Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55270

⸱

29 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Po przygotowaniu zmodyfikowanego 64Cu przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z transgenicznym receptorem mysich limfocytów T, limfocyty T są znakowane radioaktywnie in vivo, analizowane pod kątem żywotności, funkcjonalności, stabilności znakowania i apoptozy, a następnie adoptycyjnie przenoszone do myszy z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego w drogach oddechowych do nieinwazyjnego obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT).

Streszczenie

Ten protokół ilustruje produkcję 64Cu i koniugację/radioznakowanie chelatora przeciwciała monoklonalnego (mAb), a następnie hodowlę komórek mysich limfocytów i celowanie w receptor przeciwciała 64Cu komórek. Opisano ocenę in vitro znakowania radioaktywnego oraz nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo w zwierzęcym modelu reakcji nadwrażliwości typu opóźnionego (DTHR) dróg oddechowych za pomocą PET/CT.

Szczegółowo, pokazano koniugację mAb z chelatatorem kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowego (DOTA). Po wytworzeniu radioaktywnego 64Cu opisano znakowanie radioaktywne mAb sprzężonego z DOTA. Następnie przedstawiono ekspansję komórek pomocniczych T wytwarzających interferon CD4 + (IFN) swoisty dla albuminy jaja kurzego (cOVA) (cOVA-TH1) i γ późniejsze znakowanie radioaktywne komórek cOVA-TH1. Przedstawiono różne techniki in vitro w celu oceny wpływu znakowania radioaktywnego 64Cu na komórki, takie jak określenie żywotności komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego, barwienie apoptozą za pomocą aneksyny V w cytometrii przepływowej oraz ocena funkcjonalności za pomocą testu immunoenzymatycznego IFN-γ (ELISA). Ponadto szczegółowo opisano sposób oznaczania wychwytu promieniotwórczego przez komórki i stabilność znakowania. Protokół ten opisuje ponadto, w jaki sposób przeprowadzać badania śledzenia komórek w modelu zwierzęcym dla DTHR dróg oddechowych, a zatem uwzględniono indukcję ostrego DHTR w drogach oddechowych wywołanego cOVA u myszy BALB/c. Na koniec przedstawiono solidny przebieg pracy PET/CT, w tym akwizycję, rekonstrukcję i analizę obrazu.

Podejście do celowania w receptor przeciwciał 64Cu z późniejszą internalizacją receptora zapewnia wysoką specyficzność i stabilność, zmniejszoną toksyczność komórkową i niskie wskaźniki wypływu w porównaniu do popularnych znaczników PET do znakowania komórek, np. 64Cu-pirowaldehyd bis(N4-metylotiosemikarbazon) (64Cu-PTSM). Wreszcie, nasze podejście umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo za pomocą PET/CT z optymalnym stosunkiem sygnału do tła przez 48 godzin. To eksperymentalne podejście można przenieść na różne modele zwierzęce i typy komórek z receptorami związanymi z błoną, które są zinternalizowane.

Wprowadzenie

Nieinwazyjne śledzenie komórek to wszechstronne narzędzie do monitorowania funkcji komórek, migracji i naprowadzania in vivo. Ostatnie badania nad śledzeniem komórek koncentrowały się na mezenchymalnych1,2 lub komórkach macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego3 w kontekście medycyny regeneracyjnej, autologicznych białych krwinek obwodowych w stanie zapalnym lub limfocytach T w adoptywnych terapiach komórkowych przeciwko rakowi3,4. Wyjaśnienie miejsc działania i podstawowych zasad biologicznych terapii komórkowych ma ogromne znaczenie. Cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, genetycznie modyfikowane limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) lub limfocyty naciekające nowotwór (TIL) były powszechnie uważane za złoty standard. Jednak komórki TH1 specyficzne dla antygenu nowotworu okazały się skuteczną alternatywną opcją leczenia4,5,6,7.

Jako kluczowi gracze w stanach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych specyficznych dla narządów (np. reumatoidalnym zapaleniu stawów lub astmie oskrzelowej) oraz komórkach o dużym zainteresowaniu immunoterapią nowotworów, ważne jest scharakteryzowanie czasowej dystrybucji i wzorców naprowadzania komórek TH1. Nieinwazyjne obrazowanie in vivo metodą PET przedstawia ilościową, bardzo czułą metodę8 do badania wzorców migracji komórek, naprowadzania in vivo oraz miejsc działania i odpowiedzi limfocytów T podczas stanu zapalnego, alergii, infekcji lub odrzucenia nowotworu9,10,11.

Klinicznie, 111In-oxine jest używany do scyntygrafii leukocytów w celu rozróżnienia stanu zapalnego i infekcji12, podczas gdy 2-deoksy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) jest powszechnie używany do badań śledzenia komórek przez PET3,13. Jedną z głównych wad tego znacznika PET jest jednak krótki okres półtrwania radionuklidu 18F po 109,7 min oraz niska stabilność wewnątrzkomórkowa, która utrudnia obrazowanie w późniejszych punktach czasowych po adoptywnym transferze komórek. W przypadku długoterminowych badań in vivo śledzenia komórek za pomocą PET, chociaż niestabilny w komórkach, 64Cu-PTSM jest często używany do niespecyficznego znakowania komórek14,15 ze zminimalizowanym szkodliwym wpływem na żywotność i funkcję limfocytów T16.

