnicujące: DMEM z 1% glutaminą, 1% B27, 50 μg/ml Kwas askorbinowy, 50 ng/ml FGF10, 0,25 μM SANT-1, 2 μM Kwas retinowy, 50 ng/ml NOGGIN.
      UWAGA: Kwas retinowy należy dodać do podłoża na końcu, a podłoże należy chronić przed światłem, aby zapobiec degradacji oksydacyjnej15.
    5. Przygotuj dzień 8-12 Pożywki różnicujące: DMEM z 1% glutaminą, 1% B27, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 50 ng/ml NOGGIN, 100 ng/ml hEGF, 10 mM nikotynamidu.
  2. Przygotować bufor FACS: 10% FBS w PBS, minus wapń i magnez.

2. Zróżnicowanie HESC

UWAGA: HESC są rozmrażane, pasażowane i rozprowadzane na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych w obecności pożywki opartej na KOSR uzupełnionej bFGF16. HESC są gotowe do różnicowania, gdy komórki osiągną 80-95% konfluencji. W tym czasie kolonie powinny być duże z określonymi granicami i strukturą przypominającą kopułę (ryc. 1A). Cała hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskodennych płytkach poddanych hodowli tkankowej pokrytych 0,1% żelatyną. Zazwyczaj komórki hoduje się na płytkach 6- lub 12-dołkowych, w pożywkach o objętości odpowiednio 2 ml lub 1 ml.

  1. W dniu 0 rozpocznij różnicowanie, zastępując nośniki oparte na KOSR nośnikami różnicującymi dnia 0.
  2. W dniach 1 i 2 delikatnie potrząśnij płytką, aby usunąć wszelkie martwe komórki z monowarstwy przed aspiracją. Zastąp pożywką różnicującą dnia 1-2.
  3. W 3 dniu zbierz komórki do cytometrii przepływowej. Jeśli ekspresja komórek przekracza 90% CXCR4+/CD117+, przejdź do kroku 2.4.
  4. W dniach 3 i 5 delikatnie potrząśnij płytką, aby usunąć wszelkie martwe komórki z monowarstwy przed aspiracją. Zastąp pożywką różnicującą dnia 3-5.
  5. W dniach 6 i 7 zastąp je pożywką różnicującą z dnia 6-7.
  6. W dniach 8, 10 i 12 zastąp je pożywką różnicującą z dnia 8-12.
  7. W 13 dniu zbierz komórki do cytometrii przepływowej w celu określenia ekspresji PDX1 i NKX6-1.

3. Pobieranie komórek do analizy cytometrii przepływowej

  1. Zdysocjuj komórki za pomocą 1x komercyjnego roztworu trypsyny zgodnie z protokołem producenta i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  2. Usuń dostępny w handlu roztwór trypsyny i ponownie zawieś pojedyncze komórki w 1,000 μl buforze FACS z 30 μl DNazy I.
  3. Przefiltrować komórki za pomocą sitka z siatki nylonowej o grubości 35 μm i przenieść do probówki mikrowirówkowej.
  4. Odwirować komórki w temperaturze 455 x g przez 5 minut. Przygotować komórki do barwienia żywego lub utrwalonego.

