Artykuł metodologiczny

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55267

⸱

5 marca 2017

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Streszczenie

Badanie funkcji genu w samoodnawiających się lub różnicujących ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) stanowi cenną platformę do zrozumienia rozwoju człowieka i analizy mechanizmów chorobowych w naczyniu. Aby wykorzystać ten potencjalny zastosunek, potrzebne są wydajne narzędzia do edycji genomu w celu wygenerowania mutantów hPSC w genach związanych z chorobą, a także protokoły różnicowania hPSC in vitro w celu wytworzenia typów komórek istotnych dla choroby, które ściśle przypominają ich odpowiedniki in vivo. Wydajna platforma do edycji genomu hPSC o nazwie iCRISPR została opracowana dzięki celowaniu za pośrednictwem TALEN w kasetę ekspresji Cas9 w locus AAVS1. W tym miejscu opisano protokoły generowania indukowalnych linii Cas9 hPSC przy użyciu komórek hodowanych w chemicznie zdefiniowanej pożywce i w warunkach wolnych od pożywki. Zamieszczono szczegółowe procedury wykorzystania systemu iCRISPR do nokautowania genów lub precyzyjnych zmian genetycznych w hPSC, odpowiednio poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub precyzyjne zmiany nukleotydowe przy użyciu szablonu naprawy kierowanej homologią (HDR). Te procedury techniczne obejmują opisy projektowania, produkcji i transfekcji przewodnikowych RNA CRISPR (gRNA); pomiar wskaźnika mutacji CRISPR za pomocą testów T7E1 lub RFLP; oraz ustanawianie i walidacja zmutowanych linii klonów. Na koniec opisujemy procedury różnicowania hPSC w reagujące na glukozę komórki podobne do β trzustki, naśladując rozwój embrionalny trzustki in vivo. Połączenie technologii iCRISPR z ukierunkowanym różnicowaniem hPSC umożliwia systematyczne badanie funkcji genów w celu pogłębienia naszej wiedzy na temat rozwoju trzustki i mechanizmów choroby cukrzycowej.

Wprowadzenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i dają początek wszystkim pochodnym trzech linii zarodkowych embrionalnych. Stanowią one cenne źródło informacji dla terapii zastępczej komórek i modelowania chorób, służąc jako unikalna platforma do podsumowania procesów komórkowych w kontekście rozwoju człowieka. Są one również źródłem komórek eksperymentalnych do skalowalnych, wysokoprzepustowych analiz. Postęp ten jest jednak ograniczony ze względu na dwa główne wyzwania: brak skutecznych narzędzi do modyfikacji genetycznej oraz trudności w odtworzeniu złożonych etapów rozwoju embrionalnego w naczyniu hodowlanym.

Modyfikacja genetyczna jest niezbędnym narzędziem do badania funkcji genów w normalnym rozwoju i chorobie. Jednakże, podczas gdy klasyczne podejścia do celowania w geny poprzez rekombinację homologiczną okazały się potężnym narzędziem do analizy funkcji genów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC)1, podejście to było wyjątkowo nieefektywne, gdy zastosowano je do hPSCs2,3. Niedawny szybki dostęp programowalnych, specyficznych dla miejsca nukleaz z natury do zastosowań laboratoryjnych, w tym nukleaz palca cynkowego (ZFN), nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz systemów zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)4, oznacza, że inżynieria genomu stała się znacznie łatwiejszym zadaniem w szerokim zakresie organizmów i linii komórkowych, w tym w hPSC. Te narzędzia do edycji genów wykorzystują fakt, że chimeryczne nukleazy, takie jak endonukleaza Cas9, mogą umożliwiać cały szereg modyfikacji genetycznych poprzez indukowanie dwuniciowych pęknięć (DSB) w precyzyjnych lokalizacjach, uruchamiając endogenną maszynerię naprawy DNA w celu aktywacji niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR). Oba mechanizmy mogą być wykorzystane do manipulacji genetycznej poprzez indukowanie losowych mutacji insercji i delecji (indels; przez NHEJ), w celu tworzenia mutacji z przesunięciem ramki odczytu, które neutralizują allele genów, lub precyzyjnych podstawień nukleotydów (za pomocą HDR), w celu podsumowania mutacji pacjenta w celu modelowania choroby u ludzi lub skorygowania mutacji powodującej chorobę w terapii genowej.

Inżynieria genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas wymaga dwóch komponentów: stałej endonukleazy Cas9 kierowanej przez RNA, niezbędnej do rozszczepienia DNA oraz zmiennego dupleksu CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego (tracrRNA), który określa rozpoznawanie celu DNA. Duplex crRNA/tracrRNA można zastąpić pojedynczym chimerycznym przewodnikiem RNA (gRNA), który, jak stwierdzono, działa wydajniej5,6,7. Podczas gdy system CRISPR/Cas9 został dostosowany do większości organizmów eksperymentalnych i linii komórkowych, dostarczanie i ekspresja Cas9 i gRNA różni się znacznie i musi być dalej optymalizowana, aby osiągnąć wydajną edycję genomu w wielu systemach, w tym hPSCs8. Wydajna platforma do edycji genomu, iCRISPR, została stworzona w hPSCs5. W tym systemie zastosowano podejście oparte na TALEN, aby celować w oba allele "locus bezpiecznej przystani transgenu" AAVS1 w trans, jeden allel z odwróconym transaktywatorem kontrolowanym przez tetracyklinę (M2rtTA), a drugi z elementem odpowiedzi tetracykliny (TRE) napędzającym ekspresję Cas9 (iCas9) w hPSC. W ustalonych liniach klonalnych (hPSC iCas9) Cas9 ulega silnej ekspresji podczas leczenia doksycykliną. Tymczasem, ze względu na niewielki rozmiar (100 nt), pojedyncze lub wielokrotne gRNA mogą być łatwo dostarczane do hPSC iCas9 z wysoką wydajnością i mogą kierować Cas9 do cięcia specyficznego dla miejsca, umożliwiając skuteczne rozrywanie genów za pośrednictwem NHEJ, a także precyzyjne modyfikacje nukleotydów za pośrednictwem HDR w obecności krótkich matryc dawcy jednoniciowego DNA (ssDNA). System iCRISPR może być z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania panelu naśladujących chorobę linii hPSC z biallelicznymi (homozygotycznymi lub złożonymi heterozygotycznymi) lub heterozygotycznymi mutacjami utraty funkcji w ważnych genach rozwojowych5,9. Podczas gdy wiele grup zgłosiło wydajną edycję genów przy użyciu CRISPR/Cas w hPSC, sukces pozostaje ograniczony do niewielkiej liczby laboratoriów biegłych technologicznie. Platforma iCRISPR oferuje wydajne, ale proste rozwiązanie do rutynowej edycji genów przez badaczy o różnych poziomach umiejętności i została już wykorzystana w wielu opublikowanych badaniach przez naszą grupę i inne podmioty9,10,11,12. Podejście to zostało również rozszerzone na indukowane wyciszanie oparte na wyrażeniu dCas9-KRAB13.

Wraz z postępem w technologii edycji genomu, osiągnięto również znaczące ulepszenia w utrzymaniu hPSC i ukierunkowanym różnicowaniu. Warunki hodowli hPSC ewoluowały od napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF) zależnych od żywienia do warunków wolnych od żywienia na zdefiniowanych składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej oraz od złożonych preparatów pożywek do chemicznie zdefiniowanych warunków pożywki14. Takie ulepszenia zmniejszyły zmienność hPSC wynikającą z różnic między partiami w przygotowaniu iMEF i składnikach zastępujących surowicę nokautującą, a tym samym zapewniły bardziej powtarzalne środowisko do różnicowania hPSC. Tymczasem lepsza wiedza na temat szlaków sygnałowych rządzących rozwojem embrionalnym człowieka, a także odkrycia wynikające z wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, doprowadziły do ulepszenia protokołów różnicowania15,16,17,18. Protokoły te bardziej naśladują etapy rozwoju in vivo i generują typy komórek, które ściśle przypominają ich odpowiedniki in vivo. W przypadku różnicowania hPSC w linii trzustkowej, początkowe protokoły stosunkowo dobrze naśladowały wczesny rozwój trzustki, ale ostatecznie wygenerowały polihormonalne komórki β, które miały niedojrzałe fenotypy płodu i słabo reagowały na stymulację glukozy. Ostatnie osiągnięcia16,17,19,20 pozwoliły na wytworzenie reagujących na glukozę komórek trzustkowych podobnych do β, co pozwoli nam zbadać późniejsze zdarzenia, takie jak tworzenie i dalsze dojrzewanie monohormonalnych komórek β

.