Ten protokół opisuje metodę dalszego zmniejszania niekorzystnego wpływu na żywotność i funkcjonowanie komórek za pomocą specyficznego dla receptora limfocytów T (TCR) znakowanego radioaktywnie mAb. Po pierwsze, pokazano wytwarzanie radioizotopu 64Cu, koniugację mAb KJ1-26 z chelatorem DOTA, a następnie znakowanie radioaktywne 64Cu. W drugim etapie szczegółowo opisano izolację i ekspansję komórek cOVA-TH1 myszy dawców DO11.10 oraz znakowanie radioaktywne mAb KJ1-26 KJ1-26 (64Cu-DOTA-KJ1-26) naładowane radiowolnie. Przedstawiono ocenę wartości wychwytu i wypływu promieniotwórczości odpowiednio za pomocą kalibratora dawki i zliczania γ, a także ocenę wpływu znakowania radioaktywnego 64Cu na żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego i funkcjonalność testu ELISA IFN-γ. W przypadku nieinwazyjnego śledzenia komórek in vivo opisano uzyskanie mysiego modelu ostrego DTHR w drogach oddechowych wywołanego cOVA oraz akwizycję obrazu za pomocą PET/CT po adoptywnym transferze komórek.

Ponadto, to podejście do etykietowania może być przeniesione do różnych modeli chorób, mysich limfocytów T z różnymi TCR lub ogólnie interesujących komórek z receptorami związanymi z błoną lub markerami ekspresji leżącymi u podstaw ciągłego transportu błonowego17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Środki ostrożności: Podczas pracy z radioaktywnością, przechowuj 64Cu za ołowianymi cegłami o grubości 2 cali i używaj odpowiednich osłon dla wszystkich statków przenoszących aktywność. Używaj odpowiednich narzędzi do pośredniego obchodzenia się z nieekranowanymi źródłami, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z ręką i zminimalizować narażenie na materiał radioaktywny. Zawsze noś plakietki monitorowania dozymetrii promieniowania i środki ochrony indywidualnej oraz sprawdzaj siebie i miejsce pracy pod kątem zanieczyszczenia, aby natychmiast się nim zająć. Przed opuszczeniem obszaru, w którym używany jest materiał radioaktywny, należy wyrzucić potencjalnie skażone środki ochrony osobistej. Przechowywać wszystkie odpady promieniotwórcze za osłoną ołowiową do czasu rozpadu radioaktywnego 64Cu (około 10 okresów połowicznego rozpadu = 127 godzin) przed odpowiednią utylizacją.

1. 64Cu Produkcja

UWAGA: Radioizotop 64Cu jest wytwarzany w reakcji jądrowej 64Ni(p,n)64Cu przy użyciu cyklotronu PETtrace zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem McCarthy'ego i wsp.18.

  1. W celu wytworzenia 64Cu należy napromieniować 64Ni, który jest galwanicznie nawalany na płytce platynowo-irydowej (90/10), 30 μA przez 6 godzin wiązką protonów o mocy 12,4 MeV.
  2. Podgrzać tarczę platynowo-irydową do 100 °C w dedykowanej komorze polieteroeteroketonu (PEEK) i inkubować w 2 ml stężonego HCl przez 20 minut do rozpuszczenia 64Cu/64Ni.
  3. Dodaj kolejny 1 ml stężonego HCl i inkubuj przez 10 minut.
  4. Odparować HCl za pomocą strumienia argonu i schłodzić komorę do temperatury pokojowej.
  5. Przepłukać komorę 3 ml 4% 0,2 M HCl i 96% metanolu (v/v) i przenieść ten roztwór do kolumny jonowymiennej, która była wstępnie kondycjonowana 4% 0,2 M HCl w metanolu przez co najmniej 15 minut. Przepływowy może być wykorzystany do recyklingu 64Ni.
  6. Przepłukać 64Cu zatrzymane w kolumnie 4% 0,2 M HCl w metanolu.
  7. Eluować 64Cu z 70% 1,3 M HCl/30% izopropanolem (v/v) do fiolki zbiorczej, odparować roztwór w strumieniu argonu i pozostawić fiolkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
  8. Rozpuścić 64Cu w 140-210 μL 0,1 M HCl.

2. Koniugacja przeciwciał z DOTA i późniejsze znakowanie radioaktywne 64 Cu

UWAGA: chelator DOTA zostanie połączony z funkcjonalnymi grupami aminowymi mAb za pomocą chemii estrów N-hydroksysukcynimidu (NHS), a koniugat zostanie następnie znakowany radioaktywnie za pomocą 64Cu19.

