Artykuł metodologiczny

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

17.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55283

⸱

19 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute, University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute, University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Pomiar reaktywności immunologicznej na antygeny dawcy u biorców przeszczepów prawdopodobnie będzie kluczowy dla skutecznego zmniejszenia lub wycofania immunosupresji. Mieszana reakcja leukocytowa (MLR), testy ograniczającego rozcieńczenia i test nadwrażliwości trans-vivo typu opóźnionego (DTH) zostały zastosowane do tego pytania, ale metody te mają ograniczoną zdolność przewidywania i / lub znaczące ograniczenia praktyczne, które zmniejszają ich przydatność. Obrazowa cytometria przepływowa to technika, która łączy wieloparametryczne ilościowe moce cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej. Niedawno wykorzystaliśmy metodę obrazowania metodą cytometrii przepływowej, aby określić odsetek limfocytów T biorcy zdolnych do tworzenia dojrzałych synaps immunologicznych z komórkami prezentującymi antygen dawcy (APC). Korzystając z dobrze scharakteryzowanego modelu przeszczepu serca u myszy, wykazaliśmy, że częstość występowania synaps immunologicznych in vitro wśród zdarzeń kontaktu z błoną T-APC silnie przewidywała wynik przeszczepu allogenicznego w przypadku odrzucenia, tolerancji i sytuacji, w której przeżycie przeszczepu zależy od indukowanych limfocytów T regulatorowych. Częstość kontaktów T-APC zwiększała się z limfocytami T myszy podczas ostrego odrzucenia i zmniejszała się z limfocytami T od myszy, które przestały reagować na alloantygen. Dodanie regulatorowych limfocytów T do systemu in vitro zmniejszyło przedłużone kontakty T-APC. Co ważne, efekt ten zaobserwowano również w przypadku ludzkich poliklonalnie rozszerzonych, naturalnie występujących regulatorowych limfocytów T, o których wiadomo, że kontrolują odrzucanie tkanek ludzkich w humanizowanych modelach mysich. Dalszy rozwój tego podejścia może pozwolić na głębszą charakterystykę kompartmentu alloreaktywnych limfocytów T u biorców przeszczepów. W przyszłości dalszy rozwój i ocena tej metody z wykorzystaniem komórek ludzkich może stanowić podstawę testów stosowanych do selekcji pacjentów pod kątem minimalizacji immunosupresji, a także może być wykorzystana do pomiaru wpływu terapii tolerogennych w klinice.

Wprowadzenie

Przeszczep narządów stałych zmienił sposób opieki nad pacjentami ze schyłkowymi chorobami nerek, wątroby, serca i płuc. Jednak ze względu na rozbieżności w głównych i drugorzędnych antygenach zgodności tkankowej, przeszczepy allogeniczne są szybko odrzucane przez limfocyty T biorcy, jeśli nie stosuje się leków immunosupresyjnych. Środki te mają liczne działania niepożądane, w tym ryzyko raka i dysfunkcji narządów. Głównym celem klinicznym jest zatem obniżenie dawki immunosupresji do minimalnego poziomu wymaganego do zapobieżenia odrzuceniu przeszczepu allogenicznego. Poziom ten może się różnić w zależności od stopnia aktywacji wrodzonego układu odpornościowego; stopień niezgodności alloantygenów między dawcą a biorcą; oraz różnice między pacjentami w funkcji immunologicznej, farmakokinetyce i farmakodynamice.

Niestety, klinicyści transplantacyjni nie dysponują żadnymi narzędziami do dokładnej oceny reaktywności dawców u poszczególnych pacjentów1. Mieszana reakcja leukocytów (MLR) może wykryć reaktywność dawcy, ale nie jest w stanie wiarygodnie przewidzieć wyniku przeszczepu2,3. Testy ograniczające rozcieńczanie, cytokiny ELISPOTs i test trans-vivo albo mierzą ograniczony zakres odpowiedzi, albo nie są praktyczne4,5,6,7,8. Profile ekspresji genów ujawniły sygnatury związane z tolerancją operacyjną9,10,11,12 i odrzucenie13,14,15, ale nie zawsze można je uogólnić na populacje16 i ostatecznie mogą mieć ograniczoną przydatność w pacjentów indywidualnych. Opracowano również analizy sekwencyjne receptora limfocytów T (TCR) limfocytów T w krwi obwodowej class17 lub proliferujących w MLR18, ale wymagają dalszej walidacji.

Koncepcyjnie, pożądane byłoby posiadanie testu, który wykrywa najwcześniejsze wymagane etapy aktywacji limfocytów T biorcy przez antygen dawcy. Ponieważ hodowla komórek w ciągu kilku dni (jak w MLR) może wprowadzać artefakty, taki test w idealnym przypadku nie wymagałby pomiaru dalszych zdarzeń, takich jak proliferacja lub funkcja efektorowa. Równie dobrze jednak pożądane byłoby, aby test zależał od jakiegoś elementu funkcji limfocytów T, ponieważ czysto opisowe oceny (np. sekwencjonowanie TCR) mogą nie być w stanie odróżnić limfocytów T anergicznych od funkcjonalnych.

Liczne badania wykazały, że długotrwały kontakt T-APC jest niezbędny do wytworzenia synapsy immunologicznej, co jest niezbędnym pierwszym krokiem w odpowiedzi komórek T19,20,21,22. Niedawno informowaliśmy, że podczas dynamicznego obrazowania poklatkowego in vitro około 5 - 10% mysich limfocytów T CD4 + tworzy długotrwałe kontakty z allogenicznymi komórkami dendrytycznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMDC)23. Częstość długotrwałego kontaktu była zwiększona u zwierząt, które odrzuciły przeszczep, podczas gdy u myszy, które wcześniej stały się tolerancyjne na te same antygeny, utrzymywała się na poziomie obserwowanym u myszy nieprzeszczepionych23. Przedłużone interakcje były zmniejszone w obecności limfocytów Treg biorcy i zwiększone pod ich nieobecność, a podobne zjawiska zaobserwowaliśmy przy użyciu ludzkich limfocytów T i allogenicznych DC pochodzących z monocytów (MoDCs)23.