Tutaj szczegółowo opisujemy zastosowanie linii modyfikowanych genomem do badania rozwoju trzustki, łącząc system iCRISPR z platformą różnicowania in vitro opartą na hPSC w kierunku reagujących na glukozę komórek trzustki β-podobnych. To połączenie potężnych narzędzi do edycji genomu z ulepszonym protokołem różnicowania hPSC nie tylko oferuje szybkość i skalę niezbędną do zaspokojenia rosnącego zapotrzebowania na walidację przyczynowości choroby, ale także umożliwia zaawansowane manipulacje genetyczne w celu dalszych mechanistycznych badań nad kontrolą transkrypcji leżącą u podstaw normalnego rozwoju i choroby9.

Protokół

Protokół ten opiera się na naszej pracy z liniami hPSC H1, HUES8 i MEL-1 w stanie zdefiniowanym chemicznie i bez zasilaczy (patrz Tabela materiałów i wyposażenia). W przypadku innych linii hPSC lub hPSC utrzymywanych w różnych warunkach hodowli zalecana jest dalsza optymalizacja.

1. Hodowla hPSC w stanie zdefiniowanym chemicznie i wolnym od feederów

  1. Dostosuj hodowlę hPSC na karmnikach iMEF do warunków bez karmnika. W przypadkach, gdy zamrożone komórki nie przeżywają dobrze po bezpośrednim odzyskaniu w stanie wolnym od karmienia, najpierw odzyskaj komórki w stanie iMEF, a następnie przystosuj się do stanu wolnego od karmienia.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, potrzeba 2 pasaży, aby hPSC hodowane na karmnikach iMEF zostały przystosowane do stanu wolnego od karmnika.
  2. Zmieniaj pożywkę każdego dnia i przechodź przez hPSC, gdy komórki osiągną ~80% konfluencji. Ogólnie rzecz biorąc, pasaż hPSC w stosunku ~ 1:6 - 1:15 co 4 - 6 dni. Dodać 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 podczas rozmrażania lub pasażowania komórek.
  3. Przed wysiewem hPSC należy wstępnie pokryć szalki hodowlane 5 μg/ml (1 ml/10 cm2) skróconą ludzką formą witronektyny (VTN) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Przygotuj również kompletną pożywkę zdefiniowaną chemicznie, dodając suplement do podłoża podstawowego.
  4. Usunąć pożywkę hodowlaną, przemyć komórki raz PBS bez Ca2+ i Mg2+ i potraktować komórki 0,5 mM EDTA przez ~ 2 - 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać EDTA, zanim kolonie się odłączą. Za pomocą delikatnego pipetowania rozproszyć kolonie hPSC na małe kawałki i ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu.
  6. Zebrać zdysocjowane hPSC i odwirować komórki w masie 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulowane hPSC w kompletnym podłożu i wysiać komórki na płytkach pokrytych VTN.

2. Generowanie linii iCas9 hPSC

  1. Uporządkuj i amplifikuj następujące plazmidy: AAVS1-TALEN-L, AAVS1-TALEN-R, AAVS1-Neo-M2rtTA, oraz AAVS1-Puro-iCas9.
    UWAGA: Aby uniknąć nieoczekiwanych zdarzeń rekombinacji, należy użyć komórek kompetentnych Stbl3 z niedoborem rekombinacji do transformacji i amplifikacji plazmidów w temperaturze 30 °C.
  2. Zazwyczaj przygotowuje się hPSC w jednym 10-centymetrowym naczyniu (~ 1 x 107 komórek, jeśli ~ 80% zlewają się) na jeden eksperyment celowy.
    UWAGA: Ponieważ elektroporacja zwykle powoduje znaczną śmierć komórki, a celowanie genów za pośrednictwem TALEN w locus AAVS1 wymaga selekcji antybiotyków, stosunkowo duża liczba komórek musi zostać wysiana, aby zidentyfikować prawidłowo ukierunkowane komórki. Optymalizacja stężeń leku jest zalecana dla każdej linii komórkowej i każdego stanu hodowli.
  3. W dniu -1 (dzień przed elektroporacją) dodać 10 μM inhibitora ROCK podczas wymiany pożywki.
  4. W dniu 0 (dzień elektroporacji) należy wcześniej przygotować płytki pokryte VTN.
  5. Dysocjuj hPSC na pojedyncze komórki za pomocą 1x odczynnika dysocjacyjnego (patrz Tabela Materiałów i Wyposażenia). Na krótko usunąć pożywkę hodowlaną, przemyć komórki raz PBS bez Ca2+ i Mg2+ i potraktować komórki 1x odczynnikiem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez ~ 3 min. Odessać odczynnik dysocjacyjny, zanim komórki się odłączą. Za pomocą delikatnego pipetowania rozprowadzić hPSC do zawiesiny jednokomórkowej w 10,5 ml kompletnego podłoża.
  6. Weź 0,5 ml zawiesiny komórek, aby policzyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Osadzać komórki w granulkach o masie 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w zimnym (4 °C) PBS w temperaturze 12,5 x 106 komórek/ml.
  7. Dodaj plazmidy (patrz Tabela 1) do 800-μl zawiesiny hPSC (12,5 x 106 komórek/ml) i dobrze wymieszaj. Przenieś mieszaninę do 0,4-centymetrowej kuwety do elektroporacji i trzymaj na lodzie przez ~ 5 min.
  8. Elektroporację ogniw należy wykonać za pomocą systemu elektroporacyjnego przy napięciu 250 V i temperaturze 500 μF; stała czasowa obserwowana po elektroporacji wynosi zwykle 9 - 13 ms.
  9. Po elektroporacji przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 5 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża. Kluczowe znaczenie dla skutecznego kierowania: Używaj zdrowych, proliferujących hPSC i obchodź się z ogniwami bardzo delikatnie podczas przenoszenia, ponownego zawieszania i powlekania komórek po elektroporacji.
  10. Osadzać komórki w granulkach o gramaturze 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnego podłoża z 10 μM inhibitorem ROCK i płytką 1, 2,5 i 5 x 106 komórek na każdej z trzech pokrytych VTN, 10-centymetrowych szalek; gwarantuje to, że co najmniej jedna z płytek będzie miała wystarczającą liczbę kolonii o gęstości klonalnej pojedynczej komórki do pobrania kolonii.
  11. W dniu 1 (dzień po elektroporacji) należy zmienić pożywkę.
  12. W dniach 2 - 5 rozpocznij selekcję neomycyny, gdy komórki są ~ 60% zlewne. Zmieniaj pożywkę codziennie na 500 μg/ml siarczanu G418; znaczna śmierć komórki w wyniku selekcji jest zwykle obserwowana 2 dni po selekcji G418.
  13. W dniu 6 zmień pożywkę bez selekcji antybiotyków.
  14. W dniach 7-9 rozpocznij selekcję puromycyny. Codziennie zmieniać pożywkę za pomocą 1 μg/ml dichlorowodorku puromycyny; Następnego dnia należy zaobserwować znaczną śmierć komórki.
  15. W dniu 10 należy rozpocząć codzienną zmianę pożywki bez selekcji antybiotyków, aż kolonie jednokomórkowe hPSC osiągną średnicę 1-2 mm.
    UWAGA: Zazwyczaj obserwuje się 50 kolonii w 10-centymetrowej naczyniu z 2,5 x 106 hPSC posiaonymi w dniu 0.
  16. Wybierz 12 - 24 kolonie pod mikroskopem stereoskopowym. Mechanicznie zdezagreguj kolonie hPSC na małe kawałki (~ 10 sztuk na kolonię) za pomocą igły 23-G (końcówka pipety o pojemności 200 μl jest również cienka) i przenieś komórki bezpośrednio na 24-dołkowe płytki pokryte VTN.
  17. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki staną się zlewne. Przenieś komórki w każdym dołku z 24-dołkowych płytek do zduplikowanych dołków 6-dołkowych.
  18. Kiedy komórki zlewają się w 6-dołkowych płytkach, użyj jednej studzienki do zamrożonego bulionu, a drugiej studzienki do ekstrakcji genomowego DNA w celu dalszej charakterystyki.
  19. Scharakteryzuj i zwaliduj ustalone linie iCas9 za pomocą genotypowania PCR, Southern blot, analizy RT-qPCR, kariotypowania i testu pluripotencji. Patrz Zhu i wsp.21 dla szczegółowych procedur eksperymentalnych.

