System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia szybkiego systemu in vitro, który wspiera trójwymiarową hodowlę i późniejsze różnicowanie światła pierwotnych komórek nabłonka prostaty.

Streszczenie

Warunkowo przeprogramowane komórki (CRC) zapewniają zrównoważoną metodę pierwotnej hodowli komórek i możliwość rozwoju rozległych "żywych biobanków" linii komórkowych pochodzących od pacjentów. Dla wielu typów komórek nabłonkowych opisano różne podejścia do hodowli trójwymiarowych (3D), które wspierają poprawę stanu zróżnicowanego. Podczas gdy CRC zachowują swoje przywiązanie do linii, z tkanki, z której są izolowane, nie wyrażają wielu markerów różnicowania związanych z tkanką pochodzenia, gdy są hodowane w normalnych dwuwymiarowych (2D) warunkach hodowli. Aby zwiększyć zastosowanie jelit grubych pochodzących od pacjentów w badaniach nad rakiem gruczołu krokowego, zdefiniowano format hodowli 3D, który umożliwia szybkie (łącznie 2 tygodnie) różnicowanie komórek świetlnych zarówno w normalnych, jak i pochodzących z guza komórkach nabłonka prostaty. W niniejszym artykule opisano format oparty na wkładce filtracyjnej, służący do hodowli i różnicowania zarówno normalnych, jak i złośliwych raków jelita grubego gruczołu krokowego. Przedstawiono szczegółowy opis procedur wymaganych do pobierania i przetwarzania komórek do barwienia immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego. Łącznie opisany format hodowli 3D, w połączeniu z podstawowymi liniami CRC, stanowi ważny system modeli o średniej i wysokiej przepustowości do badań nad prostatą opartych na biopróbkach.

Wprowadzenie

Identyfikacja i stosowanie terapii przeciwnowotworowych, które są spersonalizowane dla poszczególnych osób, jest głównym celem badań nad rakiem. Ostatnio opracowano nowe podejścia, które pozwalają na większą łatwość w tworzeniu pierwotnych kultur komórkowych, potencjalnie zapewniając sposoby zarówno identyfikacji, jak i testowania spersonalizowanych terapii. Na przykład metoda organoidów prostaty oparta na R-spondynie¹ pozwala na trójwymiarową (3D) hodowlę prawidłowych i przerzutowych komórek raka prostaty w komercyjnej macierzy zewnątrzkomórkowej (np. Matrigel), podczas gdy metoda warunkowego przeprogramowania komórek (CRC) opracowana w Georgetown^2,3 wykorzystuje bardziej standardowe warunki hodowli 2D. W szczególności połączenie inhibitora kinazy Rho (Y-27632) i napromieniowanych komórek żywiących mysie fibroblasty J2 prowadzi do nieograniczonej hodowli keratynocytów CRCs². Metodologia CRC jest niezwykle solidna, z pierwotnymi liniami komórkowymi z powodzeniem ustanowionymi i utrzymywanymi w nieskończoność z prostaty i wielu innych normalnych i złośliwych tkanek nabłonkowych³. Co ważne, nasza technologia CRC pozwoliła na szybką identyfikację podłoża etiologicznego nawrotu brodawczakowatości oddechowej u pacjenta, u którego nie powiodło się kilka wcześniejszych terapii farmakologicznych. Ponadto, przy użyciu normalnych i pochodzących z nowotworu jelit grubych, pomyślna identyfikacja zatwierdzonego przez FDA leku, worinostatu, została dokonana w ciągu dwóch tygodni od wstępnej biopsji tkanki. Pacjent został umieszczony na worinostacie, co zaowocowało skutecznym leczeniem jego choroby⁴.

Normalny gruczoł krokowy składa się z komórek luminalnych, bazalnych i rzadkich komórek neuroendokrynnych⁵. Komórki luminalne tworzą walcową warstwę nabłonkową gruczołu i wyrażają receptor androgenowy (AR), a także inne markery świetlne, takie jak cytokeratyny 8 i 18 oraz antygen specyficzny dla prostaty (PSA)⁶. I odwrotnie, komórki podstawne są zlokalizowane pod warstwą luminalną i wyrażają cytokeratynę 5 i p63, ale niskie poziomy klasy AR⁵. My^7,8,9 i inni¹⁰ z powodzeniem wykorzystali rak jelita grubego prostaty w przedklinicznych badaniach mechanistycznych wrażliwości na leki. Jednak podczas hodowli w standardowych warunkach hodowli tkankowej 2D, komórki te nie są w stanie w pełni zaangażować sygnalizacji AR¹⁰. Co ważne, po umieszczeniu pod torebką nerkową myszy z niedoborem odporności, CRC odzyskały normalną architekturę i funkcję gruczołów gruczołowych prostaty, co wskazuje, że rak gruczołu krokowego zachowuje swoje zobowiązanie rodowe, gdy zostanie umieszczony w środowisku permisywnym. Opisany tutaj rozwój systemu hodowli komórkowych opartego na wkładkach filtrujących pozwala na szybkie (2 tygodnie) różnicowanie in vitro CRC gruczołu krokowego, o czym świadczy zwiększona ekspresja genów docelowych AR i AR, a także obniżony poziom p63.

