Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem

20.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55280

⸱

29 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, McGill University, 2Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering, University of British Columbia, 3Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten film i rękopis opisują metodę opartą na emulsji do kapsułkowania komórek ssaków w kulkach alginianowych od 0,5% do 10%, które mogą być produkowane w dużych partiach za pomocą prostego mieszanego naczynia. Zamknięte w kapsułkach komórki mogą być hodowane in vitro lub przeszczepiane do zastosowań w terapii komórkowej.

Streszczenie

Enkapsulacja komórek w kulkach alginianowych została wykorzystana do hodowli komórek unieruchomionych in vitro, jak również do immunoizolacji in vivo. Enkapsulacja wysp trzustkowych była szeroko badana jako sposób na zwiększenie przeżywalności wysp trzustkowych w przeszczepach allogenicznych lub ksenogenicznych. Hermetyzacja alginianu jest zwykle osiągana przez wytłaczanie dysz i zewnętrzne żelowanie. Stosując tę metodę, kropelki alginianu zawierające komórki utworzone na końcu dysz wpadają do roztworu zawierającego kationy dwuwartościowe, które powodują żelowanie jonotropowego alginianu, dyfundując do kropel. Wymóg tworzenia kropel na końcówce dyszy ogranicza przepustowość objętościową i stężenie alginianów, które można osiągnąć. Ten film opisuje skalowalną metodę emulgowania polegającą na enkapsulacji komórek ssaków w 0,5% do 10% alginianu z 70% do 90% przeżywalnością komórek. Dzięki tej alternatywnej metodzie, kropelki alginianu zawierające komórki i węglan wapnia są emulgowane w oleju mineralnym, po czym następuje spadek pH prowadzący do wewnętrznego uwalniania wapnia i jonotropowego żelowania alginianu. Obecna metoda pozwala na wytworzenie kulek alginianowych w ciągu 20 minut od emulgacji. Sprzęt wymagany na etapie enkapsulacji składa się z prostych naczyń z mieszadłem, dostępnych w większości laboratoriów.

Wprowadzenie

Enkapsulacja komórek ssaków była szeroko badana jako sposób ochrony przeszczepionych komórek przed odrzuceniem immunologicznym1 lub jako metoda zapewnienia trójwymiarowego wsparcia dla unieruchomionych kultur komórkowych2,3,4. Enkapsulacja wysepek trzustkowych w kuleczkach alginianowych była wykorzystywana do cofania cukrzycy u gryzoni allogenicznych5,6 lub ksenogenicznych7,8,9,10,1,12. Trwają badania przedkliniczne i kliniczne nad przeszczepianiem enkapsulowanych wysepek trzustkowych w leczeniu cukrzycy typu 113,14,15. W zastosowaniach transplantacyjnych lub przy produkcji unieruchomionych komórek in vitro na większą skalę zazwyczaj stosuje się generatory kuleczek oparte na dyszach. Zazwyczaj mieszaninę alginianu i komórek pompuje się przez dyszę w celu utworzenia kropli, które wpadają do mieszanego roztworu zawierającego kationy dwuwartościowe, co prowadzi do zewnętrznej żelatynizacji kropli. Koaksjalny przepływ gazu16,17, wibracje dyszy18, odpychanie elektrostatyczne19 lub obracające się druty20 ułatwiają formowanie się kropli na końcówce dyszy.

Głównymi wadami konwencjonalnych generatorów kulek są ich ograniczona przepustowość oraz wąski zakres lepkości roztworów, które pozwalają na uzyskanie odpowiedniego kształtu kulek21. Przy wysokich prędkościach przepływu ciecz opuszczająca dyszę rozpada się na krople mniejsze niż średnica dyszy, co pogarsza kontrolę nad rozmiarem. Do zwiększenia przepustowości można wykorzystać generatory z wieloma dyszami, jednak problematyczne okazuje się zapewnienie jednorodnego rozkładu przepływu pomiędzy dyszami oraz stosowanie roztworów o lepkości >0.2 Pas2. Wreszcie, oczekuje się, że wszystkie urządzenia oparte na dyszach mogą powodować pewne uszkodzenia wysepek, ponieważ średnica stosowanych dysz wynosi od 10 µm do 50 µm, podczas gdy ~15% ludzkich wysepek może osiągać rozmiar większy niż 20 µm23.

