Artykuł metodologiczny

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55284

⸱

18 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

W tym artykule

Podsumowanie

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Streszczenie

Podczas przewlekłych uszkodzeń wątroby, komórki progenitorowe rozwijają się w procesie zwanym reakcją przewodową, co również pociąga za sobą pojawienie się zapalnego nacieku komórkowego i aktywację komórek nabłonkowych. Populacja komórek progenitorowych podczas takich reakcji zapalnych była w większości badana przy użyciu markerów jednopowierzchniowych, albo za pomocą analizy histologicznej, albo technik opartych na cytometrii przepływowej. Jednak w ramach nowych markerów powierzchniowych zidentyfikowano różne funkcjonalnie odrębne podzbiory w obrębie przedziału komórek progenitorowych/macierzystych wątroby. Przedstawiona tutaj metoda opisuje izolację i szczegółową analizę cytometrii przepływowej podzbiorów progenitorów przy użyciu nowych kombinacji markerów powierzchniowych. Ponadto pokazano, w jaki sposób można wyizolować różne podzbiory komórek progenitorowych z wysoką czystością przy użyciu zautomatyzowanych metod sortowania magnetycznego i opartego na FACS. Co ważne, nowatorska i uproszczona dysocjacja enzymatyczna wątroby pozwala na izolację tych rzadkich populacji komórek o wysokiej żywotności, która jest lepsza w porównaniu z innymi istniejącymi metodami. Jest to szczególnie istotne dla dalszych badań komórek progenitorowych in vitro lub dla wyizolowania wysokiej jakości RNA w celu analizy profilu ekspresji genów.

Wprowadzenie

Regeneracja wątroby jest głównie związana ze zdolnością hepatocytów do samoodnawiania. Niemniej jednak przewlekłe uszkodzenia wątroby występują z aktywacją i ekspansją komórek progenitorowych, co jest związane z ich zdolnością do różnicowania się w hepatocyty i cholangiocyty1,2,3,4. Jest to szczególnie istotne, ponieważ podczas przewlekłych urazów proliferacja hepatocytów nie jest skuteczna. Pomimo wielu badań genetycznych ukierunkowanych na komórki progenitorowe, ich rola w regeneracji wątroby pozostaje kontrowersyjna5,6,7,8. Co więcej, aktywacja komórek progenitorowych została powiązana ze zwiększoną odpowiedzią zwłóknieniową w wątrobie, co rodzi pytania o ich dokładną rolę podczas urazów9,10.

Heterogeniczność przedziału komórek progenitorowych od dawna była sugerowana przez badania ekspresji genów, które izolowały komórki progenitorowe wyrażające pojedynczy marker powierzchniowy za pomocą mikrodysekcji lub metod opartych na sortowaniu komórek1,11. Rzeczywiście, niedawno, nowa kombinacja markerów powierzchniowych przy użyciu gp38 (podoplaniny) jednoznacznie powiązała poprzednie pojedyncze markery komórek progenitorowych z różnymi podzbiorami12. Co ważne, podzbiory te nie tylko różniły się wyrażeniem znaczników powierzchniowych, ale także wykazywały zmiany funkcjonalne podczas urazów12.

Wiele modeli zwierzęcych zostało wykorzystanych do zbadania aktywacji komórek progenitorowych i regeneracji wątroby. Wydaje się, że różne rodzaje urazów sprzyjają aktywacji różnych podzbiorów komórek progenitorowych12. To może wyjaśniać fenotypową rozbieżność reakcji przewodowej obserwowaną u ludzi4. W związku z tym złożone analizy fenotypowe i funkcjonalne komórek progenitorowych mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w urazach i prawdziwego znaczenia reakcji przewodowej w chorobach wątroby.