  1. Dostosuj stężenie KJ1-26-mAb do 8 mg/ml i diafiltruj 1 ml roztworu mAb przeciwko 0,1 M Na2HPO4 pH 7,5 potraktowanemu 1,2 g/l chelatującej żywicy jonowymiennej przy użyciu odśrodkowego filtra odcinającego masę cząsteczkową (MWCO 30 kDa). Zastosować 3 kolejne etapy przemywania z 14 ml buforu. Po ostatnim etapie płukania ponownie zagęścić roztwór do 1 ml. Określ ilościowo stężenie przeciwciał za pomocą pomiarów OD280 nm.
  2. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować roztwór DOTA-NHS w wodzie ultraczystej lub o stężeniu 10 mg/ml. Przed otwarciem pozwól fiolce dostosować się do temperatury pokojowej, aby uniknąć kondensacji wody, i ostrożnie usuń DOTA-NHS za pomocą plastikowej szpatułki. Dodać 216 μl tego roztworu DOTA-NHS do 8 mg diafiltrowanego roztworu KJ1-26-mAb, dokładnie wymieszać i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 °C w mieszalniku bębnowym.
  3. Diafiltrować DOTA-KJ1-26-mAb przeciwko 0,25 M octanowi amonu, pH 7,0, potraktowany 1,2 g/l chelatującej żywicy jonowymiennej, przy użyciu odśrodkowego filtra odcinającego masę cząsteczkową (MWCO 30 kDa). Zastosuj 7 etapów prania. Stężyć mAb do końcowej objętości 1 ml i ponownie zmierzyć stężenie białka za pomocą pomiarów OD280nm.
  4. Przed znakowaniem radioizotopem należy wymienić bufor DOTA-KJ1-26-mAb na PBS za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość przy użyciu żelowych kolumn filtracyjnych. Usuwa to również potencjalne zanieczyszczenia drobnocząsteczkowe.
  5. Przygotować roztwór 100 MBq 64CuCl2 w 10 mM HCl i dostosować pH do 6-7 za pomocą 10x PBS. Dodać 200 μg DOTA-KJ1-26-mAb. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  6. W celu kontroli jakości należy przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową z 0,1 M cytrynianem sodu (pH 5) jako fazą ruchomą i przeanalizować za pomocą autoradiografii. Co najmniej 90% aktywności powinno być związane z przeciwciałem, a tym samym wykryte w miejscu początkowym. Niezwiązana aktywność jest chelatowana przez fazę ruchomą na bazie cytrynianu i smugi do czoła rozpuszczalnika. W celach informacyjnych zaleca się stosowanie 64CuCl2.

3. Izolacja i ekspansja komórek TH1 (cOVA-TH1) specyficznej dla albuminy jaja kurzego

UWAGA: Hodowla komórek TH1 jest opisana zgodnie z wcześniej opublikowanymi badaniami16,17.

  1. Wyizoluj śledziony i pozaotrzewnowe węzły chłonne (LN) od myszy DO11.10.
    1. Poświęć mysz zgodnie z przepisami federalnymi. Zdezynfekuj zwierzę 70% etanolem i utrwal je taśmą klejącą w celu usunięcia śledziony i LN. Wykonaj środkowe nacięcie i oddziel skórę od otrzewnej, pociągając ją bocznie do każdego miejsca.
    2. Zlokalizuj LN szyjki macicy, osiowo, ramienny i pachwinowy. Usuń je kleszczami i umieść w 1% płodowej surowicy cielęcej (FCS)/PBS.
    3. Otwórz otrzewną i zlokalizuj śledzionę. Oddzielić śledzionę od trzustki i tkanki łącznej i umieścić ją w 1% buforze FCS/PBS. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w odnośnikach20,21.
  2. Zmielić śledzionę i LN przez filtr 40 μm do probówki z nakrętką o pojemności 50 ml za pomocą tłoka strzykawki. Przepłukać filtr 10 ml 1% buforem FCS/PBS.
  3. Wirować przy 400 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Następnie należy przeprowadzić lizę erytrocytów, dodając bufor do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) (1,5 ml na zwierzę dawcy) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 8,5 ml 1% buforu FCS/PBS (na zwierzę dawcy).
  4. Odwirować komórki o sile 400 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Przemyć komórki w 10 ml 1% buforu FCS/PBS, odwirować przy 400 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  5. W celu magnetycznej separacji komórek ponownie zawieś komórki w 1% buforze FCS/PBS i dodaj mikrogranulki CD4+. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje na temat objętości bufora i ilości mikrokulek CD4+, których należy użyć.
  6. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 1% bufor FCS/PBS do 50 ml, odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  7. Kontynuuj izolację komórek T CD4 + za pomocą komercyjnych kolumn separacji magnetycznej i odpowiedniego stojaka magnetycznego zgodnie z protokołem producenta. Dostosuj eluowane limfocyty T CD4 + do stężenia 106 komórek/ml w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium firmy Dulbecco z 10% inaktywowanym termicznie FCS, 2,5% penicyliną/streptomycyną, 1% buforem HEPES, 1% aminokwasami MEM, 1% pirogronianem sodu i 0,2% 2-merkaptoetanolem i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
  8. Zebrać wydzielinę z kolumny do probówki z nakrętką o pojemności 50 ml, aby przygotować komórki prezentujące antygen (APC). Odwirować wylot z kolumny o sile 400 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  9. Dodaj 10 μg/ml anty-CD4 (klon: Gk1,5), 10 μg/ml anty-CD8 (klon: 5367,2) i 10 μg/ml mysiego anty-szczurzego mAb (MAR18,5) i 1,5 ml dopełniacza królika. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
  10. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i dodać 3 ml pożywki. Napromieniuj APC na źródło promieniowania γ lub rentgenowskiego o łącznej wartości 30 Gy. Następnie dostosuj APC do stężenia 5 x 106 komórek/ml.
  11. Dodaj 100 μl limfocytów T CD4+ i 100 μl APC na 96-dołkową płytkę razem z 10 μg/ml peptydu cOVA 323-339, 10 μg/ml anty-IL-4-mAb, 0,3 μM CPG1668-oligonukleotydów i 5 U/ml IL-2.
  12. Dodawać 50 j./ml IL-2 co drugi dzień. Po 3 - 4 dniach przenieś komórki z płytek 96-dołkowych na płytki 24-dołkowe. Połącz 3-5 dołków z płytki 96-dołkowej w jednym dołku na płytce 24-dołkowej. Dodać 100 j/ml pożywki zawierającej IL-2 w stosunku 1:1.
  13. Po kolejnych 2-3 dniach przenieść komórki z płytki 48-dołkowej do kolb do hodowli komórkowych o długości 175 cm(1 x 48-dołkowa płytka na kolbę). Napełnij pożywką w proporcji 1:1. Dodawać 50 j./ml IL-2 co drugi dzień.
  14. Podziel komórki zgodnie z gęstością komórek i dodawaj 50 U/ml IL-2 co drugi dzień. W ten sposób hoduj komórki przez kolejne 10 dni.