W tym filmie opisujemy alternatywną metodę enkapsulacji komórek ssaków poprzez formowanie kropel w jednym kroku emulsyfikacji zamiast metody kropla po kropli. Ponieważ produkcja kulek odbywa się w prostym mieszanym naczyniu, metoda ta nadaje się do produkcji kulek w skali od małej (~1 mL) do dużej (zakres 103 L) przy niskich kosztach sprzętowych24. Metoda ta pozwala na produkcję kulek o wysokiej sferyczności przy użyciu szerokiego zakresu lepkości alginianu i krótkim czasie generowania kulek (np. 20 min). Metoda ta została pierwotnie opracowana przez Ponceleta et al.25,26 i wykorzystana do immobilizacji DNA27, białek28, w tym insuliny29, oraz bakterii30. Niedawno dostosowaliśmy te metody do enkapsulacji komórek ssaków, wykorzystując linie komórkowe beta trzustki31,32 oraz pierwotną tkankę trzustki32.

Zasada tej metody polega na wytworzeniu emulsji typu woda w oleju, składającej się z kropel alginianu w oleju mineralnym, a następnie na wewnętrznym żelowaniu kropel alginianu (Rysunek 1). Najpierw substancję enkapsulowaną (np. komórki) dysperguje się w roztworze alginianu zawierającym drobnoziarnistą sól wapnia o niskiej rozpuszczalności przy początkowym pH procesu. Mieszaninę alginianu dodaje się następnie do mieszanej fazy organicznej w celu utworzenia emulsji, zazwyczaj w obecności surfaktanta. W przypadku enkapsulacji komórek ssaków składniki obecne w surowicy mogą pełnić rolę surfaktantów. Następnie obniża się pH w celu rozpuszczenia soli wapnia poprzez dodanie rozpuszczalnego w oleju kwasu, który przenika do fazy wodnej. Kwas octowy, o współczynniku podziału olej mineralny/woda <0,053, należy uprzednio rozpuścić w oleju, a następnie dodać do emulsji, gdzie miesza się on w fazie olejowej i szybko przenika do fazy wodnej34. Rysunek 2 przedstawia reakcje chemiczne i dyfuzję zachodzące podczas etapu zakwaszania i wewnętrznego żelowania. Na koniec enkapsulowane komórki odzyskuje się poprzez inwersję faz, rozdział faz przyspieszony wirowaniem, powtarzalne etapy płukania oraz filtrację. Następnie kroki te mogą zostać uzupełnione o pobieranie próbek kulek i komórek do analiz kontroli jakości, hodowlę komórkową in vitro i/lub transplantację enkapsulowanych komórek.

Schemat procesu mikroenkapsulacji; układ olej/CaCO3 alginian; etapy wirowania i filtracji.
Rysunek 1: Schemat procesu emulsyfikacji służącego do enkapsulacji komórek ssaków. Kuleczki są wytwarzane poprzez emulgację alginianu, komórek i CaCO33 mieszanina w oleju mineralnym (etapy 1 i 2 na schemacie), wywołując żelowanie wewnętrzne poprzez dodanie kwasu octowego (etap 3). Żelowe kuleczki są następnie oddzielane od oleju poprzez dodanie buforu wodnego w celu wywołania inwersji faz (etap 4), a następnie poddawane wirowaniu i aspiracji oleju (etap 5) oraz filtracji (etap 6). Na koniec kuleczki zebrane na filtrze są przenoszone do pożywki hodowlanej komórek w celu in vitro do hodowli lub do transplantacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat równowagi statycznej z reakcjami $\text{CH}_3\text{COOH}$ i $\text{CaCO}_3$, przedstawiający proces tworzenia alginianu wapnia.
Rysunek 2: Reakcje i etapy dyfuzji zachodzące podczas żelowania wewnętrznego. (1) Kwas octowy jest dodawany do fazy organicznej i transportowany do kropelek alginianu drogą konwekcji. (2) Kwas octowy przenika do fazy wodnej. (3) W obecności wody kwas dysocjuje i dyfunduje, aby dotrzeć do CaCO33 ziarna przedstawione w ciemnoniebieskim kolorze. (4) H+ jony są wymieniane na Ca2+ jony w CaCO₃3, uwalniając Ca2+ jony. (5) Jony wapnia dyfundują, dopóki nie napotkają nieprzereagowanego alginianu, co prowadzi do jonotropowego sieciowania łańcuchów alginianu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych enkapsulatorów komórek opartych na dyszach, w tym procesie spodziewany jest szeroki rozkład wielkości kulek ze względu na mechanizm tworzenia się kropel podczas emulsyfikacji z mieszaniem. W przypadku pewnych zastosowań taki rozkład wielkości kulek może być problematyczny. Na przykład w mniejszych kulkach większa frakcja komórek może znajdować się na ich powierzchni. Jeśli istotne są ograniczenia w dostępie do składników odżywczych (np. tlenu), ograniczenia te mogą być bardziej nasilone w większych kulkach. Zaletą metody emulsyfikacji z mieszaniem jest możliwość łatwej regulacji średniej wielkości kulek poprzez zmianę szybkości mieszania podczas etapu emulsyfikacji. Szeroki rozkład wielkości kulek może być również wykorzystany do badania wpływu rozmiaru kulek na wydajność enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórek ssaków poprzez emulgację i żelowanie wewnętrzne stanowi interesującą alternatywę dla laboratoriów, które nie dysponują generatorem kulek. Co więcej, metoda ta daje użytkownikom możliwość skrócenia czasu przetwarzania lub wytwarzania kulek przy bardzo niskich lub bardzo wysokich stężeniach alginianu.