Oprócz kombinacji markerów powierzchniowych, kluczowe różnice w protokołach izolacji komórek dodatkowo komplikują wnioski oparte na poprzednich badaniach2. Znaczna liczba badań dotyczyła roli komórek progenitorowych, które znacznie różnią się protokołem izolacji (np. dysocjacja wątroby (kombinacja enzymów i czas trwania procesu), pożywka o gęstości i szybkość wirowania)2. Zoptymalizowana technika izolacji, zapewniająca lepszą żywotność rzadkich populacji komórek i odzwierciedlająca skład podzbiorów, została niedawno opracowana i opublikowana12. Celem tego artykułu jest przedstawienie bardziej szczegółowego protokołu tej procedury izolacji komórek wątroby oraz analizy podzbiorów, aby umożliwić prawidłowe odtworzenie tej techniki. Dodatkowo protokół zawiera porównanie z poprzednią metodą izolacji, aby pokazać różnice w porównaniu z nowym protokołem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą komisji etyki i opieki nad zwierzętami Centrum Medycznego Uniwersytetu Homburg

.

1. Przygotowanie materiałów i

  1. Świeżo przygotuj wszystkie wymagane do trawienia wątroby przy użyciu sterylnych składników i kaptura laminarnego, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego.
  2. Przygotować bufor zbiorczy (CB), mieszając 49,5 ml pożywki RPMI i 0,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS; niska endotoksyna, inaktywowana termicznie) w celu uzyskania 1% (v/v) roztworu. Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Około 25 ml CB jest niezbędne do strawienia jednej całej wątroby.
  3. Przygotuj bufor do wytrawiania (DB), używając następujących składników: pożywka RPMI, 1% (v/v) FBS (niska endotoksyna, inaktywowana termicznie), kolagenaza P (0,2 mg/ml), DNaza-I (0,1 mg/ml) i dyspaza (0,8 mg/ml).
    UWAGA: Około 25 ml DB jest niezbędne do strawienia jednej całej wątroby. Przed użyciem podgrzej DB w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Po przybyciu enzymy należy rozpuścić w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS; kolagen P i dyspaza) lub w buforze DNazy-I (50% (v/v) glicerol, 1 mM MgCl2 i 20 mM Tris-HCl; pH 7,5), podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przechowywać bufor DNazy-I w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch miesięcy.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej wątroby