Jednak liczenie długotrwałych kontaktów nawiązanych w populacji poliklonalnych komórek T jest czasochłonne i pracochłonne. Dlatego wykorzystaliśmy obrazową cytometrię przepływową do zbadania tworzenia się allogenicznych synaps immunologicznych. Obrazowa cytometria przepływowa łączy w sobie wieloparametryczne możliwości pozyskiwania i analizy danych konwencjonalnej cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania pojedynczych komórek mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta została wykorzystana przez innych badaczy do badania tworzenia synaps immunologicznych przez monoklonalne limfocyty T24,26,27lub w obecności superantygenów28. Jednak w takich warunkach częstotliwość odpowiedzi limfocytów T waha się od 30 do 100%, podczas gdy ogólnie szacuje się, że alloreaktywne limfocyty T stanowią 5-15% całkowitego repertuaru limfocytów T29,30,31,32. Co ważne, wykazaliśmy, że obrazowa cytometria przepływowa może dostarczyć bardzo porównywalnego pomiaru częstości alloreaktywnych limfocytów T23 oraz że zmiany częstości synaps w populacji poliklonalnych komórek T są predyktorem wyniku przeszczepu23. Obecnie podejście to zostało zoptymalizowane pod kątem pomiaru bezpośredniej alloreaktywności limfocytów T CD4 +, ale w zasadzie można je również opracować w celu zbadania limfocytów T CD8 + i szlaku pośredniego. Uważa się, że alloreaktywność pośrednia staje się coraz bardziej istotna w dłuższym okresie po przeszczepie33. Obecnie rozwijamy tę metodę z wykorzystaniem komórek ludzkich, co pozwoli na przeprowadzanie badań na pacjentach. W związku z tym w przyszłości ogólne podejście może być przydatne do funkcjonalnej oceny odpowiedzi limfocytów T u biorców przeszczepów przed przeszczepem; bezpośrednio po przeszczepie; i w dłuższej perspektywie, gdy minimalizacja leków staje się ważnym celem.

Protokół

1. Przygotowanie wymaganych odczynników i materiałów

  1. Przygotować roztwór soli fosforanowo-buforowej (PBS) zawierający 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) („bufor do mycia”). Przygotować PBS z 2% FCS zawierający 0,1% detergentu niejonowego („bufor do mycia z permeabilizacją”; patrz Tabela Materiałów). Przygotować PBS z 1,5% formaldehydem.
    UWAGA: OSTROŻNIE! Formaldehyd jest substancją żrącą i potencjalnie rakotwórczą; należy go używać w odpowiednich środkach ochrony osobistej.
  2. Przygotować PBS zawierający 2% FBS i 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do magnetycznej separacji komórek („bufor MCS”).
  3. Przygotować roztwór falloidyny znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (Phalloidin-FITC) w stężeniu 50 µg/mL w dimetylosulfoksydzie (DMSO). Przygotować barwnik jądrowy w stężeniu 1 mg/mL (np. 1 mg/mL 7-aminoaktynominy D (7-AAD) w DMSO lub barwnik bis-benzimidowy; patrz Tabela Materiałów) w DMSO. Przygotować przeciwciała znakowane fluorochromem, odpowiednie dla badanych komórek i cytometru przepływowego z obrazowaniem.
  4. Pozyskać tkanki zwierzęce (np. węzły chłonne i śledzionę) jako źródło limfocytów T oraz allogeniczne tkanki zwierzęce (np. śledzionę i szpik kostny) jako źródło komórek prezentujących antygen lub komórek progenitorowych.
  5. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej (np. pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 lub pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnioną o 10% FBS), 50 µM 2-merkaptoetanolu, penicylinę i streptomycynę oraz przygotować 24- i/lub 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowej.

2. Przygotowanie komórek prezentujących antygen

UWAGA: Teoretycznie za pomocą tej metody można badać dowolną populację APC. W tym przypadku jako APC wykorzystano niedojrzałe komórki dendrytyczne (DCs) pochodzące z szpiku kostnego myszy. Istnieje wiele protokołów generowania tych komórek (na przykład w referencjach 34 i 35). W skrócie, zastosowano poniższy protokół.

  1. Wypłucz szpik z kości udowych i piszczelowych do pożywki RPMI 1640 lub DMEM.
  2. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko komórkowe 70-µm, aby usunąć małe fragmenty kości i zanieczyszczenia.
  3. Scynduj komórki przez wirowanie, a następnie zlizuj krwinki czerwone, stosując bufor z chlorkiem amonu przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  4. Scynduj komórki przez wirowanie (40 x g, 5 min), a następnie resuspenduj osad komórkowy.
  5. Przemyj komórki w 5 - 10 mL buforu do mycia, scynduj przez wirowanie (40 x g, 5 min) i ponownie resuspenduj osad komórkowy.
  6. Wzbogać prekursory hematopoetyczne na kolumnie do separacji komórek, znakując komórki biotynilowanymi przeciwciałami anty-CD3 (5 µg/mL), anty-B20 (5 µg/mL), anty-MHC klasy II (1 µg/mL) oraz anty-CD1b (5 µg/mL).
  7. Scynduj komórki przez wirowanie (40 x g, 5 min) i ponownie resuspenduj osad komórkowy.
  8. Inkubuj komórki z magnetycznymi mikrokulkami anty-biotynowymi (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 4 °C przez 10 min.
  9. Przemyj i scynduj komórki (40 x g, 5 min), a następnie resuspenduj je w 1 mL buforu MCS przed usunięciem znakowanych komórek za pomocą kolumny do magnetycznej separacji komórek do dużej selekcji pozytywnej (LS), przygotowanej 3 mL buforu MCS i umieszczonej w magnesie. Przemyj kolumnę 3 razy 3 mL buforu MCS; frakcja przepływowa będzie zawierać pożądane komórki.
  10. Hoduj komórki, które przeszły przez kolumnę, przez 6 dni w RPMI 1640 lub DMEM uzupełnionym o 2 ng/mL rekombinowany mysi czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) oraz 2 ng/mL rekombinowany ludzki czynnik wzrostu przekształcającego β1 (TGFβ1). Co 2 dni wymieniaj połowę pożywki na świeżą pożywkę kompletną zawierającą 2 ng/mL GM-CSF i TGFβ1.
    UWAGA: Ludzki TGFβ1 wykazuje aktywność w komórkach mysich. Dane zostały wygenerowane z użyciem tych niedojrzałych komórek DC. Inne komórki (np. limfocyty B i dojrzałe komórki DC) mogą być odpowiednie jako APC, ale nie zostały przetestowane w tym teście.
  11. Kriokonserwuj komórki DC w 90% surowicy/10% DMSO i przechowuj w ciekłym azocie; odzyskaj je w dniu użycia. Przed użyciem policz liczbę żywych komórek DC w komorze hemocytometrycznej, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu. Resuspenduj osad komórkowy w pożywce hodowlanej z odpowiednią gęstością (patrz krok 4.1) przed zastosowaniem w sekcji 4.