Poniższy protokół opisuje sposób enkapsulacji komórek w 10,5 mL 5% roztworu alginianu przygotowanego w buforze 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES). Alginian stanowi mieszaninę w stosunku 50:50 alginianów klasy transplantacyjnej LVM (niska lepkość, wysoka zawartość kwasu manuronowego) oraz MVG (średnia lepkość, wysoka zawartość kwasu guluronowego). Jako czynnik sieciowania fizycznego wykorzystano węglan wapnia w stężeniu końcowym 24 mM. Fazę organiczną stanowi lekki olej mineralny, natomiast kwas octowy służy do zakwaszenia emulsji i zainicjowania żelowania wewnętrznego. Należy jednak pamiętać, że typ i skład alginianu, a także wybrany bufor procesowy zależą od zamierzonego zastosowania32. Do wytwarzania kulek zgodnie z tym protokołem wykorzystywano różne typy alginianów (patrz. Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj roztwór alginianu, zawiesinę CaCO3 i zakwaszony olej

  1. Przygotować bufor procesowy i pożywkę.
    1. Przygotować typowy bufor procesowy używany do generowania kulek alginianowych o wysokim stężeniu przy użyciu 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Dostosować pH do 7,4.
    2. Przygotuj typową pożywkę hodowlaną przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 6 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
  2. Przygotować roztwór podstawowy alginianu o stężeniu 1,17 razy większym niż końcowe pożądane stężenie w kulkach.
    1. Najpierw zważ odpowiednią ilość proszku alginianowego. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie 5% alginianu z alginianem 50:50 LVM i MVG, należy odważyć łącznie 1,17 g alginianu sodu, łącząc 0,583 g alginianu LVM w proszku i 0,583 g alginianu MVG w proszku.
    2. Umieść 20 ml buforu procesowego w szklanym słoiku do sterylizacji w autoklawie na magnetycznej płytce mieszającej i mieszaj z prędkością ~200 obr./min. Stopniowo dodawać proszek alginianu sodu do roztworu.
    3. Pozostaw roztwór mieszając przez noc na niskich obrotach. W razie potrzeby przymocować kolbę do płytki mieszającej.
    4. Jeśli roztwór nie jest całkowicie rozpuszczony, umieścić butelkę na mieszalniku obrotowym i kontynuować mieszanie w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 24 godziny.
    5. Wysterylizuj roztwór alginianu, autoklawując roztwór przez 30 minut w naczyniu, które jest wypełnione mniej niż w połowie. Pozwolić, aby temperatura spadła poniżej 60 °C przed pobraniem roztworu.
    6. W razie potrzeby usuń cząstki, filtrując roztwór alginianu krótko po autoklawowaniu, zanim osiągnie on temperaturę pokojową, podczas gdy lepkość pozostaje wystarczająco niska.
  3. Przygotować zawiesinę węglanu wapnia o stężeniu 21-krotnym od końcowego pożądanego stężenia do żelowania wewnętrznego.
    1. Odważyć proszek CaCO3. Na przykład dodać 1 g CaCO3 do 20 ml buforu procesowego, aby uzyskać 24 mM CaCO3 jako końcowe stężenie środka żelującego.
    2. Zawiesinę CaCO3 należy sterylizować w autoklawie przez 30 min.
      UWAGA: Stężenie CaCO3 będzie się zmieniać w czasie ze względu na równowagę wodorowęglan - CO2 . Należy unikać stosowania tej samej podstawowej zawiesiny CaCO3 do więcej niż 10 procedur kapsułkowania.
  4. Autoklawować naczynie z mieszadłem używane do procesu emulgowania. Przed użyciem należy usunąć wszelkie ślady skondensowanej wody pozostające w kolbie przędzarki.
  5. Bezpośrednio przed procesem emulgowania należy przygotować zakwaszony olej. Rozpuścić 44 μl kwasu octowego na 11 ml oleju mineralnego umieszczonego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Częstym błędem jest niepełne rozpuszczenie kwasu octowego. Unikać pipetowania niewielkich ilości kwasu octowego i upewnić się, że kwas octowy jest całkowicie rozpuszczony w oleju poprzez wielokrotne wirowanie.
    UWAGA: kwas octowy jest kwasem toksycznym i lotnym. Odczynnik ten należy obchodzić pod wyciągiem i przechowywać roztwór kwasu octowego/oleju w zamkniętym pojemniku do momentu etapu emulgacji. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z informacjami MSDS dotyczącymi tego odczynnika.
  6. Poczekaj, aż wszystkie roztwory osiągną temperaturę pokojową przed przystąpieniem do enkapsulacji komórek.