  1. Eutanazja nieleczonych myszy typu dzikiego przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z lokalnymi komisjami etycznymi i opiekuńczymi.
  2. Umieść myszy na desce rozbiorczej i zwilż futro 70% etanolem. Za pomocą nożyczek otwórz brzuch z nacięciem skóry w linii środkowej, a następnie nacięciem w kształcie litery Y w kierunku kończyn. Otwórz otrzewną aż do mostka za pomocą nożyczek. W celu odsłonięcia wątroby należy delikatnie przesunąć jelito na prawą stronę za pomocą bawełnianego wacika.
  3. Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń płaty wątroby, pozostawiając woreczek żółciowy i unikaj zanieczyszczenia tkanką łączną. Zważyć wątrobę i umieścić ją na lodzie na szalce Petriego zawierającej HBSS.
  4. Umieścić płaty wątroby na suchej szalce Petriego i pokroić tkankę wątroby w jednorodne kostki o boku około 2 mm za pomocą skalpela. Przenieś kawałki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  5. Dodać 2,5 ml DB do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej kawałki wątroby i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozpocząć proces trawienia (zdrowa wątroba potrzebuje 60-70 minut, a marskość wątroby 80-90 minut).
    UWAGA: Jeśli trawiona jest jedna cała wątroba, wątroba powinna zostać oddzielona do dwóch stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, aby zapewnić dobrą żywotność komórek.
  6. Przygotuj nową stożkową probówkę wirówkową o pojemności 15 ml do zbierania uwolnionych komórek wątroby. Umieść siatkę filtracyjną z poliamidu 100 μm na górze rurki i zwilż siatkę 800 μl CB. Umieść stożkową probówkę wirówkową na lodzie.
  7. Po 5 i 10 minutach wymieszać próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu wspięcia procesu trawienia poprzez potrząsanie stożkową probówką wirówkową o pojemności 15 ml zawierającą kawałki wątroby.
  8. Po 15 minutach od rozpoczęcia trawienia delikatnie wymieszaj kawałki wątroby za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z naciętą końcówką, która umożliwia łatwe przejście kawałków wątroby. Umieść probówki z powrotem w łaźni wodnej i pozwól im osiąść przez 2 minuty.
  9. Usunąć supernatant zawierający rozsiane komórki (zazwyczaj 2 x 700 μl) i dodać go do probówki przygotowanej w kroku 2.6. Zastąpić usunięty supernatant roztworem DB (2 x 700 μl) i umieścić go z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  10. Powtórz procedurę opisaną w kroku 2.8 (zwykle po 30, 40, 50, 55 i 60 minutach), aż minie około 60-70 minut od rozpoczęcia trawienia. Po 40 minutach pozostałe fragmenty wątroby powinny być na tyle małe, aby przeszły przez nieoszlifowaną końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl.
    UWAGA: Zdrowa wątroba jest w pełni trawiona w ciągu 60-70 minut, podczas gdy zwłóknienie wątroby zwykle potrzebuje 80-90 minut. Do tego czasu tkanka wątroby nie powinna być widoczna w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej fragmenty wątroby, a wszystkie uwolnione komórki powinny zostać przeniesione do probówki przygotowanej w kroku 2.6.
  11. Pod koniec procesu trawienia zebrać komórki i odwirować je przez 8 minut w temperaturze 180 x g i temperaturze 4 °C (przy użyciu zmniejszonego przyspieszenia/4 i opóźnienia/2).
  12. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) i inkubować go przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek. Zatrzymać reakcję przez dodanie 5 ml CB, a następnie odwirować komórki przez 8 minut w temperaturze 180 x g i 4 °C (stosując zmniejszone przyspieszenie/4 i opóźnienie/2). Ponownie zawiesić komórki w 4 ml CB i przechowywać je na lodzie. Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 3.
    UWAGA: Osad komórkowy jest luźny i dlatego supernatant jest pipetowany, a nie dekantowany.

3. Oznaczanie liczby komórek za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Do określania liczby komórek sugeruje się automatyczny licznik komórek lub, najlepiej, opisaną poniżej kwantyfikację komórek opartą na cytometrii przepływowej, zamiast klasycznej metody opartej na komorze Neubauera. Zawiesina jednokomórkowa wątroby opisana w kroku 2 zawiera komórki miąższowe i niemiąższowe (NPC) o znacznie różniących się rozmiarach i ziarnistości. Właściwe wykluczenie resztek komórkowych wraz z charakterystycznym dla NPC rozproszeniem do przodu i rozproszeniem bocznym (FSC-SSC) przy użyciu cytometrii przepływowej zapewnia sukces opisanego protokołu12.

  1. Przygotować podwielokrotność zawiesiny komórek wątroby (20 μl) i dodać 174 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 6 μl jodu propidynowego (PI; stężenie końcowe 0,375 μg/ml). Dodaj koraliki do liczenia, które pozwalają na ilościowe określenie komórek.
  2. Bramka na SSC-A-FSC-A, aby uniknąć zanieczyszczeń i jeszcze bardziej wykluczyć dublety przy użyciu FSC-H i FCS-A.
    UWAGA: Ważne jest, aby postępować zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na rysunku 2.
  3. Odklucz martwe komórki PI-dodatnie, zmierz 30 μl z próbek i zarejestruj zdarzenia. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta, aby obliczyć liczbę komórek.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z krokami 4 dla pomiaru cytometrii przepływowej, krokami 5 i 6 dla izolacji komórek progenitorowych opartych na magnesach oraz krokami 7 dla subpopulacji progenitorowych według cytometrii przepływowej.