3. Przygotowanie limfocytów T

  1. Należy zastosować metody selekcji negatywnej, aby uniknąć przypadkowego przekazywania sygnałów aktywujących lub hamujących do komórek.
    UWAGA: W poniższym przykładzie przygotowano do analizy limfocyty T CD4+.
    1. Aby przygotować limfocyty T CD4+ ze śledziony myszy, należy przecisnąć śledzionę przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70-µm, używając tłoka strzykawki. Sitko komórkowe należy przepłukać buforem do mycia.
    2. Komórki w zawiesinie należy odwirować (40 x g, 5 min), a następnie zlizować krwinki czerwone, resuspendując osad w buforze z chlorkiem amonu przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    3. Komórki należy odwirować (40 x g, 5 min), a następnie resuspendować osad.
    4. Komórki należy przemyć 5 – 10 mL buforu do mycia i odwirować (40 x g, 5 min). Następnie należy resuspendować osad.
    5. Komórki należy znakować biotynowanymi przeciwciałami przeciwko CD8, głównemu kompleksowi zgodności tkankowej klasy II (MHC II, 1 µg/mL) oraz CD19 (5 µg/mL). Inkubować przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    6. Komórki należy przemyć 10 mL buforu do mycia i odwirować (40 x g, 5 min). Następnie należy resuspendować osad.
    7. Komórki należy inkubować z magnetycznymi mikrokuleczkami anty-biotynowymi (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Komórki należy przemyć 10 mL buforu do mycia i odwirować (40 x g, 5 min), a następnie resuspendować osad.
    9. Komórki należy resuspendować w 1 mL buforu MCS i wzbogacić frakcję limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznej kolumny do separacji komórek, uprzednio przygotowanej (primed) 3 mL buforu MCS, umieszczonej na magnesie. Kolumnę należy przemyć 3 razy, używając 3 mL buforu MCS. Przesącz z kolumny będzie zawierał wzbogaconą populację limfocytów T.
  2. Za pomocą standardowej cytometrii przepływowej należy ocenić czystość limfocytów T, wykorzystując alikwot komórek wyselekcjonowanych negatywnie. Komórki należy znakować koniugatem fluorochrom-streptawidyna (aby zidentyfikować ewentualne komórki znakowane biotyną, które powinny zostać usunięte w kolumnie) oraz przeciwciałem lub przeciwciałami identyfikującymi interesującą populację limfocytów T (w tym przypadku CD4); akceptowalna czystość wynosi ≥85%23.
    1. Liczbę limfocytów T należy określić za pomocą hemocytometru metodą wykluczania trypanu niebieskiego (akceptowalna żywotność wynosi ≥90%).
      UWAGA: Bufor MCS zawiera EDTA, który musi zostać usunięty przed przystąpieniem do analizy. W tym celu należy odwirować komórki (40 x g, 5 min) i przemyć je w 1 mL buforu do mycia. Komórki należy odwirować ponownie (40 x g, 5 min) i resuspendować w medium hodowlanym przy odpowiednim zagęszczeniu (patrz krok 4.1).

4. Wspólna inkubacja limfocytów T i komórek DC

  1. Zasiejeć limfocy T i komórki DC w stosunku 2:1 (T:DC) na 24- lub 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Należy upewnić się, że końcowa objętość hodowli wynosi ≤50 µL dla płytek 24-dołkowych lub ≤50 µL dla płytek 96-dołkowych.
    UWAGA: Mniejsze objętości sprzyjają interakcjom międzykomórkowym i zapewniają miejsce na późniejszy bufor do fiksacji.
    1. Dokładną liczbę komórek należy dostosować empirycznie, jednak jako ogólną wytyczną należy przyjąć 1 x 106 limfocytów T i 0,5 x 106 komórek DC na dołek (płytka 96-dołkowa). Należy uznać te wartości za minimalną liczbę komórek, ponieważ zastosowanie mniejszej ilości utrudnia enumerację synaps immunologicznych.
      1. Aby zwiększyć liczbę komórek, należy przygotować powtórne dołki i połączyć je po kroku 5 (fiksacji).
        UWAGA: Przy przygotowywaniu powtórnych dołków zaleca się najpierw zasiać komórki DC we wszystkich dołkach, a następnie zasiać limfocy T we wszystkich dołkach; minimalizuje to rozbieżności w czasie inkubacji między dołkami.
  2. Inkubować płytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.