2. Wytwarzanie kulek alginianowych przez emulgację i wewnętrzne żelowanie

  1. Umieść 10 ml lekkiego oleju mineralnego w kolbie przędzalniczej i rozpocznij mieszanie przy niskiej prędkości obrotowej (np. 250 obr./min dla kolby obrotowej używanej w tym filmie).
  2. Jeśli komórki użyte do tego procesu pochodzą z przylegających kultur, zastosuj trypsynę, aby zawiesić komórki. Zakończ reakcję, dodając pożywkę zawierającą FBS lub inhibitor trypsyny i zbierz próbkę do zliczenia komórek.
    1. Określ stężenie i żywotność komórek po barwieniu błękitem trypanowym za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, jak opisano wcześniej32.
  3. Odwirować komórki przez 7 minut przy 300 x g i umyć je raz w żądanym podłożu w celu unieruchomienia komórek. Upewnij się, że to podłoże zawiera emulgatory, takie jak FBS lub albumina surowicy bydlęcej (BSA). Na przykład użyj DMEM zawierającego 10% FBS.
  4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w tym samym podłożu, aby uzyskać 10,5-krotność pożądanego stężenia końcowego w kulkach.
  5. Dodać 1,1 ml 10,5-krotnie skoncentrowanego materiału komórkowego do 9,9 ml roztworu alginianu. Następnie dodać 550 μl zawiesiny CaCO3 i wymieszać, mieszając sterylną szpatułką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie CaCO3.
  6. Natychmiast przenieść 10,5 ml mieszaniny alginianu, komórek i CaCO3 do oleju do mieszania za pomocą strzykawki.
    UWAGA: W przypadku roztworów o dużej lepkości należy zasysać i wyrzucać mieszaninę bardzo powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. W niektórych przypadkach lepiej jest zatrzymać mieszanie podczas dodawania mieszaniny do kolby, aby uniknąć porywania alginianu na wał wirnika.
  7. Natychmiast po dodaniu mieszaniny alginianu, komórek i CaCO3 do oleju należy zwiększyć szybkość mieszania.
    UWAGA: Dla zastosowanego tutaj alginianu 5% LVM:MVG, zastosowano prędkość obrotową 1025 obr./min, aby wygenerować kulki o średnicy około 900 μm, odpowiednie do hodowli in vitro35. Wyższe prędkości obrotowe i niższe stężenia alginianów prowadzą do niższych średnich średnic ściegów, jak opisano w poprzednich publikacjach25,32. Niewielkie zmiany w geometrii wirnika i zbiornika, a także właściwości alginianowe mogą znacznie wpłynąć na średnią średnicę stopki. Dla każdej zmiany konfiguracji naczynia lub partii alginianowej należy wygenerować standardową krzywą odnoszącą średnią średnicę momentu powierzchniowego do prędkości obrotowej32.
  8. Uruchom minutnik i emulguj alginian przez 12 minut.
  9. Dodać 10 ml oleju i roztworu kwasu octowego, aby zakwasić emulsję, rozpuścić CaCO3, a tym samym fizycznie usieciować alginian w zżelowane kulki. Odczekaj 8 minut na ten etap zakwaszania.