4. Barwienie zawiesiny jednokomórkowej wątroby do analizy cytometrycznej Fow podzbiorów progenitorów

pkt. jedn. jedn. pkt. pkt. pkt. powiedział: Rozdział jedn. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jedn. jedn.
przeciwciałoklonHost/Isotype (Host/Isotyp)Stężenie zapasów [mg/mL]Rozcieńczeniu
Płyta CD64Zobacz materiał X54-5/7.1Mysz IgG1, κ0,51:100
Płyta CD16/3293 Rozdział 93Szczur IgG2a, λ0,51:100
Płyta CD4530-F11Szczur IgG2b, κ0,21:200
Płyta CD31MEC13.3Szczur IgG2a, κ0,51:200
Protokół ASGPR1Poliklonalna kozła IgG0,21:100
Podoplanina08.01.2001Chomik syryjski IgG0,21:1,400
Podoplanina08.01.2001Chomik syryjski IgG0,51:1,400
Płyta CD133Zobacz materiał MB9-3G8Szczur IgG10,033 μL
Płyta CD133Zobacz materiał 315-2C11Szczur IgG2a, λ0,51:100
CD34Pamięć RAM34Szczur IgG2a, κ0,51:100
CD90.253-2,1Szczur IgG2, κ0,51:800
Płyta CD157BP-3Mysz IgG2b, κ0,21:600
EpCAM (Protokół EpCAM)Klasa G8.8Szczur IgG2a, κ0,21:100
Zobacz materiał SCA-1Zobacz materiał D7Szczur IgG2a, κ0,0310 μL
Mysz IgG2b, κZobacz materiał MPC-110,2
Szczur IgG1RTK20710,2
Szczur IgG2b, κRTK45300,2
Szczur IgG2a, κRTK27580,5
Szczur IgG2a, κRTK27580,2
Chomik syryjski IgGSHG-10,2
Chomik syryjski IgGSHG-10,5
Normalna kontrola IgG kózPoliklonalna kozła IgG1
Osioł anty-kozioł IgGOsioł IgGcyfra arabska1:800
Streptawidyna11:400

Tabela 1.

przeciwciało1cyfra arabska345
CD45 APC/CY7Szczur IgG2b, κ
0,5 μL		++++
CD31 Biotyna+Szczur IgG2a, κ
0,5 μL		+++
Oczyszczony ASGPR1++Normalna kontrola IgG kóz
0,2 μl		++
Podoplanin APC+++Chomik syryjski IgG
1 μl rozcieńczenia 1:14		+
CD133 PE++++Szczur IgG1
0,45 μl
Osioł anty-kozioł
Alexa Fluor 488		+++++
Streptawidyna
Alexa Fluor 405		+++++

Tabela 2.