5. Fixowanie komórek w płytce

  1. Do każdej studni dodać trzykrotność objętości hodowli 1,5% formaldehydu w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min; utrwalenie komórek przed ich usunięciem z płytki jest istotne w celu zminimalizowania zaburzeń oddziaływań międzykomórkowych.
  2. Przenieść komórki z płytki do probówek w celu ich późniejszego przemycia i barwienia. Na tym etapie należy odłożyć dodatkową porcję komórek do kontroli barwienia pojedynczego. Poza tymi kontrolami, całą hodowlę należy zabarwić koktajlem przeciwciał (patrz krok 4.1.1).

6. Barwienie komórek

  1. Barwić komórki w 10 µL buforu do płukania zawierającego koktajl wybranych przeciwciał koniugowanych z fluorochromami przez 30 min w temperaturze pokojowej, z osłoną przed światłem.
    UWAGA: Koktajl zawiera przeciwciała specyficzne dla limfocytów T oraz przeciwciała specyficzne dla APC. Fluorochromy należy dobrać tak, aby można było je rozróżnić przy użyciu konfiguracji cytometru przepływowego z obrazowaniem. W eksperymentach przedstawionych w niniejszej procedurze zastosowano CD1b koniugowany z niebieskim fluorophorem (5 µg/mL, patrz Tabela Materiałów) oraz CD90.2 koniugowany z APC (5 µg/mL).
  2. Przepłukać komórki w 1 mL buforu do płukania i odwirować przez 5 min przy 400 x g. Odlać supernatant. Resuspender komórki w buforze do permeabilizacji i płukania zawierającym faloidynę FITC w stężeniu 0,05-0,5 µg/mL i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej z osłoną przed światłem.
    UWAGA: Stężenia faloidyny FITC rzędu 0,1 µg/mL sprawdzają się w przypadku komórek mysich, jednak odpowiednie stężenie może się różnić w zależności od dostawcy, typu komórek i używanego cytometru przepływowego z obrazowaniem.
  3. Przepłukać komórki w 1 mL buforu do permeabilizacji i płukania i odwirować przez 5 min przy 40 x g. Odlać supernatant. Resuspender komórki w buforze do permeabilizacji i płukania zawierającym barwnik jądrowy w odpowiednim stężeniu (np. około 25 µg/mL 7-AAD) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej z osłoną przed światłem.
  4. Przepłukać komórki w 1 mL buforu do permeabilizacji i płukania i odwirować przez 5 min przy 40 x g. Odlać supernatant. Przepłukać komórki raz w buforze do płukania, odwirować i resuspender w 50 - 10 µL buforu do płukania, przenosząc komórki do małych, zakręcanych probówek do mikrowirowania.
  5. Niezwłocznie przystąpić do akwizycji danych lub przechowywać komórki w temperaturze 4 °C z osłoną przed światłem do czasu analizy na cytometrze przepływowym z obrazowaniem, maksymalnie przez kilka dni.
    UWAGA: Komórki były pomyślnie przechowywane w ten sposób do 7 dni. Dłuższe przechowywanie może być możliwe, lecz nie zostało przetestowane.

7. Pozyskiwanie danych

  1. Uruchomić i skonfigurować cytometr przepływowy z obrazowaniem zgodnie z instrukcjami producenta. Przed rozpoczęciem zbierania danych należy upewnić się, że rdzeń przepływowy jest stabilny.
  2. Zarezerwować jeden kanał do akwizycji obrazów w jasnym polu. Pozyskać dane kontrolne dla pojedynczych barwień przy wyłączonym kanale jasnego pola.
    1. Kliknąć przycisk „Load” i włożyć do uchwytu probówkę zawierającą w pełni zabarwioną próbkę (próbkę zabarwioną wszystkimi wymaganymi fluorochromami).
    2. W oknie „workspace” wybrać i utworzyć nowy wykres kropkowy z parametrami aspect ratio względem area i wyznaczyć bramkę dla singletów, gdzie aspect ratio jest bliskie 1. Utworzyć nowy wykres kropkowy dla każdego użytego kanału (intensywność kanału na osi poziomej).
    3. Dla każdego fluorochromu sprawdzić populację pozytywną i, jeśli jest to wymagane, dostosować napięcie lasera w polu „Illumination”.
    4. Wyjąć probówkę i włożyć pierwszą probówkę z pojedynczym barwieniem.
    5. W polu „Acquisition Settings” wpisać nazwę próbki i ustawić liczbę zdarzeń do zebrania; w przypadku pojedynczego barwienia (dla kontroli kompensacji) wystarczające jest 1 0 – 2 0 zdarzeń.
    6. W polu „Channels” zaznaczyć kanały, którymi zabarwiono każdą próbkę. Dla kontroli pojedynczych barwień wszystkie kanały powinny być zaznaczone, z wyjątkiem jasnego pola i rozproszonego światła bocznego (side scatter). Kliknąć przycisk „Record” w polu „Acquisition”; akwizycja zostanie automatycznie zatrzymana po osiągnięciu określonego progu liczby zdarzeń.
    7. Kliknąć przycisk „Return”, aby wyjąć probówkę. Powtórzyć kroki 7.2.4 – 7.2.6 dla każdej kontroli pojedynczego barwienia. W zależności od cytometru i oprogramowania może nie być możliwe ustawienie wszystkich bramek pokazanych na Rysunku 1 podczas akwizycji (bardziej precyzyjne bramkowanie wykonuje się podczas analizy; patrz sekcja 8).
  3. Pozyskać próbki w taki sam sposób jak w przypadku próbek z pojedynczym barwieniem (w kroku 7.2), jednak w polu „Channels” zaznaczyć wszystkie wymagane kanały, w tym kanał jasnego pola.
    1. Przed zapisaniem danych sprawdzić, czy intensywność kanału jest odpowiednia do identyfikacji pożądanych populacji komórek. W przeciwnym razie dostosować ustawienia lasera i ponownie zarejestrować kontrole pojedynczych barwień przy użyciu nowych ustawień, zgodnie z opisem w kroku 7.2.
    2. Dla każdej próbki pozyskać kilkanaście tysięcy zdarzeń.
      UWAGA: W większości warunków zdarzenia kontaktu komórka-komórka stanowią niewielką mniejszość całkowitej liczby komórek (większość to pojedyncze komórki). Zazwyczaj pożądane jest uzyskanie co najmniej 10 zdarzeń w końcowej bramce kontaktu błonowego.