3. Odzyskiwanie koralików

  1. Zmniejsz szybkość mieszania do 400 obr./min. Dodać 40 ml buforu procesowego zmieszanego z 10% pożywką, aby zwiększyć pH i spowodować odwrócenie faz.
  2. Przerwij mieszanie 1 minutę później i przenieś mieszaninę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Przepłukać kolbę przędzalniczą dodatkowym 20 ml pożywki i dodać ją do probówki. Przed zasysaniem fazy olejowej należy zassać jak najwięcej fazy wodnej z kolby wirowej, aby zminimalizować kontakt kulki z fazą olejową.
    UWAGA: Na tym etapie i od tego momentu należy używać pipety o dużej średnicy (np. pipety o pojemności 25 ml), aby uniknąć uszkodzenia kulek. W przypadku mniejszych objętości zawiesiną kulek można również manipulować za pomocą naciętych końcówek do pipet. Aby uzyskać takie końcówki, odetnij koniec końcówki pipety nożyczkami, nosząc ochronę oczu.
  3. Wirować probówki przez 3 minuty przy 630 x g, aby przyspieszyć osiadanie kulek i separację faz.
  4. Usunąć olej i nadmiar roztworu wodnego, zasysając pipetą Pasteura.
  5. Umyj koraliki przynajmniej raz podłożem. Przefiltruj zawiesinę kulek na sitkach o ogniwach nylonowych 40 μm i odessaj nadmiar płynu związanego z kulkami od spod sitka. Przenieś kulki do znanej objętości podłoża za pomocą sterylnej szpatułki.
    UWAGA: Na tym etapie można zastosować filtry o mniejszej lub większej wielkości porów, w zależności od docelowej minimalnej średnicy ściegu. Zaleca się jednak filtrację grawitacyjną, a nie filtrację ciśnieniową przez filtry o wielkości porów submikronowych, aby uniknąć uszkodzenia kulek.
  6. Zmierz objętość kulki przez przemieszczenie objętościowe (objętość po dodaniu koralików, minus objętość przed dodaniem koralików) i uzupełnij pożywkę, aby uzyskać pożądany stosunek objętości kulki do całkowitej, który zwykle wynosi 1:5 lub 1 ml kulek w podłożu 4 ml. Od tego momentu zawsze używaj pipet o dużych średnicach, aby uniknąć uszkodzenia kulek.
  7. Przenieść kapsułkowane komórki do kolb T w celu przeprowadzenia hodowli in vitro lub eksperymentów transplantacyjnych.

4. Kontrola jakości i aplikacje

UWAGA: Aby zapewnić jakość zamkniętych komórek i kulek, należy określić ilościowo rozkład wielkości kulek i przeżywalność komórek po procesie. Powszechnie wykonuje się odwrócenie żelu w celu odzyskania komórek z wnętrza kulek w celu dalszej analizy.