  1. Umieścić podwielokrotność zawiesiny komórkowej z kroku 2.11 w probówce reakcyjnej (1,5 ml) zawierającej 2,5 x 105 komórek, oznaczonej zgodnie z opisem w kroku 3.
  2. Odwirowywać komórki przez 3 minuty w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C za pomocą mikrowirówki.
    UWAGA: W tym momencie można użyć pompy próżniowej, aby ostrożnie usunąć supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy w mieszance bloków Fc i inkubować go przez 5 minut na lodzie. Przygotować mieszankę Fc-block o łącznej objętości 50 μl na plamę. Dodać 10 μl odczynnika blokującego FcR, 1 μl oczyszczonego anty-CD64 (1:100; 0,5 μg/barwienie) i 40 μl buforu barwiącego (bufor ST: HBSS, 1% (v/v) FBS i 0,01% azydku sodu) na barwienie.
    UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i maska na twarz.
  4. Dodać 50 μl mieszanki barwiącej do komórek (całkowita objętość komórek wynosi teraz 100 μl) i inkubować komórki z mieszanką przeciwciał, chronić przed światłem i przez 20 minut na lodzie.
  5. Przygotować mieszaninę przeciwciał o całkowitej objętości 50 μl na plamę. Dla 50 μl buforu ST dodać następujące sprzężone przeciwciała do barwienia zasadowego: CD45 (0,5 μL; 1:200; 0,1 μg/barwienie), CD31 (0,5 μL; 1:200; 0,25 μg/barwienie), ASGPR1 (1 μL; 1:100; 0,2 μg/barwienie), podoplanina (1 μl o rozcieńczeniu 1:14; 1:1,400 rozcieńczenie końcowe; 0,014 μg/barwienie), i CD133 (3 μL; 0,09 μg/barwa).
    UWAGA: Tabela 1 podsumowuje klony przeciwciał i rozcieńczenia stosowane do barwienia podstawowego i do dodatkowych markerów powierzchniowych różnych podzbiorów. Przygotować dodatkowe zawiesiny komórek dla mieszaniny przeciwciał zawierającej odpowiednie kontrole izotypu i/lub fluorescencję minus jedna kontrola (FMO), jak pokazano w tabeli 2.
  6. Dodać 400 μl buforu ST do każdej próbki i odwirować komórki przez 4 minuty w temperaturze 300 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszanki przeciwciał drugorzędowych zawierającej 0,125 μl IgG przeciwko kozom osła (1:800; 0,25 μg/barwę) i 0,25 μl streptawidyny sprzężonej z fluorescencją (1:400; 0,25 μg/barwienie) w 100 μl buforu ST.
  7. Inkubować komórki, chroniąc je przed światłem i mieszanką przeciwciał przez 20 minut na lodzie. Dodać 400 μl buforu ST do każdej próbki i odwirować komórki przez 4 minuty w temperaturze 300 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu ST zawierającego 0,25 μg/ml PI.
    UWAGA: Żywotność komórek progenitorowych zmniejsza się z czasem; Dlatego zaleca się jak najszybsze pobranie świeżych próbek.

5. Magnetyczne wzbogacanie komórek progenitorowych za pomocą mikrokulek

  1. Przenieść podwielokrotność zawiesiny jednokomórkowej wątroby zawierającej 1,5-2 x 106 komórek, na podstawie liczby komórek oznaczonej w sposób opisany w kroku 3, do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  2. Odwirowywać komórki przez 8 minut w temperaturze 180 x g i temperaturze 4 °C (przy użyciu zmniejszonego przyspieszania/4 i opóźnienia/2).
    UWAGA: Zazwyczaj jedna zdrowa wątroba myszy C57Bl/6 (lub 1 g tkanki wątroby) będzie musiała zostać oddzielona do trzech stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) HBSS 0,5% (v/v) i dodać 40 μl mikrogranulek anty-CD31 i 30 μl mikrogranulek anty-CD45. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie należy przekraczać czasu inkubacji, ponieważ czystość separacji zostanie znacznie zmniejszona.
  4. Dodać 5 ml HBSS 0,5% (v/v) BSA do komórek i odwirowywać je przez 8 minut przy 180 x g i 4 °C (stosując zmniejszone przyspieszanie/4 i zwalnianie/2).
  5. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl kulek do usuwania martwych komórek i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 15 minut. W międzyczasie przygotuj kolumnę separacyjną LS i skalibruj ją za pomocą 3 ml HBSS 0,5% (v/v) BSA.
    UWAGA: Nie należy przekraczać czasu inkubacji, ponieważ czystość separacji zostanie znacznie zmniejszona.
  6. Dodać 900 μl HBSS 0,5% (v/v) BSA do komórek, przefiltrować je za pomocą poliamidowej siatki filtracyjnej 100 μm i załadować do kolumny separacyjnej LS.
    UWAGA: Załaduj jedną całą wątrobę do jednej kolumny separacyjnej LS.
  7. Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml HBSS 0,5% (v/v) BSA i zebrać przepływ.
  8. Odwirowywać przepływ przez 8 minut przy 180 x g i temperaturze 4°C (przy użyciu zmniejszonego przyspieszania/4 i opóźnienia/2).
  9. Zawiesić osad komórkowy w buforze płuczącym (RB) (PBS i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)) zawierającego 0,5% (v/v) bufor BSA lub ST, w zależności od dalszej procedury doświadczalnej.