3. Generowanie linii mutantów hPSC za pomocą systemu iCRISPR

  1. Generowanie linii wybijania hPSC
    1. Projektowanie i produkcja gRNA
      1. Wybierz docelowe regiony w genie będącym przedmiotem zainteresowania, aby zmaksymalizować możliwość zakłócenia funkcji białka typu dzikiego. W przypadku dobrze opisanych genów wybierz region docelowy przed istotną domeną funkcjonalną. Alternatywnie, zaprojektuj gRNA tak, aby celowały w region poniżej kodonu start. Wybierz co najmniej 2 różne regiony dla interesującego Cię genu.
      2. Projektuj gRNA za pomocą internetowego narzędzia do projektowania CRISPR (http://crispr.mit.edu). Dla każdego regionu docelowego zaprojektuj 3 gRNA o niskim potencjale niedocelowym i użyj tego o najwyższej skuteczności celowania do generowania linii klonów zmutowanych 22.
        UWAGA: W celu osiągnięcia wysokiej wydajności edycji genomu, zaleca się dostarczanie gRNA w postaci oligonukleotydów RNA zamiast jako plazmidowego DNA ze względu na wyższą wydajność transfekcji małych RNA w porównaniu z plazmidami w przeszłości.
      3. Rząd 120 nukleotydowych (nt) oligonukleotydów DNA zawierających sekwencję promotora T7, zmienną sekwencję rozpoznawania 20-nt crRNA (N)20 (nie obejmują sekwencji PAM) i stałą chimeryczną sekwencję prowadzącą. Rozcieńczyć oligonukleotydowane do 100-μM roztworu podstawowego w ddH2O i przygotować 250-nM jako roztwór roboczy.
        UWAGA: TAATACGACTCACTATAGGG (N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. Amplifikacja oligonukleotydów metodą PCR przy użyciu starterów T7F i TracrR (patrz Tabela 2) w celu wytworzenia dwuniciowego DNA (dsDNA) do transkrypcji gRNA in vitro (IVT). Użyć 50 μl mieszaniny reakcyjnej PCR (patrz tabela 3) i warunków cyklu PCR (patrz tabela 4).
      5. Użyj zestawu do transkrypcji gRNA in vitro o wysokiej wydajności T7 z matrycą amplifikowaną PCR w 20 μl, mieszaninie transkrypcji gRNA in vitro (patrz tabela 5) zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyść produkty gRNA za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.
      6. Elute gRNA zgodnie z protokołem oczyszczania wysokoprzepustowego zgodnie z instrukcjami producenta (zwykle ~ 50 - 100 μg) w 100 μL buforu elucyjnego. Jeśli to możliwe, dostosować stężenie do 320 ng/μl (10 μM) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    2. Projekt startera do sekwencjonowania PCR i Sangera
      1. Zaprojektuj i zwaliduj startery PCR wzmacniające region docelowy, z rozmiarami produktów zwykle w zakresie ~ 500 - 1,000 pz.
      2. Zaprojektuj startery sekwencjonowania Sangera wiążące się wewnętrznie z produktami PCR, aby umożliwić bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR bez oczyszczania.
    3. Transfekcja gRNA w hPSC iCas9
      1. W dniu -1 potraktuj komórki iCas9 2 μg / ml doksycykliny 24 godziny przed transfekcją gRNA.
      2. W dniu 0 transfekcji gRNA należy wcześniej przygotować płytki pokryte VTN.
      3. Zdysocjuj komórki iCas9 na pojedyncze komórki za pomocą 1x odczynnika dysocjacyjnego, jak opisano w kroku 2.5.
      4. Osadzać hPSC w dawce 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w temperaturze ~ 0,5 x 106 komórek/ml w kompletnym pożywce uzupełnionej 2 μg/ml doksycykliny i 10 μM inhibitorem ROCK.
      5. Umieść 0,5 ml zawieszonych komórek w indywidualnych dołkach na płytkach 24-dołkowych. Przygotuj dodatkowe studzienki, które będą służyć jako kontrole nietransfekowane.
      6. Dla każdego gRNA należy wykonać następujące mieszaniny transfekcji: Wymieszać A, 50 μl zredukowanej pożywki surowicy + 1 μl gRNA (10 μM); Zmieszać B, 50 μl zredukowanej pożywki surowicy + 3 μl odczynnika do transfekcji.
      7. Połącz mieszankę A i B, aby uzyskać 100 μl mieszanki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 50 μl mieszaniny do komórek w zduplikowanych dołkach 24-dołkowych płytek i dobrze wymieszać.
      8. W dniu 1 wykonaj drugą transfekcję, jeśli to konieczne, aby jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność celowania. W przeciwnym razie zmień podłoże bez doksycykliny.
      9. W dniach 2 - 3 zmieniaj podłoże codziennie.
      10. W dniu 4 wyekstrahuj genomowe DNA z jednego dołka z każdej transfekowanej i nietransfekowanej komórki kontrolnej za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA. Dostosuj stężenie do 50 ng/μl.
      11. Amplifikacja PCR regionów docelowych flankujących sekwencje celujące gRNA i oszacowanie wydajności edycji za pomocą trawienia endonukleazy T7 I (T7EI) lub testu polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP), jak opisano wcześniej5.
    4. Test T7EI
      1. Amplifikuj region docelowy metodą PCR za pomocą starterów zaprojektowanych i zatwierdzonych w kroku 3.1.
      2. Przygotować mieszaniny (patrz tabela 6) i przeprowadzić denaturację DNA oraz hybrydyzację produktów PCR w warunkach określonych w tabeli 7.
        UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że generalnie nie jest konieczne oczyszczanie produktów PCR do testu T7EI w przypadku korzystania z naszych warunków PCR. Jednak oczyszczanie może być korzystne w innych warunkach.
      3. Przeprowadzić trawienie T7EI w temperaturze 37 °C przez 30 minut, używając 10 μl denaturowanego i hybrydyzowanego produktu PCR oraz 0,2 μl (2 U) T7E1 (10 U/μL).
      4. Roztwory próbek PCR strawionych przez T7E1 rozpuścić za pomocą elektroforezy żelowej. Użyj ImageJ, aby określić względne intensywności pasm naciętego i nieprzeciętego DNA. Obliczyć częstość indelu za pomocą wzoru: (1 - (√(1-(b+c))/(a+b+c))) x 100, gdzie a jest intensywnością niestrawionego produktu PCR, a b i c są intensywnościami produktów rozszczepionych T7E1.
    5. Test RFLP
      UWAGA: W przypadkach, gdy miejsce ograniczenia znajduje się w bliskiej odległości (< 5 pz) od miejsca rozszczepienia Cas9 (3 pz 5' sekwencji PAM), można przeprowadzić test RFLP w celu ilościowego określenia częstości indel.
      1. Należy użyć tych samych produktów do PCR, jak opisano w kroku 3.1.4.1.
      2. Produkt PCR należy roztrawić enzymem restrykcyjnym, który zawiera miejsce restrykcji w pobliżu miejsca rozszczepienia Cas9.
      3. Rozpuścić strawione próbki PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Użyj ImageJ, aby określić względne intensywności pasm naciętego i nieprzeciętego DNA. Obliczyć częstość niedelowania za pomocą wzoru: a / (a+b+c) x 100, gdzie a jest intensywnością niestrawionego produktu PCR, a b i c są intensywnościami produktów trawionych.
    6. Ustanowienie zmutowanych linii klonalnych
      UWAGA: Edycja genomu w hPSC przy użyciu systemu iCRISPR z transfekcją gRNA jest bardzo wydajna i nie jest wymagana selekcja antybiotyków. Aby ustalić linie klonalne, konieczne jest wysiewanie komórek o stosunkowo niskiej gęstości, aby zapewnić tworzenie kolonii pochodzących z jednej komórki.
      1. Zidentyfikuj gRNA o najwyższej wydajności edycji (przy użyciu testu T7EI lub RFLP) i o dobrej przeżywalności komórek. Użyj odpowiedniego duplikatu studzienki do ustanowienia linii klonów mutantów.
      2. Dysocjować hPSC do zawiesiny jednokomórkowej za pomocą 1x odczynnika dysocjacyjnego, jak opisano w kroku 2.5. Ponownie umieść 500, 1,000 i 2,000 komórek na każdej z trzech pokrytych VTN, 10-centymetrowych szalek.
      3. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie jednokomórkowe osiągną średnicę ~ 2 mm.
      4. Wybierz od 24 do 48 kolonii dla każdego gRNA, w zależności od oszacowania skuteczności celowania za pomocą testu T7EI i/lub RFLP. Mechanicznie zdezagreguj każdą kolonię na małe kawałki (~ 10 sztuk na kolonię) za pomocą igły 23 G (końcówka pipety o pojemności 200 μl jest również cienka) i ponownie umieść komórki w zduplikowanych 96-dołkowych płytkach pokrytych VTN. Użyj jednej płytki do ekstrakcji genomowego DNA i sekwencjonowania Sangera, a drugiej płytki do dalszej ekspansji.
      5. Kiedy komórki w 96-dołkowych płytkach zbliżą się, wyekstrahuj genomowe DNA (bez ekstrakcji fenolem/chloroformem) przy użyciu prostego protokołu, jak opisano poniżej.
      6. Usuń pożywkę i przemyj komórki raz PBS bez Ca2+ i Mg2+. Dodaj 50 μl buforu do lizy (5 μl proteinazy K (10 mg / ml), 5 μl buforu PCR 10x i 40 μl ddH2O) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Uszczelnić płytkę za pomocą folii samoprzylepnej i inkubować przez noc w temperaturze 55 °C.
      7. Następnego dnia przenieś lizaty komórkowe na 96-dołkową płytkę PCR i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 99 °C w termocyklerze w celu dezaktywacji proteinazy K.
      8. Amplifikacja PCR regionu docelowego przy użyciu tych samych starterów, co w teście T7EI lub RFLP, przy użyciu 1 μl lizatu komórkowego jako matrycy.
      9. Użyj 1 μl produktu PCR do sekwencjonowania Sangera z starterem wiążącym się wewnętrznie z produktem PCR.
      10. Wzmocnij klony za pomocą mutacji indel z przesunięciem ramki dla zamrożonych zapasów. Wzmocnij również kilka klonów typu dzikiego z tego samego eksperymentu celowania, aby służyły jako izogeniczne linie kontrolne dla dalszych eksperymentów.
  2. Generowanie zmutowanych linii z precyzyjnymi zmianami nukleotydów
    UWAGA: W porównaniu z mutantami nokautowymi generowanymi przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), precyzyjną zmianę nukleotydów można osiągnąć poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) w obecności matryc naprawy DNA. Tak precyzyjne zmiany nukleotydowe pozwalają na generowanie specyficznych dla pacjenta mutacji w hPSC typu dzikiego oraz na korekcję mutacji w iPSC pochodzących od pacjenta.
    1. Projekt ssDNA jako szablonu HDR
      1. Zaprojektuj i wyprodukuj 2-3 gRNA w bliskiej odległości od mutacji specyficznej dla pacjenta, jak opisano w kroku 3.1.1.
      2. Zaprojektuj jednoniciowy DNA (ssDNA) zawierający specyficzną dla pacjenta mutację otoczoną przez ~ 40 - 80 nt homologii z każdej strony jako matrycę HDR.
      3. Aby zmniejszyć dodatkowe cięcie po prawidłowej naprawie, wprowadź cichą mutację do matrycy ssDNA w regionie w sekwencji rozpoznawania gRNA i w bliskiej odległości od sekwencji PAM lub w samej sekwencji PAM, jeśli to możliwe.
      4. Jeśli to możliwe, zaprojektuj cichą mutację tak, aby wprowadzić nowe miejsce trawienia restrykcyjnego, tak aby można je było wykorzystać do oszacowania skuteczności naprawy za pomocą testu RFLP.
    2. Kotransfekcja gRNA/ssDNA i tworzenie linii klonalnych
      1. Przeprowadzić jednoczesną transfekcję gRNA/ssDNA do komórek iCas9, jak opisano w kroku 3.1.3, za pomocą mieszanin transfekcji A i B. Dla każdej gRNA i nietransfekowanej kontroli transfekuj komórki w zduplikowanych studzienkach 24-dołkowych płytek. Mieszanina A: 50 μl zredukowanej pożywki surowicy + 1 μl gRNA (10 μM) + 2 μL ssDNA (10 μM). Mieszanina B: 50 μl zredukowanej pożywki surowicy + 3 μl odczynnika do transfekcji.
      2. Po transfekcji wyekstrahować genomowe DNA z jednego dołka z każdej transfekowanej i nietransfekowanej komórki kontrolnej i oszacować skuteczność naprawy za pomocą testu T7EI i / lub RFLP.
      3. Zidentyfikuj mieszaninę gRNA/ssDNA o najwyższej skuteczności naprawy i dobrej przeżywalności komórek. Użyj odpowiedniego duplikatu studzienki do ustanowienia linii klonów mutantów.
      4. Wybierz od 48 do 96 kolonii, w zależności od oszacowania skuteczności celowania za pomocą testu T7EI i/lub RFLP. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność mutacji za pośrednictwem HDR jest niższa niż mutacji nokautowej, a zatem należy pobrać więcej kolonii.
      5. Sekwencjonowanie, rozwijanie i weryfikowanie linii klonalnych zgodnie z opisem w kroku 3.1.6.