8. Analiza danych

  1. Przeanalizuj dane pozyskane za pomocą cytometru przepływowego z obrazowaniem, korzystając z oprogramowania analitycznego dostępnego bezpłatnie na stronie internetowej producenta (wymagane jest utworzenie konta użytkownika; patrz Tabela Materiałów).

Wykresy cytometrii przepływowej z sortowania komórek; wykres przedstawiający dublety komórkowe, stosunki sygnałów oraz dane fluorescencyjne.
Rysunek 1. Strategia bramkowania zastosowana w celu identyfikacji alloreaktywnych synaps immunologicznych. A. Zdarzenia w ostrości są wyodrębniane (gating) ze wszystkich zdarzeń poprzez analizę obrazów komórek w oparciu o wartość średniokwadratową szybkości zmiany profilu intensywności obrazu (Gradient RMS) przy użyciu kanału jasnego pola (kanał 4, Ch04), zgodnie z opisem w tekście. B. Wśród zdarzeń będących w obszarze ostrości dublety odróżnia się od pojedynczych komórek poprzez wykreślenie zależności współczynnika proporcji (aspect ratio) od powierzchni w kanale jasnego pola. Pojedyncze komórki grupują się w pobliżu współczynnika proporcji równego 1 i mają mniejszą powierzchnię, podczas gdy dublety znajdują się w pobliżu wartości 0,5 i mają większą powierzchnię. C. Następnie nanosi się intensywność fluorescencji APC (w tym przypadku markera komórek dendrytycznych [DC], CD1c) w funkcji intensywności fluorescencji markera limfocytów T (w tym przypadku CD90.2) i wyznacza bramkę dla zdarzeń podwójnie dodatnich. Granice bramki można doprecyzować poprzez analizę obrazów zdarzeń znajdujących się w pobliżu tych granic. D. Następnie dublety T-APC są oczyszczane tak, aby zawierały tylko jedną komórkę APC, poprzez wykreślenie współczynnika kształtu (aspect ratio) w funkcji powierzchni markera APC (CD1c, Ch02). E. Następnie dublety te, wykazujące pojedynczy sygnał APC, są filtrowane w celu wyodrębnienia populacji zawierającej tylko jedną komórkę T poprzez analizę wykresu stosunku boków (aspect ratio) w funkcji pola powierzchni markera komórek T (CD90.2, Ch06). F. Wreszcie, zdarzenia zawierające tylko dwa jądra są wybierane poprzez wykreślenie histogramu liczby plamek w kanale barwienia jąder (7-AAD, Ch05) i bramowanie zdarzeń zawierających dokładnie 2 plamki pozytywne pod kątem 7-AAD (t.j. jądra). Zdarzenia w tej bramce analizuje się pod kątem kontaktu błonowego i tworzenia synaps, zgodnie z opisem w Rysunek 2Dane analizowano metodą ślepą pod kątem przydzielenia do grupy terapeutycznej; pochodzą one z wcześniej opublikowanego eksperymentu.23. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Strategia bramkowania została opisana w tej sekcji i jest przedstawiona na Rysunku 1. Analiza danych z przepływowej cytometrii obrazowej powinna być przeprowadzona w sposób zaślepiony pod kątem przypisania do grupy badawczej. Choć uważamy, że synapsy immunologiczne i kontakty niesynaptyczne są zazwyczaj łatwo rozróżnialne (patrz poniżej oraz Rysunki 2 i 3), zaślepienie powinno zminimalizować błąd wynikający z subiektywizmu nieodłącznie związanego z analizą obrazów.