6. Automatyczne oczyszczanie komórek progenitorowych z wielu wątrób oparte na mikrokulkach magnetycznych

UWAGA: Ponieważ podzbiory komórek progenitorowych reprezentują rzadkie populacje komórek, często potrzebne jest połączenie komórek z wielu wątrób, aby osiągnąć wystarczającą liczbę komórek do dalszych eksperymentów. Jako przykład separacja komórek CD133+ i gp38+ jest opisana poniżej.

  1. Izolacja komórek progenitorowych CD133+
    1. Po kroku 5.9 policz komórki, jak opisano w kroku 3, i ponownie zawieś do 106 komórek (zwykle zbierając 4-6 zdrowych próbek wątroby) w 100 μl RB.
    2. Dodać do komórek anty-CD64 1:100 i anty-CD16/32 1:100 i inkubować je na lodzie przez 5 minut. Dodać do komórek przeciwciało biotynylowane anty-CD133 w stosunku 1:100 i inkubować je na lodzie przez kolejne 10 minut.
    3. Dodać 5 ml RB i wirować przez 8 minut przy 180 x g i 4 °C (stosując zmniejszone przyspieszanie/4 i opóźnianie/2).
    4. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl RB i dodać 10 μl mikrogranulek antybiotyny. Inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Nie należy przekraczać czasu inkubacji, ponieważ zmniejsza to czystość próbek.
    5. Dodać 5 ml RB i wirować przez 8 minut przy 180 x g i 4 °C (stosując zmniejszone przyspieszanie/4 i opóźnianie/2). Zawiesić osad w 1 ml RB.
  2. Izolacja progenitorów gp38+
    1. Po kroku 5.9 policz komórki, jak opisano w kroku 3, i ponownie zawieś do 106 komórek (zwykle zbierając 4-6 zdrowych próbek wątroby) w 100 μl RB.
    2. Dodać anty-CD64 1:100 i anty-CD16/32 1:100 do komórek i inkubować je na lodzie przez 5 minut. Następnie dodaj do komórek biotynylowane przeciwciało anty-gp38 w stosunku 1:100 i inkubuj je na lodzie przez kolejne 10 minut.
    3. Dodać 5 ml RB i wirować przez 8 minut przy 180 x g i 4 °C (stosując zmniejszone przyspieszanie/4 i opóźnianie/2).
    4. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl RB i dodać 5 μl mikrogranulek antybiotyny. Inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Nie należy przekraczać czasu inkubacji, ponieważ zmniejsza to czystość próbek.
    5. Dodać 5 ml RB i wirować przez 8 minut przy 180 x g i 4 °C (stosując zmniejszone przyspieszanie/4 i opóźnianie/2).
    6. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml RB.
  3. Typowe kroki po kroku 6.1 lub 6.2
    1. Umieść stożkową probówkę wirówkową o pojemności 15 ml zawierającą magnetycznie znakowane zawiesiny komórek na stojaku Chill 5 z dwiema dodatkowymi pustymi probówkami do zbierania frakcji dodatniej i ujemnej. Umieść stojak chłodzący na platformie separacyjnej separatora.
    2. Należy użyć programu selekcji pozytywnej (Possel_d2) z obszernym etapem płukania między każdą próbką (opcja płukania).
      UWAGA: Użycie ręcznego rozdzielania komórek w oparciu o kolumny zamiast automatycznego separatora zmniejszy czystość próbki.
    3. Zebrać frakcję dodatnią i odwirowywać przez 8 minut przy 180 x g i temperaturze 4 °C (przy użyciu zmniejszonego przyspieszania/4 i opóźnienia/2).
    4. Zawiesić osad komórkowy w buforze RB lub ST, w zależności od dalszej procedury doświadczalnej.
    5. W celu sprawdzenia czystości należy pobrać porcję komórek i wybarwić je zgodnie z opisem w kroku 4.