4. Różnicowanie in vitro hPSC w reagujące na glukozę komórki β trzustki

UWAGA: Różnicowanie in vitro mutantów hPSC w typy komórek istotnych dla choroby stanowi platformę do modelowania choroby w naczyniu. Poniższy protokół koncentruje się na różnicowaniu in vitro hPSC w reagujące na glukozę komórki β trzustki w badaniach rozwojowych trzustki i cukrzycy9,16,17.

  1. Różnicowanie hPSC w ostateczną endodermę
    1. Utrzymuj mutanty hPSC i linie kontrolne typu dzikiego w stanie zdefiniowanym chemicznie i wolnym od zasilania, jak opisano w kroku 1.
    2. Aby przygotować hPSC do różnicowania, należy zdysocjować hPSC za pomocą 1x odczynnika dysocjacyjnego i zdyspergować je do zawiesiny jednokomórkowej w kompletnym pożywce.
    3. Osadzać komórki w masie 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu z 10 μM inhibitorem ROCK. Policz liczbę komórek i zasiej komórki w odległości ~ 1,4 x 105 komórek/cm2 na płytkach pokrytych VTN.
    4. Zmienić podłoże 24 godziny po wysiewie.
    5. W dniu 0 rozpocznij różnicowanie po 48 godzinach, gdy komórki osiągną ~ 80% konfluencji.
      UWAGA: Aby osiągnąć wysoką skuteczność różnicowania trzustki, zaleca się optymalizację gęstości wysiewu i poziomu zbiegu po 48 godzinach dla każdej pojedynczej linii.
    6. Odessać pożywkę hPSC i przepłukać komórki raz PBS bez Ca2+ i Mg2+.
    7. Zmień pożywkę na pożywkę dnia różnicowania 0 (d0).
    8. W dniach 1 - 2 należy codziennie zmieniać pożywkę różnicującą, zgodnie z przepisami podanymi w Tabeli 8.
    9. W dniu 3 zbadaj ostateczne markery endodermy SOX17, FOXA2 i CXCR4 za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej.
  2. Ostateczne różnicowanie endodermy w progenitor trzustki
    1. W dniach 3 - 9 kontynuuj definitywne różnicowanie endodermy w kierunku linii trzustki, zmieniając pożywkę codziennie, zgodnie z przepisami w Tabeli 9.
    2. W dniu 7 należy zbadać marker PDX1 wczesnego progenitora trzustki (PP1) za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej.
    3. W dniu 10 należy zbadać późniejsze markery progenitorowe trzustki (PP2) PDX1 i NKX6.1. W międzyczasie przygotuj się do przeniesienia komórek PP2 na granicę faz powietrze-ciecz w celu dalszego różnicowania w komórki endokrynne trzustki.
  3. Różnicowanie endokrynologiczne trzustki na granicy faz powietrze-ciecz
    1. Potraktuj komórki PP2 inhibitorem 10 μM ROCK na 4 godziny przed dysocjacją.
    2. Usuń pożywkę i przepłucz komórki raz PBS bez Ca2+ i Mg2+.
    3. Dodać 2 ml 1x odczynnika dysocjacyjnego do komórek PP2 w jednym 10-centymetrowym naczyniu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 3 minuty.
    4. Odessać odczynnik dysocjacyjny, zanim komórki się odłączą. Dodać 10 ml pożywki BLAR i rozdzielić komórki PP2 na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    5. Zebrać zawiesinę jednokomórkową. Policz liczbę komórek i osad w ilości 200 x g przez 5 minut.
    6. Ponownie zawiesić osad komórkowy na poziomie ~ 0,5 x 105 komórek/μL w pożywce różnicującej S5 i umieścić 5 - 10 μL komórek na plamkę na filtrze z wkładem transwell. Umieść 10 - 15 plamek w jednej wkładce 6-dołkowej i ~100 plamek w wkładce 10 cm.
    7. Dodaj pożywkę S5 na dno każdej wkładki transwell, ~ 1,5 ml dla wkładek 6-dołkowych i ~ 8 ml dla wkładek 10-cm.
    8. Zmieniaj podłoże codziennie, korzystając z przepisów z tabeli 10.
    9. Zbadaj markery endokrynne trzustki PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, INSULINA i GLUKAGON w 34 dniu za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej17.
    10. Zbadaj funkcję komórek podobnych do β pochodzących z hPSC za pomocą testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą (GSIS)16,17.