Użyte wkłady filtracyjne zawierają membrany poliwęglanowe (wielkość porów, 0,4 μm), które mogą wspierać hodowlę komórek ssaków. System, w takiej formie, w jakiej został opracowany, wykorzystuje normalne i złośliwe raki jelita grubego prostaty, 6-dołkowe szalki hodowlane i wkłady filtracyjne. Pożywkę do hodowli komórkowej kondycjonowaną przez komórki J2¹¹ umieszcza się w dolnej komorze, a pożywkę różnicującą prostatę w górnej komorze. Techniki opisane w niniejszym dokumencie wspierają różnicowanie komórek świetlnych prostaty w ciągu 2 tygodni, zgodnie z celami medycyny spersonalizowanej. Konieczne było również opracowanie metodologii, które pozwolą na kompleksowe profilowanie molekularne, genetyczne i komórkowe kultur. Opracowano i usprawniono metody izolowania DNA, RNA i białek z komórek uwolnionych z powierzchni filtra w celu dokładnego przetwarzania powtarzających się próbek. Na koniec w pełni opisano metodologię wymaganą do usunięcia filtra w celu umożliwienia zatapiania, dzielenia na sekcje oraz barwienia H&E, immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego.

Protokół

1. Ustanowienie Systemu Wstawiania Kultur Komórkowych 3D

1. Umieść 2 wkładki do hodowli komórek poliwęglanowych w odwróconej orientacji (filtrem do góry) w dół na płytce 6-dołkowej (rysunek 1A).
2. Nałóż cienką warstwę 0,1% żelatyny w wodzie na spód wkładu i pozostaw do wyschnięcia (10-20 min) w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
3. Powtórz krok 1.2 jeszcze dwa razy, w sumie 3 aplikacje 0,1% żelatyny na wkładki.
   UWAGA: Powłoka żelatynowa pomoże ograniczyć dyfuzję między komorami.
4. Aby zebrać pierwotne CRC ze standardowych warunków hodowli, dodać 5 ml PBS w celu umycia kolby hodowlanej.
   1. Trypsynizować komórki za pomocą (1 ml dla T-25 i 2 ml dla T-75) 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukaj w bok kolby, aby pomóc w usunięciu komórek. Następnie przystąp do zatrzymania reakcji trypsyny i zbierz komórki, dodając 5 ml kompletnego DMEM.
   2. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C i 188 x g i policzyć za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
   3. Ponownie zawiesić 600 000 CRC w 250 μl kondycjonowanej pożywki (CM) i dodać do prawidłowo zorientowanej (filtrem stroną do dołu) wkładki hodowlanej (Rysunek 1B). Nazywa się to komorą wewnętrzną.
      Uwaga: CM jest kondycjonowany przez napromieniowane komórki J2 i zawiera 10 μm Y-27632, jak opisano wcześniej^7,8,9,11.
5. Nanieść 2 ml CM na zewnętrzną komorę płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (przez co najmniej 18 godzin).
6. Ostrożnie wyjmij CM z komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl i powoli dodaj pożywkę różnicującą (DM) do komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż do napełnienia. Uważaj, aby nie naruszyć warstwy komórek.