7. Sortowanie komórek cytometrii przepływowej

UWAGA: Wysoki poziom czystości dowolnego podzbioru komórek progenitorowych można osiągnąć za pomocą protokołu opisanego poniżej. Ogólna wydajność komórek jest znacznie niższa niż opisana w kroku 6 i jest najlepsza do analizy ekspresji genów.

parametrustawienie
Rozmiar dyszy85 μm
częstotliwośćw godzinach 46.00 - 46.20
amplitudaw godzinach 38.30 - 55.20
faza0
Opóźnienie upuszczeniaw godz. 28.68 - 28.84
tłumienieod
Pierwsza kropla284 - 297
Luka docelowa9.-14
ciśnienie45 psi

Tabela 3.

  1. Pozyskaj komórki z wzbogacenia opartego na magnesach (opisanego w kroku 5); policz je, jak opisano w kroku 3; i wybarwij je na markery progenitorowe (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 i CD45, jak wyjaśniono w kroku 4.
  2. Przygotuj pożywkę sortującą (SM): wolna od czerwieni fenolowej modyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 0,5% (v/v) BSA i 0,01% (v/v) azydku sodu. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w SM, przenieść je do polipropylenowej probówki okrągłodennej i umieścić na lodzie.
    UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i maska na twarz. Nie należy stosować azydku sodu, jeśli posortowane komórki są używane do testów funkcjonalnych.
  3. Należy użyć oprogramowania odpowiedniego dla typu sortera używanego do izolacji komórek. Otwórz oprogramowanie i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby skonfigurować parametry sortowania i specyfikacje maszyny.
    UWAGA: Dane techniczne maszyny podsumowano w tabeli 3. Chociaż specyfikacje maszyn mogą być różne w różnych instytucjach, ważne jest, aby pamiętać, że konieczne jest zmniejszenie ciśnienia sortowania i większy rozmiar dyszy (dysza 45 psi i 85 μm), aby zwiększyć żywotność populacji komórek progenitorowych i jakość RNA przygotowanego z posortowanych komórek. Ważne jest, aby użyć wzbogaconych komórek progenitorowych wątroby do ustawienia kompensacji. Inne populacje wątroby lub leukocytów mają różną autofluorescencję i skutkują nieoptymalną rozdzielczością populacji zrębu oraz fałszywą strategią bramkowania.
  4. Skalibruj maszynę i umieść 5-mililitrową probówkę okrągłodenną z polipropylenu zawierającą 350 μl SM w urządzeniu do sortowania. Rozpocznij pobieranie i sortowanie próbek. Zbierz 1 000 zdarzeń subpopulacji i zatrzymaj przepływ próbki.
  5. Wyjmij probówkę z urządzenia sortującego i zmierz posortowane komórki na cytometrze przepływowym. Zidentyfikuj procent populacji posortowanych komórek obecnych wśród żywych komórek. Ta wartość procentowa określa czystość posortowanych komórek.
  6. Jeśli czystość sortowania przekracza 95%, umieść 5-mililitrową probówkę okrągłodenną z polipropylenu zawierającą 350 μl buforu do lizy RLT w urządzeniu do sortowania.
  7. Rozpocznij sortowanie i zbierz 7 000-10 000 zdarzeń na subpopulację zrębu.
  8. Przenieść bufor do lizy RLT zawierający posortowane komórki do probówki reakcyjnej wolnej od DNaz i RNaz i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiona tutaj procedura trawienia wątroby z użyciem nowatorskiej mieszaniny enzymów pozwala na uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek zawierającej hepatocyty oraz komórki nieparenchymalne wątroby (Rycina 1 oraz 2a). Po lizie erytrocytów przy użyciu buforu ACK możliwa jest bezpośrednia analiza zawiesiny pojedynczych komórek metodą cytometrii przepływowej (Rycina 1 i 2). Strategia bramkowania obejmuje wykluczenie du...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zapalenie wątroby i urazy różnego pochodzenia uruchamiają procesy regeneracyjne w wątrobie, którym towarzyszy ekspansja i aktywacja komórek progenitorowych 2,3. Te komórki progenitorowe wątroby posiadają cechy komórek macierzystych i prawdopodobnie odgrywają znaczącą rolę w patomechanizmie różnych chorób wątroby.