4. Znakowanie radiokomórkowe cOVA-TH1

UWAGA: 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb zostaną zastosowane do hodowanych komórek cOVA-TH1, aby umożliwić wewnątrzkomórkowe znakowanie radioaktywne.

  1. W celu znakowania radioizotopowego komórek cOVA-TH1 należy pobrać 37 MBq z znakowanych radioizotopowo 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb do strzykawki bez martwej objętości za pomocą kalibratora dawki. Dodaj 1 ml soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór o stężeniu 37 MBq/ml.
  2. Zawiesić komórki cOVA-TH1 w pożywce w ilości 2 x 106 komórek/ml i dodać 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki na 48-dołkowej płytce.
  3. Dodać 20 μl świeżo przygotowanego roztworu 37 MBq/ml 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Ostateczny stosunek do etykietowania wynosi 0,7 MBq na 10-6 komórek w objętości 520 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C i 7,5% CO2 przez 30 minut.
  4. Po inkubacji ostrożnie ponownie zawiesić komórki w każdym dołku i przenieść zawiesinę komórek z płytki 48-dołkowej do probówki z nakrętką o pojemności 50 ml. Aby zminimalizować utratę komórek, spłucz każdą studzienkę wstępnie podgrzanym podłożem.
  5. Odwirować zawiesinę komórek cOVA-TH1 o sile 400 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml wstępnie podgrzanego PBS. Usunąć podwielokrotność zawiesiny komórek w celu zliczenia komórek. Powtórz krok prania.
  6. Policzyć żywotne komórki cOVA-TH1 w odpowiednim rozcieńczeniu z barwieniem błękitem trypanowym.
  7. Dostosuj stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml do dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia 10-7 komórek w 200 μl PBS.
  8. Powtórz kroki 4.3-4.5, aby znakować radioizotopowo komórki cOVA-TH1 ze wzrostem aktywności, np. 1,4 MBq lub 2,1 MBq na 106 komórek.
    1. Do znakowania radioizotopowego komórek 1,4 MBq na 106 komórek należy użyć 40 μl roztworu 37 MBq/ml 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i 60 μl do znakowania radioizotopem 2,1 MBq na 106 komórek. Wykonaj kroki 4.3-4.7 z 0,7 MBq, 1,4 MBq i 2,1 MBq 64Cu-PTSM, ale zwiększ czas etykietowania do 3 godzin dla badań porównawczych17.
    2. Przejdź do kroku 5, aby określić optymalną ilość aktywności.

5. Ocena in vitro wpływu znakowania radioaktywnego na komórki cOVA-TH1

UWAGA: Charakterystyka wpływu radioznacznika na komórki TH1 jest przeprowadzana za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego dla żywotności, IFN-γ ELISA dla oceny funkcjonalności i barwienia PE-Annexin V dla indukcji apoptozy16,17. Oznaczanie wychwytu wewnątrzkomórkowego i wypływu promieniotwórczości opisano również poniżej. Dla porównania, można również użyć 64komórek cOVA-TH1 znakowanych Cu-PTSM.