Wyniki

Adaptacja i utrzymanie hodowli hPSC w warunkach chemicznie zdefiniowanych i bez warstw komórek karmionek

hPSC hodowane na komórkach karmicielskich iMEF mogą zostać szybko zaadaptowane do płytek pokrytych VTN w warunkach hodowli bezkomórkowej (feeder-free). Podczas adaptacji można stosować ten sam stosunek rozcieńczenia, co w standardowej hodowli na komórkach karmicielskich iMEF. Rysunek 1A przedstawia typową morfologię hPSC na komórkach karmicielskich iMEF w pożywce opartej na KSR oraz na powierzchni pokrytej VTN w pożywce bezkomórkowej. Rysunek 1B pokazuje typową zmianę morfologiczną i wzrost kolonii hPSC podczas pierwszego pasażu adaptacyjnego (4 dni). Komórki można dalej pasażować lub zamrozić do przyszłych eksperymentów. Przed rozpoczęciem eksperymentów z różnicowaniem należy przeprowadzić 2–3 pasaże hodowli adaptacyjnej. Po adaptacji zaleca się również wykonanie kariotypowania, choć nie zaobserwowano nieprawidłowości kariotypu w fazie adaptacji.

Generowanie linii hPSC iCas9 poprzez celowanie w locus AAVS1 za pomocą TALEN

Jak wykazano wcześniej, hPSC poddano elektroporacji parą plazmidów TALEN AAVS1 oraz plazmidami Cas9 i M2rtTA5. Rycina 2A i B przedstawiają szczegółowy projekt wektora donora oraz całą procedurę generowania klonalnych linii iCas9 hPSC. Po selekcji antybiotykowej klony pochodzące z pojedynczych komórek, wykazujące odpowiednią wielkość i typową morfologię hPSC, były gotowe do wyboru (10–12 dni po elektroporacji, Rycina 2C). Zazwyczaj około 50% klonów jest prawidłowo celowanych bez przypadkowych integracji, co potwierdzono za pomocą analizy Southern blotting (Rycina 2D)5. Przypadkowa integracja mogłaby spowodować nieszczelną ekspresję Cas9 w przypadku braku podawania doksycykliny.

Efektywna modyfikacja genetyczna w hPSC z wykorzystaniem platformy iCRISPR

W ugruntowanych liniach iCas9 hPSC, Cas9 jest ekspresowany po zastosowaniu doksycyliny i kierowany do docelowego locus przez transfekowane gRNA, gdzie generuje DSB. W przypadku braku matrycy naprawczej, naprawa DNA poprzez NHEJ prowadzi do powstania indeli, co często skutkuje przerwaniem funkcji genu lub knockoutem. W obecności matrycy naprawczej (np. donora ssDNA), można zastosować HDR do precyzyjnych zmian genetycznych, takich jak wprowadzenie mutacji specyficznej dla pacjenta w tle hPSC typu dzikiego lub korekcja wariantu genetycznego związanego z chorobą w iPSC pochodzących od pacjenta (Rysunek 3A). Wygenerowanie klonalnych linii mutantów przy użyciu systemu iCRISPR zajmuje około 1 miesiąca. Po indukcji iCas9 i transfekcji gRNA zastosowano testy T7EI i/lub RFLP w celu oceny wydajności cięcia Cas9, a następnie transfekowane komórki wysiano jako pojedyncze komórki na szalki 10-cm o niskiej gęstości (~ 50 - 2 0 komórek/szalka 10-cm). Po 10 - 12 dniach klony pochodzące z pojedynczych komórek przeniesiono do studzienek płytki 96-dołkowej w celu ich namnożenia i dalszej charakterystyki (tj. genotypowania i Western blottingu) (Rysunek 3B). Ponieważ knockout genu za pomocą iCRISPR jest bardzo wydajny, nie stosuje się procesu selekcji, a zazwyczaj można łatwo uzyskać 20 - 50% mutantów biallelicznych (Rysunek 3C)5. W celu przeprowadzenia wydajnych i precyzyjnych zmian genetycznych gRNA są współtransfekowane z donorem ssDNA niosącym specyficzną zmianę sekwencji (w przypadku niewielkiej, ale specyficznej zmiany sekwencji genomu). Często, aby zapobiec ponownemu cięciu w zmodyfikowanych allelach, zaleca się wprowadzenie mutacji cichej w bezpośrednim sąsiedztwie lub w obrębie sekwencji PAM (Rysunek 3D). Dzięki temu systemowi uzyskuje się około 10% klonów z pożądaną modyfikacją genomu za pośrednictwem HDR bez dodatkowych zmian w obu allelach (Rysunki 3E). Szybka i precyzyjna modyfikacja genomu hPSC z wykorzystaniem platformy iCRISPR pozwala na sprawne i efektywne tworzenie linii hPSC, które służą jako modele do badania rozwoju człowieka i chorób.

Efektywne różnicowanie hPSC w komórki typu β reagujące na glukozę

Ostatnie postępy w różnicowaniu hPSC w kierunku trzustki pozwoliły na opracowanie protokołów, które ściśle odwzorowują embrionalny rozwój trzustki. Niezróżnicowane hPSC różnicują się najpierw w ostateczną endodermę, następnie w wczesne progenitory trzustkowe PDX1+ (PP1) i późniejsze komórki progenitorowe trzustki PDX1+NKX6.1+ (PP2), a na koniec w glukozoczułe komórki β-podobne16,17,19,20,23,24. Protokoły te zostały dalej zoptymalizowane, aby niezawodnie generować progenitorów trzustkowych PDX1+NKX6.1+ oraz glukozoczułe komórki β-podobne9. Rysunek 4A przedstawia szczegółowe dodatki chemiczne stosowane na każdym etapie różnicowania. Zazwyczaj ok. 80% konfluencji 2 dni po początkowym wysianiu komórek jest optymalne dla rozpoczęcia różnicowania hPSC linii HUES8 (Rysunek 4B). Wysoce zaleca się przetestowanie kilku różnych gęstości wysiewu w celu znalezienia optymalnych warunków dla każdej konkretnej linii komórkowej. Zazwyczaj można osiągnąć poziom co najmniej 75% komórek FOXA2+SOX17+ na etapie DE oraz 40% komórek PDX1+NKX6.1+ na etapie PP2 (Rysunek 4C). Na etapie S5 obecność struktury przypominającej aurę wokół agregatu komórkowego jest wskaźnikiem dobrego przeżycia komórek, co jest istotne dla dalszego różnicowania w NKX6.1+CPEP+ glukozoczułe komórki β-podobne (Rysunek 4D). Niniejszy protokół jest użyteczny do badania rozwoju trzustki człowieka oraz chorób w warunkach in vitro.