  1. Aby ocenić rozkład wielkości koralików, zabarwić je błękitem toluidyny-O.
    1. Umieść kulki o pojemności 0,5 ml w buforze procesowym o pojemności 4 ml zawierającym 10% kompletnego podłoża.
    2. Dodać 500 μl roztworu błękitu toluidynowego o stężeniu 1 g/l przygotowanego w buforze procesowym.
    3. Inkubować przez 60 minut w stożkowej probówce na wytrząsarce obrotowej z prędkością 50 obr./min.
    4. Dodać 5 ml buforu procesowego zawierającego 10% kompletnej pożywki i natychmiast przenieść kulki i roztwór na szalkę Petriego i uzyskać obrazy pod mikroskopem o małym powiększeniu lub za pomocą ręcznej kamery cyfrowej. W razie potrzeby umieść szalkę Petriego na lightboxie przed zrobieniem zdjęć aparatem ręcznym, aby zwiększyć kontrast i uniknąć cieni.
    5. Przeprowadź analizę obrazu, aby określić ilościowo rozkład wielkości koralików, jak opisano wcześniej32, na przykład za pomocą analizy obrazu freeware36.
  2. Aby ocenić przeżycie komórek jakościowo, należy wybarwić komórki za pomocą homodimeru etydyny w celu identyfikacji martwych komórek i kalceiny AM w celu identyfikacji żywych komórek.
    1. Dodać 1 objętość kulek do 4 objętości bufora procesowego zawierającego 10% kompletnego podłoża.
    2. Dodać odpowiednią ilość roztworów podstawowych kalceiny AM i homodimeru etydyny, aby uzyskać odpowiednio 4 μM i 2 μM stężenia. Wygeneruj pojedyncze kontrole barwienia, dodając tylko jeden z odczynników do niektórych próbek kulek.
    3. Inkubuj koraliki na lodzie przez 20 minut.
    4. Umieść roztwór między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym za pomocą przekładki, takiej jak o-ring, aby uniknąć ściskania kulek.
    5. Przystąp do mikroskopii fluorescencyjnej. Użyj kontroli pojedynczego barwnika, aby ocenić przenikanie fluorescencji. Dobierz odpowiednie filtry fluorescencyjne na podstawie długości fal wzbudzenia/emisji związanych z kalceiną AM (494/517 nm) i homodimerem etydyny związanym z DNA (528/617 nm).
  3. Aby odzyskać komórki z kulek do dalszej analizy, należy odżelować alginian za pomocą cytrynianu lub innego roztworu chelatującego.
    1. Przygotować roztwór odtłuszczający zawierający 55 mM cytrynianu, 10 mM HEPES i 95 mM NaCl o pH 7,4.
    2. Wymieszaj ten roztwór z 10% podłożem, a następnie dodaj 1 ml kulek alginianowych do 9 ml mieszanki.
    3. Żeluj kulki na lodzie z mieszaniem 75 obr./min przez 20 min.
      UWAGA: Komórki można teraz wykorzystać do analizy lub usunąć z odżelowanego roztworu alginianu przez odwirowanie. Na przykład żywotność komórek po odżelowaniu można określić ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Alternatywnie komórki można odwirować i przepłukać, a następnie pobrać i przeanalizować próbki mRNA, DNA i/lub białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na końcu procesu emulsyfikacji i internalnej żelowania należy odzyskać objętość kulek zbliżoną do początkowej objętości mieszaniny alginianu i komórek. Kulki powinny być wysoce sferyczne, z niewielką liczbą wad (Rysunek 3). Powinny być wystarczająco wytrzymałe, aby wytrzymać przenoszenie pipetą o dużym przekroju. Przy wysokich stężeniach alginianu w kulkach mogą występować uwięzione krople oleju lub powietrza. Zjawisko to najprawdopodobniej wynika z uwięzieni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różne etapy (przedstawione na Rysunku 2) podczas reakcji żelowania wewnętrznego mogą ograniczać ogólną kinetykę procesu. W przypadku ziaren węglanu wapnia o rozmiarze większym niż ~2,5 µm wykazano, że szybkość rozpuszczania węglanów jest etapem limitującym26,4. Wykazano również, że etap zakwaszania prowadzący do wewnętrznego uwalniania wapnia jest krytyczną zmienną procesową wpływającą na przeżywalność komórek32. Warunki p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Jill Osborne za jej pracę nad procesem emulgowania oraz Lauren Wilkinson za wsparcie techniczne. Dziękujemy dr Igorowi Laçikowi, dr Timothy'emu J. Kiefferowi i dr Jamesowi D. Johnsonowi za ich wkład i współpracę. Dziękujemy Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), Radzie ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC), Centrum Transplantacji Ludzkich Wysp Trzustkowych i Regeneracji Komórek Beta, Kanadyjskiej Sieci Komórek Macierzystych, Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem, le Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies oraz COST 865 za wsparcia finansowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki i materiały eksploatacyjne
alginian LVM (do przeszczepu)NovamatrixNie dotyczyOkreślany jako "alginian #1" w wynikach.
Alginian MVG (stopień transplantacyjny)NovamatrixNie dotyczyOkreślany jako "alginian #2" w wynikach.
Alginian (klasa do hodowli komórkowych)SigmaA0682 (niska lepkość) lub A2033 (średnia lepkość)A2033 jest określany w wynikach jako "alginian #3".
DMEMLife Technologies11995-065
Płodowa surowica bydlęca, scharakteryzowana, pochodzenia kanadyjskiegoThermo Fisher ScientificSH3039603
GlutamineLife Technologies25030
Penicylina i streptomycynaSigmaP4333-100ML
HEPES, testowana hodowla komórkowaSigmaH4034-100G
NaClThermo Fisher ScientificS271-1
Drobnoziarnisty CaCO3Avantor Materials1301-01Po przygotowaniu zawiesiny CaCO3 należy dokonać sonikacji i zużyć w ciągu jednego miesiąca.
Lekki olej mineralnyThermo Fisher ScientificO121-4Sterylny filtr przez 0,22 μ m membrana o wielkości porów przed użyciem.