  1. Wpływ wykluczenia błękitu trypanowego na żywotność
    1. Dostosować co najmniej 18 x 106 komórek cOVA-TH1 znakowanych radioizotopem 0,7 MBq/106 komórek, 1,4 MBq/106 komórek i 2,1 MBq/106 komórek do stężenia 2 x 106 komórek/ml i wykonać kroki 5.1.2-5.1.7 dla każdej dawki aktywności. Jako kontrole należy użyć nieradioaktywnych komórek cOVA-TH1 znakowanych KJ1-26-mAb i nieznakowanych komórek cOVA-TH1.
    2. Odpipetować 1 ml roztworu komórkowego do 9 dołków na 24-dołkowej płytce.
    3. Zebrać zawartość 3 studzienek do 3 oddzielnych probówek z nakrętką o pojemności 15 ml, 3 godziny po wstępnym znakowaniu radioaktywnym.
    4. Przepłukać teraz puste studzienki wstępnie podgrzanym podłożem, aby zminimalizować utratę komórek i dodać pożywkę do odpowiednich probówek z nakrętką o pojemności 15 ml z kroku 5.1.3.
    5. Odwirować probówki o pojemności 15 ml o pojemności 400 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić powstałe osady komórkowe w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża.
    6. Policz zarówno żywe, jak i martwe komórki w trypanie błękitnym oddzielnie dla każdej probówki o pojemności 15 ml i oblicz procent komórek zdolnych do życia.
    7. Powtórz kroki 5.1.3-5.1.6 24 i 48 godzin po znakowaniu radioizotopem 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb.
  2. Wpływ na funkcjonalność określony przez IFN-γ ELISA
    UWAGA: Aby ocenić wpływ znakowania radioaktywnego 64Cu-DOTA-KJ1 26-mAb na produkcję IFN-γ jako markera funkcjonalności, należy wykonać test ELISA IFN-γ od dostawcy komercyjnego i zapoznać się z odniesieniem 17 w celu uzyskania dalszych informacji.
    1. Rozproszyć 105 żywotnych komórek w 100 μl pożywki na 96-dołkowej płytce, 3 godziny po znakowaniu radioizotopem 64Cu-DOTA-KJ1-26 komórek cOVA-TH1 za pomocą 0,7 MBq, 1,4 MBq lub 2,1 MBq. Jako kontrole należy użyć nieznakowanych, nieradioaktywnych komórek cOVA-TH1 znakowanych KJ1-26-mAb lub 64komórek cOVA-TH1 znakowanych Cu-PTSM.
    2. Stymuluj produkcję IFN-γ w 105 64komórkach cOVA-TH1 znakowanych Cu-DOTA-KJ1-26-mAb w 100 μl pożywki z 10 μg/ml peptydu cOVA, 5 U/ml IL-2 i 5x105 APC w 100 μL pożywki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 7,5% CO2 . Dalszą kontrolą mogą być inne warunki bez dodatku peptydu cOVA.
    3. Przeprowadzić analizę supernatantu metodą ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Powtórzyć kroki od 5.2.2 do 5.2.3 po 24 i 48 godzinach po procedurze etykietowania.
  3. Indukcja apoptozy oznaczana przez barwienie PE-Aneksyną V do cytometrii przepływowej
    UWAGA: Aby ocenić indukcję apoptozy za pomocą znaku radioaktywnego 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, należy użyć dostępnego w handlu zestawu do cytometrii przepływowej i przygotować próbki komórek zgodnie z instrukcjami producenta przed barwieniem aneksyną V w celu ekspozycji fosfatydyloseryny na błonie komórkowej.
    1. Po 3, 24 i 48 godzinach od znakowania radioizotopowego 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb komórek cOVA-TH1, wybarwić trzykrotnie co najmniej 106 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb znakowanymi komórkami cOVA-TH1 za pomocą zestawu Annexin V zgodnie z instrukcjami producenta i przeanalizować w ciągu następnej godziny. Użyj nieradioaktywnych komórek cOVA-TH1 znakowanych KJ1-26-mAb, 64Cu-PTSM i nieznakowanych cOVA-TH1 jako kontroli. Więcej informacji można znaleźć w odnośniku 17.
  4. Absorpcja i odpływ
    UWAGA: Wychwyt 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb do komórek mierzy się w kalibratorze dawki, a wypływ radioaktywności mierzy się w teście zliczania γ 0, 5, 24 i 48 godzin po znakowaniu radioaktywnym.
    1. Przygotuj dziesięć probówek do liczenia γ każda dla 64komórek cOVA-TH1 znakowanych cu-DOTA-KJ1-26-mAb, odpowiedniego supernatantu i etapu mycia.
    2. Przenieść 106 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb znakowanych cOVA-TH1 komórek cOVA-TH1 w 1 ml pożywki do każdej z dziesięciu probówek zliczających γ bezpośrednio po znakowaniu radioaktywnym. Dla każdego z punktów czasowych 5, 24 i 48 godzin po znakowaniu radioizotopem należy przechowywać co najmniej 107 64komórek cOVA-TH1 znakowanych izotopem Cu-DOTA-KJ1-26-mAb w pożywce na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 7,5% CO2 .
    3. Odwirować probówki do zliczania γ o sile 400 x g przez 5 minut i przenieść supernatant do dziesięciu nowych probówek do zliczania γ.
    4. Przemyć komórki raz w pożywce o pojemności 1 ml, aby usunąć niezwiązaną frakcję 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i zebrać supernatant w dziesięciu nowych probówkach do liczenia γ.
    5. Dodać 1 ml nowej pożywki do komórek cOVA-TH1 i określić początkową wartość wychwytu w kalibratorze dawki. Probówki można również przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 7,5% CO2 .
    6. Powtórzyć kroki od 5.4.2 do 5.4.5 po 5, 24 i 48 godzinach i zmierzyć wszystkie probówki w liczniku γ zgodnie z protokołem producenta. W celu skorygowania rozpadu promieniotwórczego i analizy ilościowej należy użyć wzorca o określonej dawce promieniotwórczości.