  1. Wygeneruj macierz kompensacji, ładując pliki danych kontrolnych z pojedynczym barwieniem do kreatora kompensacji. Po załadowaniu plików z pojedynczym barwieniem wybierz kanały fluorescencyjne wykorzystane w eksperymencie.
    UWAGA: Oprogramowanie automatycznie generuje macierz kompensacji, jednak należy ją ręcznie zweryfikować, aby upewnić się, że wybrano odpowiednie populacje pozytywne.
    1. Kliknij dwukrotnie wartość w macierzy i dodaj wykres do obszaru analizy. W razie potrzeby utwórz nową bramkę, aby wykluczyć martwe komórki/dublety/fałszywe wyniki pozytywne; tę nową, doprecyzowaną populację pozytywną można wybrać w polu macierzy z menu rozwijanego dla każdego kanału.
    2. Powtórz tę czynność dla każdego kanału. Kliknij „Finish”, aby zapisać macierz kompensacji (plik .ctm).
  2. Uzyskaj plik analizy danych (.daf) z pliku surowego (.rif), ładując plik .rif do oprogramowania analitycznego i stosując macierz kompensacji.
  3. Po załadowaniu danych przeprowadź bramkowanie w celu zidentyfikowania zdarzeń kontaktu komórek T z APC.
    UWAGA: Typowa strategia bramkowania obejmuje identyfikację zdarzeń będących w płaszczyźnie ogniskowania, wybór dubletów na podstawie kryteriów wielkości (pole powierzchni względem współczynnika proporcji zdarzenia) oraz wybór dubletów komórek T-APC jako zdarzeń podwójnie pozytywnych dla markerów komórek T i APC (Rycina 1A-C).
    UWAGA: Współczynnik proporcji to stosunek szerokości zdarzenia do jego wysokości, co pozwala odróżnić pojedyncze komórki (stosunek bliski 1) od dubletów (stosunek bliski 0,5).
  4. Zidentyfikuj zdarzenia będące w płaszczyźnie ogniskowania, wykreślając pierwiastkę średnią kwadratów szybkości zmiany profilu intensywności obrazowania (gradient RMS) w kanale jasnego pola (Rycina 1A). Kliknij histogram gradient RMS, aby wyświetlić zdarzenia komórkowe w poszczególnych przedziałach, a następnie ustaw bramkę wykluczającą zdarzenia poza płaszczyzną ogniskowania.
  5. Wykreśl pole powierzchni względem współczynnika proporcji w kanale jasnego pola i narysuj bramkę identyfikującą dublety na podstawie kształtu i wielkości zdarzeń (Rycina 1B). Przegląd obrazów zdarzeń znajdujących się tuż wewnątrz i na zewnątrz granicy tej bramki może pomóc analitykowi doprecyzować rozmiar i pozycję bramki. Następnie stwórz wykres tych zdarzeń dubletowych, w którym na jednej osi znajduje się intensywność markera komórek T, a na drugiej intensywność markera APC. Narysuj bramkę dubletów T-APC zawierającą zdarzenia pozytywne dla obu markerów.
  6. Spośród zdarzeń dubletowych komórek T-APC wybierz zdarzenia zawierające tylko jedną komórkę T i jedną APC.
    1. Zrób to, wykreślając współczynnik proporcji względem pola powierzchni dla markera APC i ustawiając bramkę na dubletach zawierających pojedynczą APC (Rycina 1D). Wykreśl współczynnik proporcji względem pola powierzchni dla markera komórek T i ustaw bramkę na dubletach zawierających pojedynczą komórkę T (Rycina 1E).
      UWAGA: Dalsze doprecyzowanie można osiągnąć poprzez wykreślenie histogramu funkcji zliczania plamek (spot count) zastosowanej do fluorescencji barwienia jąder komórkowych i ustawienie bramki na zdarzenia z tylko dwiema plamkami (Rycina 1F).
  7. W niektórych przypadkach dwie komórki w dublecie nie będą w kontakcie; aby zidentyfikować komórki stykające się ze sobą, zdefiniuj maski obiektów dla APC i komórek T.
    1. Użyj opcji „Masks” w menu Analizy, aby otworzyć menedżera masek i zdefiniować nową maskę. Wpisz nazwę, np. „T-cell object mask”. Kliknij przycisk „Function” i w oknie dialogowym wybierz „Object”.
    2. Wybierz kanał, w którym wykrywany jest marker komórek T (np. Ch06). Kliknij „OK”.
      UWAGA: W polu funkcji wyświetla się „Object (M06, Ch06, Tight)”. Ta domyślna maska obiektów zazwyczaj sprawdza się dobrze, ale może wymagać optymalizacji.
    3. Powtórz ten proces, aby utworzyć maskę obiektu APC w odpowiednim kanale.
  8. Po zidentyfikowaniu masek APC i komórek T określ kontakt błonowy, wykreślając intensywność fluorescencji markera komórek T w masce obiektu APC względem intensywności fluorescencji APC w masce obiektu komórek T. Na tym wykresie narysuj bramkę obejmującą tylko komórki stykające się ze sobą.
    UWAGA: Zazwyczaj występują dość wyraźne populacje podwójnie pozytywne i podwójnie negatywne (Rycina 2A). Granicę między populacjami podwójnie pozytywnymi a podwójnie negatywnymi można ustalić poprzez przeglądanie obrazów jasnego pola komórek w obszarze granicznym, aby upewnić się, że komórki w kontakcie znajdują się wewnątrz bramki, a komórki nie będące w kontakcie są wykluczone.
  9. Na tym etapie ręcznie przejrzyj obrazy faloidyny FITC zdarzeń w obrębie tej bramki, aby odróżnić dojrzałe synapsy immunologiczne od zwykłego kontaktu komórka-komórka. Użyj funkcji „tag images”, aby oznaczyć te obrazy.
    UWAGA: Procent oznaczonych zdarzeń (synaps immunologicznych) wewnątrz tej bramki może służyć jako wskaźnik bezpośredniej alloreaktywności w badanej populacji komórek T.

Wyniki

Metodę tę zastosowano do zbadania CD4+ Alloreaktywność limfocytów T u myszy poddanych tolerancji na alloantygeny dawcy przed heterotopowym przeszczepieniem allograftu serca. myszy CBA (H-2k) zastosowano protokół toleryzujący obejmujący specyficzne dla dawcy (B6, H-2b) transfuzja krwi w połączeniu z niedeplecyjnym przeciwciałem anty-CD4 na miesiąc przed przeszczepieniem serca od dawcy B6. Protokół ten prowadzi do długoterminowego przeżycia allograftu zależnego od Foxp3+ limfocyty T regulatorowe36,37Siedem dni po transplantacji, CD4 śledzionowe+ Limfocyty T pobrano od biorców allograftów serca B6 ztolerowanych i nietolerowanych, a następnie inkubowano je wspólnie z komórkami dendrytycznymi pochodzącymi z szpiku kostnego myszy B6 zgodnie z niniejszym protokołem. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne dane z tego eksperymentu. Bramka kontaktu błony jest pokazana w Rycina 2A, z zielonymi celownikami umieszczonymi na zdarzeniu synaptycznym (lewy panel, 1) oraz na zdarzeniu niesynaptycznym (prawy panel). Rycina 2B przedstawia kanały w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym dla tego zdarzenia. Aby zminimalizować błąd systematyczny, dane zostały przeanalizowane przez obserwatora nieznającego przydziału do grup badawczych23Jak pokazano w kilku przykładach w Rysunek 3, obie z grup nietolerowanych (Rycina 3A-B) i utolerowane (Rycina 3C-D) u biorców szczepu CBA otrzymujących serca B6 synapsy można łatwo odróżnić od kontaktów niesynaptycznych dzięki obecności gęstego, FITC-dodatniego grzbietu na styku T-APC. Wyniki te pokazują, że wizualna detekcja synaps immunologicznych tworzonych przez limfocyty T biorcy koreluje ze stopniem alloreaktywności u biorcy.