4. Barwienie do cytometrii przepływowej

  1. Przygotowanie przepływu do barwienia na żywo w dniu 3
    1. Zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 1 000 μl. Przenieść 200 μl (około 1-3 x 105 komórek) do dwóch dołków 96-dołkowej płytki (zarówno dla próbek niebarwionych, jak i barwionych).
    2. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.
    3. Barwienie pierwszorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi, CXCR4:APC i CD117:PE (patrztabela M) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem.
    4. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.
    5. Zawiesić próbki w buforze FACS o pojemności 100 μl.
    6. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.
    7. Zawiesić każdą próbkę i przenieść w całkowitej objętości 300-500 μl buforu FACS do mikroprobówek o pojemności 1 ml lub probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml.
    8. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym17. Jeżeli nie można natychmiast uruchomić próbek, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Przygotowanie przepływu do trwałego barwienia w 13 dniu
    1. Zawiesić osad komórkowy w komercyjnym roztworze utrwalającym/przepuszczalnym przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    2. Odwirować próbkę o sile 455 x g przez 5 minut. Zawiesić w 400 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania (perm).
    3. Przenieść 200 μl próbki (około 0,5-1 x 106 komórek) do dwóch dołków 96-dołkowej płytki (do kontroli IgG i barwienia PDX1/NKX6-1). Wirować przy 931 x g przez 2 min.
    4. Zawiesić osady komórkowe w 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe lub kontrolne anty-PDX1 i anty-NKX6-1 (patrz tabela materiałów). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki. Zawiesić próbki w 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania.
    6. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.
    7. Zawiesić próbki w 100 μl trwałej ondulacji/przemywania zawierającej przeciwciała drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chroniąc przed światłem.
    8. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.
    9. Zawiesić próbki w 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania (perm).
    10. Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.
    11. Powtórz kroki 4.2.9 i 4.2.10.
    12. Zawiesić każdą próbkę i przenieść w całkowitej objętości 300-500 μl buforu FACS do mikroprobówek o pojemności 1 ml lub probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml.
    13. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym17. Jeżeli nie można natychmiast uruchomić próbek, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Efektywne generowanie progenitorów trzustki zależy od prawidłowego wzrostu i utrzymania niezróżnicowanych komórek, a następnie precyzyjnego dodawania specyficznych cząsteczek sygnałowych podczas protokołu różnicowania, co przedstawiono na schemacie na Rysunku 1A. W dniu 0 komórki niezróżnicowane powinny osiągnąć konfluencję na poziomie 80-95%, a kolonie powinny mieć wyraźne krawędzie (Rysunek 1A). Podczas Etapu 1 pożywka prawdopodobnie będzie wydawać się ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślne wytworzenie komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ z hPSC in vitro opiera się na wykorzystaniu wysokiej jakości kultur hPSC i ukierunkowanym różnicowaniu obejmującym precyzyjną regulację specyficznych szlaków sygnałowych, które rządzą kluczowymi etapami rozwoju trzustki. Chociaż protokół ten może być używany do indukowania silnej ekspresji NKX6-1 w różnych liniach hPSC, jak pokazano wcześniej3, aby zapewnić wydajne wytwarzanie NKX6-1, należy wziąć pod uwagę następują...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten manuskrypt był wspierany przez fundusze Toronto General and Western Foundation oraz Banting & Best Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Media i cytokiny
1-Tioglycerol (MTG)SigmaM6145
Activin AR& D338-AC/CF 
Kwas askorbinowySigmaA4544
B-27 SuplementLife Technologies12587-010 
BD Cytofix/Cytoperm BufferBD Bioscience554722
BD Perm/Wash buffer, 1xBD Bioscience554723
bFGFR& D233-FB
CHIR990210Tocris4423a
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11995
DNase IVWR80510-412 
DorsomorphinSigmaP5499
EGFR& D236-EG
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Żubr88150
FGF10R& D345-FG
Żelatyna ze skóry świniSigmaG1890
GlutaminaLife Technologies25030
NikotynamidSigmaNO636
NOGGINR& D3344-NG
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies15070-063
Kwas retinowySigmaR2625
RPMI Medium 1640Life Technologies11875
SANT-1Tocris1974
Enzym ekspresowy TrypLE (1x), czerwień fenolowaLife Technologies12605-010
Nazwa>FirmaNumer katalogowyUwagi
Przeciwciała do cytometrii przepływowej (rozcieńczenia robocze)
CD117 PE (1:100)Life TechnologiesCD11705
CXCR4 APC (1:50)BD  Bioscience551966
Osioł Anti-Mouse IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 647 (1:400)Life TechnologiesA-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.705-546-147
Mysz kontrolna Isotype IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 015-000-003
Koza kontrolna Isotype IgGR& D   AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)DSHBF55A10
PDX1 (1:100)R& DAF2419

Bibliografia

  1. Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
  2. Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
  3. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  4. Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  5. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
  6. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  7. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  8. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  9. Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
  10. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  11. Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
  12. Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
  13. Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
  14. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
  15. Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
  16. Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
  17. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  18. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  19. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja NKX6-1cytometria przepływowadefinitywna endodermaprotokół różnicowaniamarkery PDX1ludzkie embrionalne komórki macierzystehodowla komórkowamyszy z niedoborem odporności
Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.