morfologia hPSC, porównanie pożywek iMEF i witronektyny, postęp adaptacji, dni 1-4, mikroskopia.
Rysunek 1. Chemicznie zdefiniowane utrzymanie hPSC bez użycia komórek karmnych oraz adaptacja hodowli z warstw karmnych iMEF. (A) Reprezentatywne obrazy hPSC hodowanych na warstwie wspomagającej iMEF lub na VTN w 4. dniu, przygotowanych do pasażowania. (B) Typowa morfologia hPSC podczas pierwszego pasażu adaptacji do hodowli bez warstwy karmowej z warstwy karmowej iMEF. hPSC w 4. dniu hodowli na warstwach karmowych iMEF zostały rozdzielone i wysiane na płytkach pokrytych VTN w chemicznie zdefiniowanym medium z inhibitorem ROCK. Stosunek rozdzielenia był taki sam, jak standardowy stosunek rozdzielenia stosowany w warunkach hodowli na warstwie karmowej iMEF. Medium wymieniano codziennie, bez zastosowania inhibitora ROCK. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Proces wytwarzania iPSC z edycją Cas9, schemat oraz wyniki Southern blot linii hPSC.
Rysunek 2. Generowanie linii hPSC iCas9. (A) Strategia targetowania w celu generowania linii iCas9 hPSC. Donory Puro-Cas9 oraz Neo-M2rtTA zostały wprowadzone do ludzkich AAVS1 locus za pomocą pary TALEN-ów AAVS1. (B) Schematy całego procesu targetowania, obejmujące elektroporację, selekcję antybiotykową, wybór i namnażanie kolonii oraz charakterystykę linii komórkowych. (C) Reprezentatywny klon pojedynczej komórki gotowy do pobrania około 10–12 dni po elektroporacji. (D) Przykłady analizy Southern blot służące do identyfikacji prawidłowo ukierunkowanych klonów bez dodatkowej integracji dwóch plazmidów donora. Prawidłowe klony zaznaczono na czerwono. (A) i (D) zostały opracowane na podstawie źródła 5, za zgodą autorów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Edycja genów w hPSC; system Cas9, NHEJ, HDR; diagramy i wykresy; analiza wydajności mutacji.
Rysunek 3. Wydajna modyfikacja genetyczna w hPSC z wykorzystaniem systemu iCRISPR. (A) Schematy generowania mutantów z nokautem genu lub precyzyjnej modyfikacji genu z wykorzystaniem systemu iCRISPR. (B) Procedura celowania i ustanowienie linii klonalnej. (C) Efektywność nokautu genów poprzez NHEJ w hPSC9. (D) Projekt ssDNA z konkretną modyfikacją nukleotydową. P, na czerwono: mutacja specyficzna dla pacjenta; X, na zielono: mutacja cicha. (E) Efektywność precyzyjnej modyfikacji nukleotydowej za pośrednictwem HDR. Precyzyjna mutacja R456C (wywołana przez specyficzny nukleotyd C>mutacja T) w GATA6 locus został wprowadzony przy użyciu systemu iCRISPR. (Szczegółowe informacje znajdują się w Literaturze 5).C) i (E) zostały zaadaptowane odpowiednio z Publikacji 9 oraz Publikacji 5, za zgodą autorów. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Krokowe różnicowanie hPSC w komórki przypominające komórki β; barwienie markerów; schemat różnicowania trzustki.
Rysunek 4. Kierowana różnicowanie hPSC w komórki podobne do komórek $\beta$ trzustki reagujące na glukozę. (A) Schematy szczegółowego protokołu różnicowania z wyszczególnieniem substancji chemicznych dodawanych na każdym etapie różnicowania. Szlaki sygnałowe aktywowane lub hamowane podczas różnicowania wyróżniono odpowiednio kolorem zielonym lub czerwonym. CHIR: inhibitor GSK3; GDF8: czynnik różnicowania wzrostu 8 lub miostatyna, białko z rodziny TGF-beta; HH: Hedgehog; DE: ostateczna endodermą; PP1: wczesny progenitor trzustkowy PDX1+; PP2: późny progenitor trzustkowy PDX1+NKX6.1+. (BTypowa konfluencja (70–80%) hPSC 48 h po wysianiu, gdy są one gotowe do zainicjowania różnicowania.C) Reprezentatywne obrazy barwienia immunofluorescencyjnego wykazujące pomyślną różnicowanie na etapie ostatecznej endodermy (DE; współbarwienie FOXA2 i SOX17), etapie progenitorów trzustkowych (PP2; współbarwienie PDX1 i NKX6.1) oraz etapie komórek typu β reagujących na glukozę (współbarwienie NKX6.1 i C-peptydu). Ogólnie, aby uzyskać ponad 10% komórek NKX6.1+CPEP+ na etapie komórek typu β, wymagane jest co najmniej 75% komórek DE FOXA2+SOX17+ oraz 40% komórek PP2 PDX1+NKX6.1+ na odpowiednich etapach. (D) Typowa morfologia agregatu komórkowego w stadium S5 na membranie filtra wkładki w hodowli na granicy faz powietrze-ciecz. Przeżyłe komórki zmigrowały do centrum agregatu (ciemny obszar), pozostawiając na krawędzi strukturę przypominającą aurę. (A) i (D) zostały opracowane na podstawie publikacji 9 za zgodą autorów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

PlazmidIlość
AAVS1-TALEN-L5 µg
AAVS1-TALEN-R5 µg
AAVS1-Puro-iCas940 µg
AAVS1-Neo-M2rtTA40 µg

Tabela 1

StarterSekwencja
T7FTAATACGACTCACTATAGGG
TracrRAAAAGCACCGACTCGGTGCC

Tabela 2

KomponentIlość
ddH2O2O35.5 μL
bufor do reakcji PCR 5x10 μL
mieszanina dNTP (25 mM)0.5 μL
T7F (10 µM)1.25 μL
TracrR (10 μM)1.25 μL
Matryca IVT dla T7-gRNA (250 nM)1 μL
Polimeraza DNA0.5 μL
Całkowita mieszanina reakcyjna PCR50 μL

Tabela 3

Warunki cyklowania PCR
Numer cykluDenaturacjaWyżarzaniePrzedłużyć
194 ºC, 2 min
2-3194 ºC, 20 s60 ºC, 20 s72 ºC, 1 min
3272 ºC, 2 min

Tabela 4

KomponentIlość
T7 ATP2 μL
T7 CTP2 μL
T7 GTP2 μL
T7 UTP2 μL
bufor T7 10x2 μL
mieszanina enzymów T72 μL
matryca amplifikowana metodą PCR8 μL
Suma in vitro mieszanina do transkrypcji gRNA20 μL
Inkubować w temperaturze 37 ºC przez 6 h lub przez noc

Tabela 5

KomponentIlość (μL)
Nieoczyszczony produkt PCR8
Bufor 2 10x2
Woda destylowana (dH2O)2O)10

Tabela 6

Warunki cykli denaturacji i hybrydyzacji DNA
TemperaturaCzas trwaniaWarunki termocyklera
95 °C10 min
85 °C1 minZmiana temperatury do 85 °C z szybkością 2 °C/s
75 °C1 minZmiana temperatury do 75 °C z szybkością 0.3 °C/s
65 °C1 minZmiana temperatury do 65 °C z szybkością 0.3 °C/s
5 °C1 minZmiana temperatury do 5 °C z szybkością 0.3 °C/s
45 °C1 minZmiana temperatury do 45 °C z szybkością 0.3 °C/s
35 °C1 minZmiana temperatury do 35 °C z szybkością 0.3 °C/s
25 °C1 minZmiana temperatury do 25 °C z szybkością 0.3 °C/s
4 °CPodtrzymanie

Tabela 7

EtapDzieńPożywkiSuplement
S1d0S1GDF8
10 ng/mL		CHIR-9021
3 µM
d1S1GDF8
10 ng/mL		CHIR-9021
0.3 µM
d2S1GDF8
10 ng/mL
Pożywka S1: MCDB 131 + 1x suplement L-glutaminy + 0,5% BSA + 1,5 g/L NaHCO33 + 10 mM glukozy

Tabela 8

EtapDzieńPożywkiSuplement
S2d3-d4S1LAA
0,25 mM		FGF7
50 ng/mL		IWP-2
2.5 µM
S3d5-d6S3LAA (lewe przedsionkowe przydatki)
0,25 mM		FGF7
50 ng/ml		SANT-1
0.25 µM		RZS
1 µM		LDN
10 nM		TPB
20 nM		ITS-X
1:200
S4d7-d9S3LAA
0,25 mM		FGF7
2 ng/mL		SANT-1
0.25 µM		RZS
0.1 µM		LDN
20 nM		TPB
10 nM		ITS-X
1:200		IWP-2
2.5 µM
pożywka S3: MCDB 131 + 1x suplement L-glutaminy + 2% BSA + 2,5 g/L NaHCO33 + 10 mM glukozy

Tabela 9

EtapDzieńPodłożaSuplement
S5d10-d12S5T3 1 µMALK5i II 10 µMSANT-1 0.25 µMRZS 0.05 µMLDN 10 nMITS-X 1:200ZnSO4 10 µMHeparyna 10 µg/mL
S6d13- d19S5T3 1 µMALK5i II 10 µMGSiXX 10 nMLDN 10 nMITS-X 1:200ZnSO4 10 µMHeparyna 10 µg/mL
S7d20- d3S5T3 1 µMALK5i II 10 µMN-Cys 1 mMTrolox 10 µMR428 2 µMITS-X 1:200ZnSO4 10 µMHeparyna 10 µg/mL
pożywka S5: BLAR + 1x suplement L-glutaminy + 2% BSA + 1,5 g/L NaHCO33 + 20 mM glukozy