Analiza danych z cytometrii przepływowej, wykres rozrzutu CD1c/CD90 i mikroskopia fluorescencyjna, detekcja kontaktów błonowych.
Rysunek 2. Identyfikacja dubletów T-APC z kontaktem błonowym i formowaniem synapsy immunologicznej. Zdarzenia w końcowym bramowaniu dubletów (Ryc. 1F) zostają poddane analizie. A. Fluorescencja markerów limfocytów T w masce obiektów APC jest wykreślona w funkcji fluorescencji markerów APC w masce obiektów DC. Niektóre zdarzenia typu doublet składają się z komórki APC i limfocytu T bez kontaktu międzykomórkowego i pojawiają się w lewym dolnym rogu wykresu (obrazy nie pokazane). Można zatem wyznaczyć bramkę kontaktu błonowego, która obejmuje tylko doublety, w których limfocyty T i komórki APC są w kontakcie. Obrazy każdego zdarzenia w tej bramce są analizowane pod kątem dowodów na reorganizację cytoszkieletu aktynowego w kanale phalloidin-FITC i mogą zostać oznaczone za pomocą oprogramowania analitycznego. Lewy panel wskazuje zdarzenie synapsy immunologicznej (oznaczone cyfrą 1 i zaznaczone zielonymym celownikiem), natomiast prawy panel wskazuje zdarzenie kontaktu błonowego bez formowania synapsy immunologicznej (oznaczone cyfrą 2 i zaznaczone zielonym celownikiem). Określenie, czy doszło do formowania synapsy, wymaga ręcznej analizy tych obrazów, przedstawionych w części B. B. Górny rząd przedstawia obrazy w polu jasnym oraz w kanałach fluorescencyjnych dla dubletu z synapsą immunologiczną (odpowiada zdarzeniu 1 w A); dolny rząd przedstawia dublet z kontaktem błonowym, ale bez formowania się synapsy (odpowiada zdarzeniu 2 w A). Dane zostały przeanalizowane w sposób ślepy w odniesieniu do przydziału do grupy badawczej i pochodzą z wcześniej opublikowanego eksperymentu.23. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej; pokazano markery CD11c i CD90 w świetle przechodzącym oraz nałożenie obrazu z faloidyną.
Rysunek 3. Przykłady tworzenia synaps T-APC. Myszy CBA otrzymały alloprzeszczepy serca od dawców B6 po braku wstępnego przygotowania (A-B) lub po indukcji tolerancji przy użyciu krwi pełnej myszy B6 w obecności niedepletującego przeciwciała anty-CD4 (C-D). Po 7 dniach, CD4 śledzionowe+ Przeprowadzono testy tworzenia synaps przez limfocyty T z komórkami dendrytycznymi B6. A. Trzy przykłady dubletów niesynaptycznych z kontaktem błonowym u zwierzęcia nietoleryzowanego. B. Trzy przykłady synaps immunologicznych z nieuodpornionego zwierzęcia. C. Trzy przykłady niesynaptycznych dubletów z kontaktem błonowym u zwierzęcia toleryzowanego. D. Trzy przykłady synaps immunologicznych z zwierzęcia toleroplastowanego. Formowanie się synapsy jest wskazane przez obecność jasnego, FITC-dodatniego obrzeża na styku limfocytu T i APC (Ch03). Dane zostały przeanalizowane w sposób zaślepiony pod względem przydziału do grup terapeutycznych i pochodzą z uprzednio opublikowanego eksperymentu.23. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przeciwciało/BarwnikFluorochromKanałStężenie
CD1ceF450Rozdział 025 µg/mL, miareczkować empirycznie
CD90.2APCRozdział 065 µg/mL, miareczkować empirycznie
FaloidynaFITCRozdział 030.05 - 0.5 µg/mL
7-AAD-Rozdział 0525 µg/mL

Tabela 1. Przeciwciała i barwniki użyte w niniejszym badaniu.W tabeli przedstawiono przeciwciała koniugowane z fluorochromami, barwniki, dostawców oraz zalecane stężenia. W tabeli wskazano również kanał cytometru przepływowego z obrazowaniem, który został wykorzystany do detekcji każdego fluorochromu.

Dyskusja

Obrazowa cytometria przepływowa została wykorzystana do wykazania tworzenia synaps immunologicznych między monoklonalnymi limfocytami T a APC lub w obecności superantygenów 24,25,26,27,28. Metoda ta wykorzystuje fakt, że po produktywnym kontakcie limfocytów T z APC, limfocyty T przegrupowują swój cytoszkielet aktynowy, polaryzując go w kierunku miejsca kontaktu21. To przegrupowanie nie zachodzi bez sygnalizacji TCR, a zatem jest wczesnym korelatem aktywacji komórek T 19,20,21. Przedstawiona tutaj metoda dostosowuje to podejście do pomiaru częstości alloreaktywnych limfocytów T w populacjach poliklonalnych komórek T. W związku z tym może w przyszłości posłużyć jako podstawa do opracowania testów reaktywności dawcy w transplantacji klinicznej.

Chociaż nie dokonano jeszcze bezpośrednich porównań, wykrywanie alloreaktywnych synaps immunologicznych wydaje się mieć większą moc predykcyjną niż konwencjonalny MLR. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że w opisanym powyżej protokole tolerancji wyniki MLR nie są wiarygodnie skorelowane z wynikiem przeszczepu2.