6. Ostre DTHR dróg oddechowych wywołane przez OVA

UWAGA: Dynamika migracji i wzorce naprowadzania adoptywnie przeniesionych i znakowanych radioaktywnie komórek cOVA-TH1 do miejsca zapalenia zostaną zwizualizowane i określone ilościowo w modelu zwierzęcym dla dróg oddechowych wywołanych cOVA-DTHR16,17.

  1. Wstrzyknąć 8-tygodniowym myszom BALB/c i.p. mieszaninę 150 μl żelu aluminiowego/50 μl roztworu cOVA (10 μg w 50 μl PBS) w celu uodpornienia myszy.
  2. Dwa tygodnie po szczepieniu znieczulić myszy 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny przez wstrzyknięcie dożylne. Ułożyć myszy doświadczalne na grzbietach i powoli pipetować 100 μg cOVA rozpuszczonego w 50 μl PBS do nozdrzy zwierząt. Zwierzęta będą wdychać roztwór kropla po kropli.
  3. Powtórz po 24 godzinach. W celu uzyskania silniejszych indukcji DTHR w drogach oddechowych powtórz ponownie po 48 godzinach.
  4. Aby przeanalizować specyficzną migrację przeniesionych komórek cOVA-TH1, indukuj drogi oddechowe-DTHR z indykiem-lub bażantem-OVA jako kontrolą. Dlatego powtórz kroki 6.1-6.3, używając odpowiedniego białka OVA.

7. Obrazowanie in vivo za pomocą PET/CT

UWAGA: Obrazowanie in vivo 64komórek cOVA-TH1 znakowanych Cu-DOTA-KJ1-26-mAb u myszy z chorobą cOVA-DTHR i kontrolnych rodzeństwa z miotu pokazuje specyficzne naprowadzanie i dynamikę migracji komórek cOVA-TH1. Dlatego należy wykonać statyczne skany PET i anatomiczną tomografię komputerową sekwencyjnie 3, 24 i 48 godzin po adoptacyjnym transferze komórek.

  1. Bezpośrednio po znakowaniu radioizotopem dostosuj 64komórki cOVA-TH1 znakowane cu-DOTA-KJ1-26-mAb do 5 x 107 komórek/ml w celu wstrzyknięcia dożylnie 107 komórek w 200 μl.
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 30 pobrać 200 μl zawiesiny komórek cOVA-TH1 znakowanej 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb i wstrzyknąć komórki i.p. do zwierząt z chorobą cOVA-DTHR między 4. a 5. sutkiem. W celu określenia całkowitej wstrzykniętej ilości radioaktywności, należy zmierzyć strzykawkę w kalibratorze dawki przed i po wstrzyknięciu.
  3. Znieczulenie myszy na 10 minut przed pożądanym czasem wchłaniania należy podać 1,5% izofluranu w 100% tlenu (szybkość przepływu: 0,7 l / min) w komorze anestezjologicznej o kontrolowanej temperaturze.
  4. W międzyczasie, aby ułatwić jednoczesną rejestrację obrazów PET i CT podczas analizy obrazu, pod łóżkiem myszy należy zamocować szklane naczynia włosowate zawierające 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb roztwór lub wolny roztwór 64CuCl2.
    1. Dlatego należy przygotować roztwór o stężeniu 0,37 MBq/ml i napełnić nim szklane kapilary o objętości 10 μl. Ponieważ sygnały radioaktywności pochodzące z komórek są z natury słabe, nie należy używać dużych ilości aktywności, aby upewnić się, że markery nie zakłócają sygnałów pochodzących z komórek u myszy.
  5. Po osiągnięciu tolerancji chirurgicznej, na co wskazuje utrata odruchu wycofania pedału kończyny tylnej, przenieś mysz na legowisko dla małych zwierząt kompatybilne z PET i CT, wyposażone w odpowiedni system rurek do utrzymania znieczulenia.
  6. Unieruchom mysz na łóżku dla małych zwierząt za pomocą bawełnianych wacików i taśmy chirurgicznej. Nałóż maść do oczu, aby uniknąć wysuszenia oczu.
  7. Przenieś łóżko myszy do skanera PET, wyśrodkuj pole widzenia z naciskiem na płuca i uzyskaj 20-minutowy statyczny skan PET z oknem energetycznym 350-650 keV.
  8. Przenieś łoże myszy do tomografu komputerowego. W widoku zwiadowczym wyśrodkuj pole widzenia na płucach. Uzyskaj płaski obraz CT za pomocą projekcji 360 stopni podczas obrotu o 360° w trybie "krok i strzelaj" z czasem ekspozycji 350 ms i współczynnikiem kwantowania 4.