Tabela 10

Dyskusja

Zagadnienia czasowe dotyczące generowania linii mutantów

Chociaż niedawne podejścia oparte na systemach CRISPR/Cas do edycji genomu doprowadziły do udanego ukierunkowania, bardziej skuteczna i uniwersalna platforma byłaby lepsza w przypadku analiz funkcji genów na większą skalę. Platforma iCRISPR oferuje szybką i skuteczną metodę wprowadzania mutacji do dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania 5,9. Po pierwsze, metoda syntezy gRNA oparta na PCR pozwala na produkcję setek gRNA w formacie macierzowym w ciągu jednego dnia bez czasochłonnych etapów klonowania. Po drugie, przy indukowanej doksycykliną ekspresji Cas9 w hPSC iCas9, etap obejmujący transfekcję gRNA wymaga tylko minimalnego nakładu pracy, a zatem można jednocześnie przeprowadzić wiele eksperymentów celujących w gRNA. Po trzecie, ze względu na wysoką skuteczność celowania, którą można osiągnąć za pomocą naszego systemu, analiza ~ 24 - 48 kolonii na transfekowane gRNA powinna być wystarczająca do ustalenia wielu monoallelicznych i biallelicznych linii mutantów dla jednego genu, chociaż wydajność różni się w zależności od locus docelowego. Ponieważ wyszkolona osoba jest w stanie mechanicznie wybrać 384 kolonie (płytki 4 x 96-dołkowe) za jednym posiedzeniem, co powinno zająć ~ 4 godziny pod mikroskopem preparacyjnym, można oczekiwać, że wyszkolona osoba wygeneruje zmutowane linie wpływające na 12 genów w ciągu 1 - 2 miesięcy. Usprawnione generowanie mutantów hPSC w krótkim czasie pozwala na systematyczną analizę szeregu czynników transkrypcyjnych i/lub komponentów szlaku sygnałowego, które oddziałują ze sobą, regulując proces rozwojowy9. Ponadto skuteczne multipleksowane celowanie w geny otwiera również drzwi do badania interakcji genetycznych leżących u podstaw złożonych cech ludzkich.

Generowanie precyzyjnych modyfikacji genetycznych

Wyprowadzenie specyficznych dla pacjenta iPSC z łatwo dostępnych typów komórek somatycznych i różnicowanie się w typy komórek istotne dla choroby stanowi doskonałą okazję do funkcjonalnej walidacji mutacji związanych z chorobą. Jednak ze względu na znaczną zmienność tła genetycznego między osobami, bezpośrednie porównania między iPSC od pacjentów i od zdrowych dawców mogą nie pozwolić na odróżnienie fenotypów choroby od skutków tła. W związku z tym konieczne jest wygenerowanie izogenicznych kontrolnych iPSC poprzez skorygowanie mutacji choroby z powrotem do sekwencji typu dzikiego lub wprowadzenie mutacji specyficznych dla pacjenta na tle hPSC typu dzikiego, jak proponują inni 25,26. Oprócz mutacji powodujących utratę funkcji (mutacje zerowe) można teraz dokładniej analizować mechanizmy choroby poprzez wprowadzenie specyficznych dla pacjenta zmian sekwencji do endogennego locus w hPSC, w tym mutacji hipermorficznych, hipomorficznych, neomorficznych lub dominująco-ujemnych.

Precyzyjna modyfikacja genetyczna wykorzystuje HDR do naprawy DSB w obecności szablonu naprawczego. Ponieważ jest znacznie mniej wydajny niż naprawa DNA za pośrednictwem NHEJ, plazmid dawcy zawierający mutację specyficzną dla pacjenta, kasetę selekcyjną i ramiona homologiczne były wcześniej używane jako matryca naprawcza2. Po doborze leku i weryfikacji mutacji specyficznej dla pacjenta, zazwyczaj potrzebny jest drugi krok, aby usunąć kasetę wyboru leku. Podczas gdy najczęściej stosowane systemy Cre-loxP i FLP-FRT pozostawiają sekwencję resztkową w endogennym locus, zastosowanie transpozonu PiggyBac pozwoliło na bezproblemowe usunięcie kasety selekcyjnej27 leku. Ostatnio wykazano również, że krótkie matryce ssDNA wspierają wydajny HDR z zaprojektowanymi endonukleazami DNA28. W porównaniu z plazmidem dawcy, ssDNA może być bezpośrednio syntetyzowany, a tym samym omija czasochłonny etap klonowania. W tym przypadku wykazano, że poprzez jednoczesną transfekcję gRNA i matrycy ssDNA w celu wywołania naprawy ukierunkowanej na homologię, iCRISPR może być używany do wprowadzania specyficznych modyfikacji nukleotydów z wysoką wydajnością. Ma to kluczowe znaczenie nie tylko dla analizy roli niezbędnych nukleotydów w domenach funkcjonalnych białek, ale także dla modelowania mutacji chorób u ludzi i potencjalnej korekty tych mutacji związanych z chorobą w celu interwencji terapeutycznej. Ze względu na dużą liczbę loci podatności, z których każdy jest związany z wieloma wariantami sekwencji, modelowanie złożonych i wielogenowych chorób, takich jak cukrzyca, było wyzwaniem dla genetyków. Ponieważ platforma iCRISPR jest dopuszczalna do szybkiego generowania serii alleli lub do multipleksowania genów, może ułatwić badanie wielu loci związanych z chorobą, zarówno indywidualnie, jak i w połączeniu z tłami izogenicznymi.

Skuteczność kierowania i efekty niezgodne z celem

Znaleźliśmy dobrą korelację między wynikami testu T7E1 i RFLP a liczbą zmutowanych linii zidentyfikowanych przez sekwencjonowanie. Podkreśla to znaczenie wykonywania tych testów równolegle z ustanawianiem linii klonalnych. Podczas gdy osiągnięta skuteczność celowania może się różnić w zależności od loci genomu, w większości eksperymentów z pojedynczym genem stwierdzono u 20 do 60% klonów ze zmutowanymi obydwoma allelami (w tym mutacjami w ramce i przesunięciem ramki odczytu)9. W przypadkach, w których przeprowadzono celowanie genowe w multipleksy, uzyskano potrójne zmutowane klony bialleliczne o skuteczności 5-10%5. Przeprowadzono również HDR kilku genów za pośrednictwem ssDNA, aby uzyskać precyzyjne zmiany genetyczne, przy czym skuteczność otrzymywania homozygotycznych klonów knock-in wahała się od 1 do 10%5. Pracując z CRISPR/Cas w hPSC, wszelkie mutacje w potencjalnych miejscach poza celem, które nie mają tej samej sekwencji docelowej gRNA, nie zostały jeszcze wykryte 5,9,12. Sekwencjonowanie całego genomu przeprowadzone w niedawnym badaniu również nie zidentyfikowało istotnych mutacji poza celem w klonalnych liniach hPSC wygenerowanych przy użyciu CRISPR/Cas29. Niemniej jednak, aby zminimalizować potencjalny efekt zakłócających fenotypów wprowadzonych przez mutacje w miejscach efektu poza celem, sugeruje się generowanie niezależnych linii mutantów przy użyciu co najmniej dwóch niezależnych gRNA ukierunkowanych na różne sekwencje w obrębie tego samego genu. Podobne fenotypy obserwowane w wielu liniach generowanych przy użyciu różnych gRNA mogą zasadniczo wykluczyć możliwość, że fenotyp pochodzi z efektu off-target.

Kultura zależna od feedera a kultura niezależna i targetowanie

Tradycyjne metody hodowli hPSC polegają na ich utrzymywaniu i namnażaniu na komórkach żywiciela w pożywkach zawierających surowicę lub zamiennik surowicy, który obejmuje produkty pochodzenia zwierzęcego, takie jak albumina surowicy bydlęcej. Komórki zasilające, surowica, wymiana surowicy i albumina zawierają złożone, niezdefiniowane składniki i wykazują znaczną zmienność partii. Przystosowanie się do warunków wolnych od karmów i zdefiniowanych chemicznie znacznie zmniejsza wysiłek związany z utrzymaniem hPSC i, co ważniejsze, zwiększa spójność eksperymentów różnicujących. Obecnie istnieje bardzo niewiele badań, które opisują procedury edycji genomu na hPSC hodowanych w całkowicie określonych warunkach hodowli30. Odkryliśmy wyższą skuteczność celowania w CRISPR, gdy transfekcja gRNA i depozycja klonalna przeprowadzono w warunkach wolnych od karmnika w porównaniu z warunkami hodowli zależnymi od karmnika. Uważamy, że wynika to ze zwiększonej przeżywalności komórek po transfekcji i wysiewie pojedynczych komórek w celu utworzenia kolonii. Co więcej, wcześniej wykazano, że komórki zasilające sekwestrują odczynniki transfekcji, obniżając w ten sposób wydajność transfekcji.