Lodowaty kwas octowyThermo Fisher ScientificA38-500Obchodź się ostrożnie: patrz karta charakterystyki.
Sterylne szpatułkiSigmaCLS3004-100EA
Sterylne nylonowe sitka komórkowe, 40 i mikro; mThermo Fisher Scientific08-771-1
(2 ml, 5 mL, 10 ml, 25 ml)Sarstedt86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 i 86.1685.001
Pipety PasteuraVWR14673-043
Toluidine Blue-OSigmaT3260
Equipment
100 mL Kolby obrotowe z mikronośnikiemBellco1965-00100Konfiguracja wirnika z najnowszymi modelami może nie być odpowiednia do odpowiedniej emulgacji. Ostrze zdolne do zamiatania oleju do 0,5 cm od dna kolby może być wykonane na zamówienie z arkusza teflonowego.
Magnetyczna płyta mieszająca z regulowaną prędkościąBellco7760-06005Prędkość obrotową należy skalibrować (np. za pomocą obrotomierza) przed użyciem.
Licznik ogniwInnovatisCedex AS20Ten system jest teraz sprzedawany przez firmę Roche. Ten automatyczny licznik komórek można również zastąpić ręcznym liczeniem komórek po barwieniu błękitem trypanowym za pomocą hemocytometru.
Kaseton LEDArtographLightPad® PROTen element może być zastąpiony przez inne typy oświetlaczy.
Aparat ręcznyCanon PowerShot A590 ISDo rejestrowania obrazów koralików z niebieskim toluidyną można używać różnych aparatów ręcznych. Linijkę należy umieścić obok szalki Petriego zawierającej koraliki przed uzyskaniem obrazów.
Mikroskop fluorescencyjny z kontrastem fazowym i odpowiednimi filtrami fluorescencyjnymiOlympusIX81Do obrazowania kulek użyto kilku systemów mikroskopowych. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano za pomocą mikroskopu IX81 wyposażonego w filtry fluorescencyjne GFP i TRITC. Aby uchwycić całe koraliki, używano obiektywów od 4X do 20X, w zależności od szybkości mieszania. Obrazy żywych/martwych plam były zwykle rejestrowane przy użyciu obiektywów od 20X do 40X.
Oprogramowanie do akwizycji obrazówMolecular DevicesMetamorphDo pozyskiwania obrazów kontrastowych i fluorescencyjnych można używać różnych programów do akwizycji obrazów.
Darmowe oprogramowanie do analizy obrazuCellProfilerNie dotyczyDo identyfikowania koralików jako obiektów i analizowania rozmiaru ściegów można używać różnych programów do analizy obrazu (np. ImageJ).
Pipety serologiczne

Bibliografia

  1. Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
  2. Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
  3. Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
  4. Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
  5. Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
  6. Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
  7. Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
  8. Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
  9. Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15(2001).
  10. Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
  11. Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
  12. Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
  13. Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
  14. Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
  15. Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
  16. Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
  17. Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
  18. Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
  19. Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
  20. Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
  21. Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , University of British Columbia. (2010).
  22. Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
  23. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
  24. Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
  25. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
  26. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
  27. Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
  28. Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
  29. Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
  30. Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
  31. Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
  32. Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
  33. Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
  34. Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
  35. Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
  36. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  37. Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
  38. Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
  39. Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
  40. Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
  41. Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
  42. Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
  43. Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
  44. Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
  45. Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
  46. Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
  47. Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
  48. De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
  49. Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda emulgowaniażelowanie wewnętrznewęglan wapniarozkład wielkości kulekocena przeżywalności komórekemulsja w oleju mineralnymproces zakwaszania
Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.