8. Analiza obrazu

  1. Rekonstrukcja danych w trybie listy PET poprzez zastosowanie statystycznego iteracyjnego algorytmu maksymalizacji oczekiwań podzbioru (OSEM) i skanów CT do obrazu 3D o rozmiarze piksela 75 μm.
  2. W celu wspólnej rejestracji obrazu w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu (np. Inveon Research Workplace lub Pmod) należy skorzystać z narzędzia do automatycznej korejestracji. Jeśli to się nie powiedzie, użyj szklanych naczyń włosowatych pod łożem myszy jako wskazówek do jednoczesnej rejestracji zrekonstruowanych obrazów PET i CT przestrzennie w widoku osiowym, czołowym i strzałkowym.
  3. Skorygować obrazy PET pod kątem rozpadu promieniotwórczego, korzystając z prawa rozpadu promieniotwórczego i czasu połowicznego rozpadu radionuklidu 64Cu po 12,7 godzinie. Aby znormalizować obraz, wybierz jeden obraz (A) jako odniesienie i dostosuj intensywność wyświetlania obrazu w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu.
    1. Wykorzystując wartości właśnie ustawione dla obrazu referencyjnego (A), wstrzykniętej aktywności (A) i wstrzykniętej aktywności dla innych obrazów (X), znormalizuj pozostałe obrazy za pomocą następującego równania: (wstrzyknięta aktywność (X) / wstrzyknięta aktywność (A)) x wartości intensywności (A).
  4. Narysuj interesujące nas objętości 3D (VOI) na znormalizowanym sygnale PET płucnych i okołotymicznych.
  5. Oznaczyć procentową dawkę wstrzykniętą nacm3 (%ID/cm3) za pomocą następującego równania: (średnia aktywność w VOI/całkowita aktywność u myszy) x 100. Aby uzyskać więcej wskazówek dotyczących analizy obrazu, zobacz referencje22,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat znakowania komórek cOVA-TH1 za pomocą 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb oraz projekt eksperymentalny dla badań in vitro i in vivo opisanych w niniejszym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten stanowi niezawodną i łatwą metodę stabilnego znakowania radioizotopem komórek w celu śledzenia in vivo za pomocą PET. Wykorzystując tę metodę, komórki cOVA-TH1, wyizolowane i namnażone in vitro od myszy dawców, można było znakować radioaktywnie 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, a ich naprowadzanie śledzono do płucnych i okołotymicznych LN jako miejsc prezentacji cOVA w ostrym DTHR dróg oddechowych wywołanym przez cOVA.