Połączenie edycji genomu z ukierunkowanym różnicowaniem

Poprzednie protokoły różnicowania dały tylko niewielką frakcję komórek insulinododatnich, z których większość była polihormonalna i przypominała płodowe komórki endokrynne23. Niedawny postęp pozwolił na różnicowanie hPSC w bardziej dojrzałe komórki beta-podobne reagujące na glukozę 16,17,19,20. Możemy rutynowo uzyskać co najmniej 75% ostatecznych komórek endodermy, 40% komórek progenitorowych trzustki PDX1 + NKX6.1 + i około 20% komórek beta reagujących na glukozę NKX6.1 + CPEP + za pomocą HUES8 hPSCs9. W połączeniu z systemem edycji genomu iCRISPR, ten bardziej niezawodny protokół różnicowania ułatwił analizę czynników transkrypcyjnych, które mają kluczowe znaczenie dla progenitorowych i endokrynologicznych etapów różnicowania trzustki. Umożliwi to, w przyszłych badaniach, zbadanie dużej liczby genów kandydujących na chorobę w celu walidacji funkcjonalnej i zbadania mechanizmów leżących u podstaw cukrzycy9.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki

Nasz system iCRISPR może ułatwić generowanie bardziej złożonych modyfikacji genomu, takich jak tworzenie alleli reporterowych poprzez celowanie genowe za pośrednictwem HDR przy użyciu długich szablonów DNA dawcy kodujących znaczniki białkowe lub reporterów fluorescencyjnych12. Wykazaliśmy, że ze względu na wysoką skuteczność celowania w CRISPR osiągniętą w systemie, proces ten może być przeprowadzany w hPSC, bez konieczności dalszej selekcji leków12. Co więcej, multipleksowane celowanie genowe może być wykorzystywane do badania interakcji genetycznych leżących u podstaw złożonej choroby ludzkiej, jak wykazano w naszym niedawnym badaniu, które naszym zdaniem jest pierwszym przykładem takiej pracy31. iCRISPR może być również wykorzystany do zrozumienia kontroli regulacyjnej genów poprzez tworzenie delecji w niekodujących RNA lub w regionach regulatorowych genów, takich jak promotory i wzmacniacze. Aby skutecznie generować mutanty regulatorowe za pomocą iCRISPR, gRNA można zaprojektować tak, aby zakłócały miejsce wiązania białka wiążącego DNA, w tym między innymi podstawową maszynerię transkrypcyjną lub specyficzny tkankowo czynnik transkrypcyjny. HDR za pośrednictwem matrycy ssDNA może być również stosowany do mutacji określonych miejsc wiązania białek. Wreszcie, przewidujemy, że dalsza optymalizacja umożliwi wykorzystanie platformy iCRISPR w hPSC do bardziej przepustowych analiz genetycznych fenotypów pluripotencji lub fenotypów choroby w połączeniu z protokołem różnicowania in vitro . Te badania za pośrednictwem iCRISPR mogą pozwolić na szybszą identyfikację potencjalnych genów związanych z chorobą i badania ich znaczenia funkcjonalnego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH/NIDDK (R01DK096239) i New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). Z.Z. był wspierany przez NYSTEM postdoctoral fellowship z Center for Stem Cell Biology of the Sloan Kettering Institute.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicznie zdefiniowane podłoże (E8)Thermo Fisher ScientificA1517001Essential 8 podłoże podstawowe i suplement Essential 8 w zestawie
Skrócona rekombinowana ludzka forma witronektynyThermo Fisher ScientificA14700
inhibitor ROCK Y-27632Selleck ChemicalsS1049
Odczynnik dysocjacyjny (enzym TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific125630291x, bez pochodzenia zwierzęcego, rekombinowany enzym
Siarczan G418Thermo Fisher Scientific10131035Geneticin Selektywny antybiotyk
Chlorowodorek puromycynySigma-AldrichP8833Puromycin Selektywna antybiotykowa
polimeraza DNA (fuzja Herculase II)Agilent Technologies600679Zestaw do PCR
MEGAshortscript T7 Transkrypcja zestawThermo Fisher ScientificAM1354
MEGAclear Zestaw do czyszczenia transkrypcjiThermo Fisher ScientificAM1908
Hyklan doksycyklinySigma-AldrichD9891
Opti-MEM mediumThermo Fisher Scientific31985062Reduced Serum
Medium Lipofectamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher Scientific
DNeasy Krew & Zestaw tkanekQIAGEN69504Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA
Proteinaza KRoche3115879001
MCDB 131 mediumThermo Fisher Scientific10372-019
BLAR mediumThermo Fisher ScientificWykonane na zamówienie z opublikowanym preparatem (Rezania et al., 2014)
Suplement L-glutaminy (GlutaMAX)Thermo Fisher Scientific35050061
NaHCO3Thermo Fisher Scientific144-55-8
GlukozaSigma-AldrichG8769
BSALAMPIRE Laboratoria biologiczne7500855Bez kwasów tłuszczowych
GDF8PeproTech120-00
CHIR-99021Stemgent04-0004Inhibitor GSK-3
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA4544Witamina C
FGF7R& D Systems251-KG
SANT1Tocris Bioscience1974Inhibitor jeża
RASigma-AldrichR2625Kwas retinowy
LDNStemgent04-0019Inhibitor BMP
IWP-2Tocris Bioscience3533Antagonista Wnt 
ITS-XThermo Fisher Scientific51500-056
Aukcje internetowe TPBEMD Millipore565740-1MGAktywator
PKC 3,3',5-Triiodo-L-tyronina (T3)Sigma-AldrichT6397
ALK5i IIEnzo Life SciencesALX-270-445Inhibitor ALK5 II
ZnSO4Sigma-AldrichZ0251
HeparynaSigma-AldrichH3149
GSiXX EMDMilipory565789Inhibitor sekretazy gamma XX, inhibitor sygnalizacji NOTCH
N-Cys (N-acetylocysteina)Sigma-AldrichA9165
TroloxEMD Millipore648471Analog witaminy E
R428Selleck ChemicalsS2841Kinaza tyrozynowa receptora AXL inhibitor
24 mm Transwell z wkładkąCorning Life Sciences3414
Gene Pulser Xcell System elektroporacjiBio-Rad1652660
0,4 cm Kuwety do elektroporacjiBio-Rad1652081
AAVS1-TALEN-LAddgene59025
AAVS1-TALEN-RAddgene59026
AAVS1-Neo-M2rtTAAddgene60843
AAVS1-Puro-iCas9Addgene58409
Endonukleaza T7 INEBM0302L
Bufor 2NEBB7002SNEBuffer 2
Długi oligonukleotydEton Bioscience lub IDT
Przeciwciało SOX17R& D SystemsAF19241:500
Przeciwciało FOXA2Millipore07-6331:100
Przeciwciało CXCR4-APCR& D SystemsFAB170A1:25
Przeciwciało PDX1R& D SystemsAF24191:500
Przeciwciało NKX6.1DSHBF55A121:500
Przeciwciało NKX2.2DSHB74.5A51:100
Przeciwciało NEUROD1Santa Cruz Biotechnologysc-10841:100
Przeciwciało insulinyDakoA05641:2,000
Przeciwciało peptydu CDSHBGN-ID4-c1:2,000
Przeciwciało glukagonuSigma-AldrichG26541:1,000
13778150

Bibliografia

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
  2. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  3. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).
  4. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  5. González, F., et al. An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  8. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).
  9. Zhu, Z., et al. Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes. Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).
  10. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  11. Carlson-Stevermer, J., et al. High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).
  12. Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).
  13. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Rezania, A., et al. Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells. Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).
  16. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  17. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  18. Chen, S., et al. A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage. Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).
  19. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  20. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  21. Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).
  22. Soh, C. L., Huangfu, D. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium. Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).
  23. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  24. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).
  25. Musunuru, K. Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models. Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).
  26. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  27. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  28. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  29. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  30. Huang, X., et al. Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  31. Shi, Z. D., et al. Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development. Cell Stem Cell. , in press (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie pluripotencjalne komórki macierzystesystem iCRISPRekspresja Cas9locus AAVS1test T7E1komórki beta trzustkikomórki reagujące na glukozęnaprawa kierowana homologią
Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.