Opracowano szereg testów dla stanu tolerancji operacyjnej u ludzi 9,10,11, chociaż nie mierzą one funkcji komórek efektorowych w odpowiedzi na alloantygen. W przeciwieństwie do tego, testy IFNγ ELISPOT8 mierzą funkcję efektorowych limfocytów T, ale nie mogą uchwycić pełnego spektrum wydzielania cytokin, które mogą być istotne dla ostrego i przewlekłego odrzucenia przeszczepu allogenicznego, takich jak IL-1738,39. Test rozcieńczeniaograniczającego 4, który jest pracochłonny, oraz test trans-vivo 6, który wymaga myszy, mają znaczne ograniczenia praktyczne, które utrudniałyby ich zastosowanie w warunkach klinicznych. Ostatnie ulepszenia w analizie proliferujących komórek za pomocą analizy sekwencji TCR limfocytów T reagujących w MLR mogą być cenne, ale podobnie jak przedstawiony tutaj test, będą wymagały dalszej walidacji w badaniach klinicznych18,40.

Dalszy rozwój testu wykrywania synaps immunologicznych będzie wymagał odpowiedzi na szereg ważnych pytań. Po pierwsze, opracowany test mierzy tylko bezpośrednią alloreaktywność. Bezpośrednia ścieżka polega na prezentacji allogenicznych kompleksów MHC/peptyd na APC pochodzących od dawcy. Te ostatnie są na ogół eliminowane szybko po przeszczepie, a dalsza prezentacja alloantygenu jest przeprowadzana przez APC biorcy prezentujące nienaruszone MHC dawcy (szlak półbezpośredni) lub przetworzone antygeny dawcy na własnym MHC (szlak pośredni). Szlak pośredni jest ważnym czynnikiem powodującym przewlekłe odrzucenie przeszczepu allogenicznego33,41.

Zasadniczo powinno być możliwe wykrycie pośrednich synaps immunologicznych za pomocą tego testu, ale pośrednio alloreaktywne limfocyty T mają znacznie niższą częstotliwość niż bezpośrednie42,43, co oznacza, że wymagana będzie analiza większej liczby zdarzeń. Drugą kwestią jest to, że przetestowaliśmy ten test tylko przy użyciu limfocytów T CD4 +, podczas gdy limfocyty T CD8 + są również ważnym elementem odpowiedzi anty-donorowej. Ponownie, powinno być możliwe wykrycie synaps CD8 + limfocytów T-APC za pomocą tej metody. Kolejnym ograniczeniem jest to, że metoda wymaga ręcznego przeglądu i analizy obrazów komórek w końcowej bramce kontaktowej błony, a obecnie pracujemy nad automatyzacją tego etapu.

Wreszcie, metoda wymaga testów i rozwoju na ludziach, a obecnie prowadzone są wstępne badania na próbkach ludzkich. Dalsza analiza fenotypowych podzbiorów limfocytów T (tj. efektorowych, pamięciowych, regulacyjnych itp.) w połączeniu z wykrywaniem synaps immunologicznych u biorców przeszczepów stanowiłaby skuteczne podejście do charakteryzowania repertuaru alloreaktywnych limfocytów T i będzie ważnym celem przyszłych prac.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

S.C.J. był wspierany przez International Society for Heart and Lung Transplantation Research Fellowship oraz Royal College of Physicians and Surgeons of Canada Detweiler Travelling Fellowship.S.M. był częściowo wspierany przez International Society for Heart and Lung Transplantation Career Development Award (dla S.C.J.). S.S. był wspierany przez National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.J.H. jest laureatem Kidney Research U.K. Senior Stypendium niekliniczne. Praca ta została sfinansowana z następujących grantów dla A.B. i K.W.: Wellcome Trust Programme Grant (082519Z07Z), British Heart Foundation Programme Grant (PG/10/62.28504) oraz Programu Ramowego UE 7 (ONE Study; BioDRIM). Autorzy pragną podziękować Michaelowi Parsonsowi i Flow Cytometry Core Facility w Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto za zapewnienie dostępu i wsparcia z instrumentem ImageStream Mark X.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiRóżneodmiany
Kwas etylenodianotetraoctowy, roztwór 0,5 MThermo Fisher ScientificAM9260G
Niejonowy detergent Triton X-100Sigma-AldrichX100
Beta-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD8418
Roztwór formaldehyduSigma-AldrichF1635składa się w 37% z formaldehydu, dlatego należy go rozcieńczyć 25 razy w celu uzyskania 1,5%
roztworu Sitka do komórek, 70 μ m wielkość porówFisher Scientific08-771-2
Izotiocyjanian falloidyny-fluoresceinySigma-AldrichP5282
7-aminoaktynomycyna DThermo Fisher ScientificA1310Rekonstytucja w DMSO
Anty-mysia koniugacja allofikocyjaniny CD90.2eBioscience17-0902
Pacyficzny niebieski sprzężony anty-mysz CD11beBioscience48-0112Błękit pacyficzny został zastąpiony przez eFluor 450
Biotynylowany anty-mysz CD3eBioscience13-0032
Biotynylowany anty-mysz MHC klasy IIeBioscience13-5321
Biotynylowany anty-mysz B220eBioscience13-0452
Biotynylowany anty-mysz CD8eBioscience13-0081
Biotynylowany anty-mysz CD19eBioscience13-0193
Mikrogranulki antybiotynoweMiltenyi Biotec130-090-485
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
Magnetyczny separator komórek MidiMACSMIltenyi Biotec130-042-302
rekombinowana mysz GM-CSFPeprotech315-03
rekombinowany ludzki TGF i beta; 1Peprotech100-21Ludzki TGFβ 1 działa na komórki myszy
Amnis ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/AObrazujący cytometr przepływowy; Szczegóły dostępne na stronie http://www.emdmillipore.com/
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/ABezpłatne pobieranie (wymagana rejestracja): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Pożywka do hodowli komórkowych RóżneRóżni
Surowica bydlęca płoduRóżneRóżne Płytki
do hodowli komórkowychRóżneRóżne
się

Bibliografia

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153(2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943(2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie synapsy immunologicznejmieszana reakcja leukocytarnalimfocyty T regulatorowekom rki prezentuj ce antygenanaliza cytometrycznamikroskopia fluorescencyjnazdarzenia kontaktu kom rkowegoimmunologia transplantacyjna

Powiązane artykuły