Modyfikacja mAb za pomocą chelatora wymaga sz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Julii Mannheim, Walterowi Ehrlichmannowi, Ramonie Stumm, Funda Cay, Danielowi Bukali, Maren Harant oraz Natalie Altmeyer za wsparcie podczas eksperymentów i analizy danych. Prace te były wspierane przez Fundację Wernera Siemensa, DFG za pośrednictwem SFB685 (projekt B6) i Fortüne (2309-0-0).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Niemcy1.0031864Cu produkcja
metanolu, SuprapurMerck, Darmstadt, Niemcy1.0600764Cu produkcja
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Niemcy1.010464Cu produkcja
Pt/Ir (90/10) plateÖ gussaProdukcja na zamówienie64Cu
Komora PEEKWKLProdukcja na zamówienie64Cu produkcja
64NiChemotrade64Cu produkcja
Polygram SIL G/UV 254 płytaMacherey-Nagel80502164Cu
produkcja Wymiana jonowa kolumnaBioRadAG1-X864Cu produkcja
Półprzewodnikowy system docelowy dla PETtraceProdukcja kostiumów WKL64Cu production
64Cu ProdukcjakostiumówWKL wykonany64Cu
Kalibrator dawkiCapintecCRC-25R
PETtrace cyklotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMakrocykliczneB-280Koniugacja DOTA
Przeciwciało anty-cOVA-TCR (KJ1-26)Wyizolowane z hodowli komórek hybrydomaKoniugacja DOTA
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633Koniugacja DOTA
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901Koniugacja DOTA
Jednostka filtrująca Amicon Ultra-15Merck MilliporeUFC910008koniugacja DOTA
Rotipuran ultraczysta wodaCarl RothHN68.3Koniugacja DAT
Octan amonuSigma-Aldrich32301Koniugacja DAT
PBSUniwersytet w TybindzeKoniugacja DOTA
Micro Bio-spin P-6kolumna Bio-Rad Laboratories7326221Koniugacja DOTA
Cytrynian soduSigma-Aldrich71497Koniugacja DOTA
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116koniugacja DOTA
DMEMMerck Millipore102568składnik do pożywki z limfocytów T 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bskładnik do podłoża limfocytów T 
Pirogronian soduMerck MilliporeL0473składnik dla pożywki z limfocytów T 
MEM-aminokwasyMerck MilliporeK0293składnik dla pożywki limfocytów T 
HEPES Merck MilliporeL 1613składnik dla pożywki z limfocytów T 
  Penicylina/StreptomycynaMerck MilliporeA2212składnik na pożywkę z limfocytów T 
0,05 mM 2-β-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148składnik do pożywki limfocytów T 
DO11.10 myszy hodowlawłasnaHodowla komórkowa TH1
DPBSGibco14190144Hodowla komórkowa TH1
Sitko komórkowe 40 i mikro; m Corning352340Hodowla komórkowa TH1
ACK Bufor do lizowaniaLonza10-548EHodowla komórkowa TH1
Mikrokulki CD4, myszMiltenyi Biotech130-097-145Hodowla komórkowa TH1
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotech130-090-976Kolumna LS do hodowli komórkowej TH1
Miltenyi Biotech130-042-401Hodowla
przeciwciało anty-CD4 (Gk1.5)Wyizolowane z hodowli komórek hybrydomahodowli komórek TH1
(5367.2)Izolowane z hodowli komórek hybrydomaHodowla komórkowa TH1
Przeciwciało antyszczurze (MAR18.5)Izolowane z hodowli komórek hybrydomaHodowla komórkowa TH1
Dopełniacz królika MAtebu-BioCL3221Hodowla komórkowa TH1
Anty-IL-4 przeciwciało (11B11)Wyizolowane z hodowli komórkowej hybrydomaHodowla komórkowa TH1
cOVA 323-339-peptyd Mikrokolekcje EMCHodowlakomórkowa TH1
CPG1668-oligonukleotydyEurofins MWG OperonHodowla komórkowa TH1zamówienie
IL-2Novartis65483-116-07Hodowla komórkowa TH1
96-dołkowe płytkiGreiner 655180Hodowla komórkowa TH1
24-dołkowe płytkiGreiner 662160Kolba do hodowli komórkowych TH1
Greiner 660175Hodowla komórkowa TH1
48-dołkowe płytkiGreiner 677 Etykietowanie komórek 180
Gammacell 1000Best Theratronicsprzez zapytanie 
Gulmay RT225Gulmayprzez zapytanie 
Ocena błękitu trypanowegoMerck MilliporeL6323in vitro
Mysz IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro ocena
PE Zestaw do wykrywania apoptozy Aneksyny V Ocena 559763in vitro
Probówka 5 mlSarstedt55.476in vitro ocena
Probówki okrągłodenne BD Biosciences352008in vitro ocena
Kreator γ-licznikPerkin-Elmer2480-0010in vitro ocena
Czytnik ELISA MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro ocena
MikroskopLeicavia zapytanie Ocena in vitro
BD LSRII Zapytanie BD Biosciencesvia in vitroevaluation
Myszy BALB/cCharles River028in vivo transport komórek
Żel aluminiowyServa Elektroforeza12261.01in vivo transport komórek
KsylazynaBayerHealthCare Zamówione przez Szpital Uniwersyteckiin vivo transport komórek
KetaminaRatiopharmZamówione przez Szpital Uniwersyteckiin vivo transport komórek
IsofluraneCP-Pharma Zamówioneprzez Szpital Uniwersyteckiin vivo transport komórek
30 G igłaBD Biosciences304000in vivo strzykawka do transportu komórek
BD Biosciences11612491in vivo transport komórkowy Naczynia
włosowate 10 i mikro; LVWR612-2439
Skaner PET InveonSiemens Healthineersnie jest już dostępnyin vivo handel komórkami, alternatywne firmy: Bruker, Mediso 
Skaner Inveon SPECT/CTSiemens Healthineersnie jest już dostępnyin vivo transport komórkowy
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersanaliza obrazu, alternatywne oprogramowanie: Pmod
komórkowa TH1 Przeciwciało anty-CD8 do na zamówieniena

Bibliografia

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765(2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeciwciało znakowane miedzią-64PET/CT transportu komórkowegosprzęganie z chelatorem DOTAizolacja limfocytów T CD4-dodatnichwychwyt przeciwciał radioaktywnychśledzenie komórek in vivoakwizycja obrazów PET/CTmodel nadwrażliwości opóźnionejwzorce homingu limfocytów
Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.