2. Utrzymanie kultur 3D

1. Codziennie sprawdzaj kultury. Zdrowe komórki pojawiają się, jak pokazano na rysunku 2.
2. Zmieniaj CM w komorze zewnętrznej codziennie lub co drugi dzień w zależności od metabolizmu komórek.
3. Gdy pożywka w komorze wewnętrznej zmieni kolor (żółty), ostrożnie wyjmij pożywkę z wewnętrznej komory filtra za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl.
4. Zassać pożywkę w zewnętrznej komorze na płytkę 6-dołkową za pomocą końcówki zasysającej.
5. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml powoli nanieś świeżą masę do komory wewnętrznej, aż do jej wypełnienia. Uważaj, aby nie zeskrobać ani w inny sposób nie usunąć warstwy komórek.
6. Zastąp pożywkę w komorze zewnętrznej 2 ml świeżego CM.
7. Utrzymuj kultury przez 2 tygodnie, a następnie przystąp do przetwarzania w celu uzyskania pożądanej izolacji dwucząsteczkowej.
   UWAGA: Każdy rząd na płytce 6-dołkowej, w sumie sześć wkładek (Figura 1B), powinien być przetworzony na eksperyment, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do analizy, DNA, RNA lub białka
.
8. Odessać pożywkę w komorze zewnętrznej i przepłukać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
9. Ostrożnie wyjmij pożywkę z komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl i dodaj 500 μl PBS. Unikaj skrobania lub w inny sposób naruszania komórek na membranie.
10. Odessać PBS z komory zewnętrznej i ostrożnie usunąć PBS z komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl. Po usunięciu PBS przejdź bezpośrednio do odpowiedniej aplikacji opisanej poniżej. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany. Kulturę można przechowywać przez krótki czas w PBS, dopóki aplikacja nie będzie gotowa do rozpoczęcia.

3. Przetwarzanie filtrów do bankowania peletów

1. Dodać 100 μl 0,25% trypsyny-EDTA do każdej komory wewnętrznej i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
2. Krótko i ostrożnie wymieszać/zeskrobać komórki na powierzchni membrany pipetą o pojemności 200 μl, pipetując w górę i w dół (unikać nakłuwania membrany). Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj 250 μl CM do pierwszej komory wewnętrznej i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przepłukać filtr.
4. Przenieś zawieszone komórki do sąsiedniej komory filtracyjnej, która zawiera te same warunki pożywki i powtórz pipetowanie w górę iw dół.
5. Powtórz tę procedurę dla każdej z wstawek pojedynczego warunku. Zebrać i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
6. Przepłucz każdą komorę wewnętrzną dodatkowymi 100-200 μl CM, aby zebrać pozostałe komórki. Dodaj do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml w kroku 3.5.
7. Wirować komórki w temperaturze 423 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
8. Odessać supernatant i przemyć osad komórkowy jednorazowo 1000 μl PBS.
9. Wirować ponownie w temperaturze 423 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 5 min.
10. Odessać PBS i zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

4. Przetwarzanie filtrów do izolacji RNA lub DNA

1. Dodać 200 μl tiocyjanianu guanidyny, chloroformu fenolowego lub podobnego odczynnika ekstrakcyjnego do komory wewnętrznej i krótko wymieszać komórki na powierzchni membrany, pipetując w górę i w dół.
2. Inkubować w odczynniku ekstrakcyjnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej z suchą komorą zewnętrzną.
   1. Ponieważ filtr może odłączyć się od wkładu, należy umyć odłączoną membranę filtra, pipetując roztwór ekstrakcyjny w górę iw dół. Zbierz jak najwięcej odczynnika ekstrakcyjnego, przechylając płytkę 6-dołkową i zasysając resztki cieczy.
3. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym oczyszczania i odzyskiwania DNA, RNA lub białka.

5. Przetwarzanie filtrów do izolacji białek

1. Umieść wkład filtra w płytce 6-dołkowej na lodzie. Do komory wewnętrznej dodać 10 μl buforu do lizy białek uzupełnionego 1 mM fluorku sodu (NaF), 1 mM wanadanu sodu (NaV), 100 mM ditiotreitolu (DTT) i 100 μL koktajlu antyproteazy.
2. Mieszać/zeskrobywać komórki na powierzchni membrany za pomocą pipety o pojemności 20 μl, pipetując w górę i w dół. Unikaj generowania pęcherzyków w buforze do lizy.
3. Inkubować 6-dołkową płytkę z wkładami filtrującymi na lodzie przez 10 minut.
4. Powtórz skrobanie, a następnie spłucz powierzchnię membrany buforem do lizy.
5. Zebrać lizaty z 6 wkładek i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
6. Przepłukać pierwszą membranę dodatkowymi 10 μl buforu do lizy i przenieść do następnego filtra.
7. Powtórzyć krok 5.6 dla wszystkich wkładek, zbierając resztki roztworu buforowego do lizy i dodać do probówki o pojemności 1,5 ml (krok 5.5).
8. Próbkę należy inkubować na lodzie przez dodatkowe 5 minut.
9. Wirować z maksymalną prędkością (16 873 x g w wirówce stołowej) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
10. Odpipetować lizat supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
11. Przystąpić do analizy stężenia białka lub przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C.