Od dawna sugerowano niejednorodność komórek progenitorowych wątroby. Ponowna ocena podzbiorów progenitorów wątroby przy użyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Alexandra von Humboldta Sofja Kovalevskaja Award dla VLK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMILife Technologies21875-034
bez czerwieni fenolowej DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
Kolagenaza PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies
ACK LysingBuffer Life TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
Azydek soduSigma-AldrichS2002Przygotuj 1% roztwór podstawowy
10% BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS Roztwór do płukaniaMiltenyi Biotec130-091-222dodać 0,5% (v/v) BSA i przechowywać na lodzie
Bez czerwieni fenolowej DMEMSigma-AldrichD1145
liczenie Koraliki Liczba koralików BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
Odczynnik blokujący FcRMiltenyi Biotec130-092-575
anty-CD31 MikrokulkiMiltenyi Biotec130-097-418
Mikrokulki anty-CD45Miltenyi Biotec130-052-301
Zestaw do usuwania martwych komórekMiltenyi Biotec130-090-101
Mikrokulki antybiotynoweMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 OczyszczonyBioLegend139302Rozcieńczenie: 1:100
CD16/32 OczyszczonyBioLegend101302Rozcieńczenie: 1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116Rozcieńczenie: 1:200, zaznacza komórki krwiotwórcze
CD31Biotyna BioLegend102504Rozcieńczenie: 1:200, oznacza komórki śródbłonka
ASGPR1 OczyszczoneBio-TechneAF2755-SPRozcieńczenie: 1:100, oznacza hepatocyty
Podoplanina APCBioLegend127410Rozcieńczenie: 1:1,400, oznacza komórki progeniorowe
Podoplanina BiotynaBioLegend127404Rozcieńczenie: 1:1,400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210zastosowanie 3 &mikro; L, oznacza komórki progenitorowe
CD133 BiotynaBioLegend141206Rozcieńczenie: 1:100
CD34 BiotynaeBioScience13-0341-81Rozcieńczenie: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend140306Rozcieńczenie: 1:800
CD157 PEBioLegend140203Rozcieńczenie: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225Rozcieńczenie: 1:100
Sca-1 BiotynaMiltenyi Biotec130-101-885zastosowanie 10 &mikro; L
Mysz IgG2b, κ PEBioLegend400311
Szczur IgG1 PEBioLegend400407
Szczur IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
Szczur IgG2a, κ BiotynaBioLegend400504
Szczur IgG2a, κ Brilliant Violet 421BioLegend400535
Chomik syryjski IgG APCBioLegend402012
Chomik syryjski IgG BiotynaBioLegend402004
Normalna kontrola IgG kóz OczyszczonaBio-TechneAB-108-C
Osioł anty-kozi IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11055Rozcieńczenie: 1:800
Streptawidyna Alexa Fluor 405Life TechnologiesS32351Rozcieńczenie: 1:400
100 &mikro; m Siatka filtracyjnaA. HartensteinPAS3
LS KolumnaMiltenyi Biotec130-042-401
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
Polipropylen Okrągła rura dennaFalcon352063
Rneasy plus mini zestawQiagen74134RLT bufor do lizy jest w zestawie
17105041

Bibliografia

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki progenitorowe w trobyanaliza cytometrycznaseparacja za pomoc magnetycznych mikrokuleczekmetody sortowania FACSenzymatyczna dysocjacja w trobybarwienie powierzchniowe kom rekCD45 CD31 ASGPR1ekspresja GP38 CD133izolacja subpopulacji progenitorowych

Powiązane artykuły