6. Przetwarzanie dla H&E i barwienia immunologicznego

1. Dodać 500 μl i 1 ml 10% NBF (neutralnej buforowanej formaliny) do komory wewnętrznej i zewnętrznej i pozostawić na noc do inkubacji w temperaturze 4 °C.
2. Zassać NBF z komory zewnętrznej i dodać 1 ml żelu przetwórczego hydroksyetyloagarozy (HEA) do wirówki o pojemności 1,5 ml. Powoli rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej przy użyciu małej mocy i powtarzaj impulsy przez 10-20 s, aż agaroza się rozpuści.
3. Przechowuj HEA w ciepłej kąpieli o temperaturze 37 °C, aby zapobiec zestaleniu, aż będzie gotowy do użycia.
4. Wyjmij NBF z komory wewnętrznej i nałóż 25 μl stopionego HEA do komory wewnętrznej i pozwól agarozie zestalić się przez 2-5 minut.
5. Zwilż 2 piankowe podkładki histologiczne w 10% NBF i umieść jedną podkładkę w kasecie do zatapiania (patrz rysunek 3D).
6. Użyj skalpela z ostrzem #11 (który ma bardzo ostre, drobno zakończone ostrze), aby naciąć filtr od spodu komory wkładu, częściowo zwalniając go z plastikowej komory wkładu.
7. Umieść niewielką ilość (100-200 μl) NBF na szalce Petriego i zanurz częściowo usunięty filtr w NBF (rysunek 3A).
8. Za pomocą skalpela z ostrzem #10 delikatnie dociśnij środek filtra od wewnętrznej strony komory wkładu, aby całkowicie wysunąć filtr z cylindra wkładu (Rysunek 3B). Jeśli jakakolwiek część filtra jest nadal przymocowana do lufy, odetnij ją skalpelem.
9. Przetnij filtr pokryty technologią HEA na pół za pomocą skalpela z ostrzem #10 (Rysunek 3C).
10. Umieść każdą połówkę filtra na podkładce piankowej w kasecie histologicznej przygotowanej w kroku 6.4 (Rysunek 3D).
11. Dodaj drugą gąbkę nasączoną 10% NBF do kasety, układając filtr w warstwie.
12. Zatrzaskowo zamknij kasetę, umieść w NBF i inkubuj przez noc.
13. Filtry przetworzyć na bloki parafinowe w celu przekrojenia i barwienia, jak opisano wcześniej¹².

Wyniki

System oparty na wkładkach do hodowli komórkowych jest stosunkowo prostą i szybką procedurą do produkcji 3D kultur CRC prostaty, która wspiera różnicowanie komórek świetlnych. Pokazano schemat systemu (rysunek 1A) z podkreśleniem nakładania powłoki żelatynowej na dolną powierzchnię wkładu filtracyjnego. Wkładki są przewracane tylko na czas nakładania żelatyny. Na rysunku 1B filtry są w odpowiedniej orientacji do hodowli. Za pomocą przezroczystej wkładki k...

Dyskusja

Pierwotne linie komórkowe są ważną i szybko rozwijającą się platformą badań nad rakiem. System hodowli 3D oparty na wkładkach hodowlanych wspomaga różnicowanie pierwotnego raka jelita grubego gruczołu krokowego w ciągu dwóch tygodni. Metoda filtracji CRC stanowi nową, średnio przepustową metodę badań nad prostatą. Istniejące mysie modele PDX są czasochłonne i niezwykle drogie, a wielu próbek PDX nie można hodować w kulturze, co ogranicza eksperymenty inicjowane przez badaczy i ich użyteczność. Ponadto, podczas gdy wskaźn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Żelatyna 0,1% w wodzie	Stemcell Technologies	7903
Sterylne Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterylny standardowy skalpel 11 ostrzy	Integra Miltex	4411
RIPA Bufor do lizy i ekstrakcji	Thermofisher Scientific	89900
Fluorek sodu	Fishcer Scientific	S299-100
Wanadan sodu	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Koktajl inhibitorów proteazy (AEBSF, aprotynina, bestatyna, E-64, leupeptyna i pepstatyna A)	Sigma-Aldrich	P8340
0,25% trypsyna-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamina	Thermofisher Scientific	25030081& nbsp;
Penicylina Streptomycyna	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Mieszanka składników odżywczych	Media Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dichlorowodorek Inhibitor skał	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulina	Thermofisher Scientific	12585-014
Toksyna	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamycyna	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Odczynnik Trizol	Invitrogen	15596026
Histogel Żel do przetwarzania próbek ( agaroza hydroksyetylowa (HEA))Thermo	Scientific	HG-4000-012
Nieprzywierający opatrunek	Telfa	KDL2132Z
Naczynie do hodowli komórkowych	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Kasety do przetwarzania / zatapiania tkanek	Crystalgen	CG-M492