Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ixodes scapularis, wektor boreliozy, jest jednym z najważniejszych wektorów choroby we wschodnich i środkowo-zachodnich Stanach Zjednoczonych. Gatunek ten jest kleszczem z trzema żywicielami, który wymaga mączki z krwi od żywiciela kręgowców na każdym etapie rozwoju, a dorosłe samice wymagają mączki z krwi do rozmnażania. Larwy kleszczy przyczepiają się do żywiciela na 3-5 dni w celu żerowania i opuszczają żywiciela, gdy są w pełni nabrzmiałe. Ta zależność od kilku różnych żywicieli i długi czas przyczepiania się do obrzęku komplikuje hodowlę kleszczy w warunkach laboratoryjnych. Jednak, aby zrozumieć biologię kleszczy i interakcje kleszcz-patogen, niezbędna jest produkcja zdrowych, hodowanych w laboratorium kleszczy. Tutaj demonstrujemy prosty, opłacalny protokół żywienia się niedojrzałymi kleszczami na myszach. Zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły w celu zmniejszenia stresu u myszy oraz zwiększenia sukcesu żerowania i przeżywalności kleszczy, używając jednorazowych klatek bez dna z siatki, aby uniknąć kontaktu kleszczy z wodą zanieczyszczoną moczem i kałem myszy.
Wprowadzenie
Kleszcze są obowiązkowymi hematofagicznymi ektopasożytami kręgowców i są rozmieszczone na całym świecie. W Stanach Zjednoczonych co najmniej 11 gatunków kleszczy jest wektorami patogenów o znaczeniu dla zdrowia publicznego1. Ixodes scapularis jest odpowiedzialny za przenoszenie kilku patogenów, takich jak czynniki wywołujące boreliozę (Borrelia burgdorferi), nawracającą gorączkę (B. miyamotoi), ludzką anaplazmozę granulocytarną (Anaplasma phagocytophilum) i babeszjozę (Babesia spp.). Pomimo znaczenia I. scapularis jako wektora choroby, zbieranie tych pajęczaków w dużych ilościach ze środowiska naturalnego do badań w laboratorium nie zawsze jest wykonalne. Dlatego produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen.
Cykl życiowy wszystkich kleszczy twardych (rodzina Ixodidae), w tym I. scapularis, składa się z jaja i trzech aktywnych etapów: larwy, nimfy i dorosłego osobnika. Każdy aktywny etap żywi się żywicielem kręgowców. Złożone interakcje, które zachodzą między kleszczami a ich żywicielami w ciągu kilku dni przyczepiania się i żerowania, są prawie niemożliwe do odtworzenia przy użyciu sztucznych karmników i jest mało prawdopodobne, aby zapewnić wystarczającą liczbę karmionych kleszczy do masowego chowu2,3,4. Dlatego żywe myszy i króliki są najczęściej wykorzystywane jako żywiciele do wychowu odpowiednio niedojrzałych (larwy i nimfy) i dojrzałych stadiów (dorosłych) kleszczy. Konieczność podawania krwi przez wielu gospodarzy na każdym etapie rozwoju komplikuje hodowlę kleszczy oraz jest czasochłonna i kosztowna5,6,7. Większość protokołów hodowli kleszczy wymaga trzymania myszy w klatce podłogowej z podwieszaną siatką drucianą7,8 lub w cylindrycznej klatce o takich wymiarach, że zwierzę nie może się swobodnie poruszać i czyścić samo6,9,10.
Te cylindryczne klatki są później przenoszone do klatki z pudełka po butach z siatką drucianą. Nabrzmiałe, oderwane kleszcze są następnie zbierane z wody pod spodem. Jednak ta metoda powoduje wystawienie karmionych kleszczy na działanie wody zanieczyszczonej moczem i kałem, która może zwiększyć wzrost grzybów i śmiertelność kleszczy9. Ponadto zwiększa możliwość ucieczki kleszczy z koryta z wodą, a także powoduje stres u myszy. Aby obejść te problemy, demonstrujemy tutaj larwy kleszczy żerujące na myszach w plastikowych jednorazowych klatkach typu pudełko po butach. Ta metoda pozwala na normalne zachowanie myszy, zwiększa regenerację nabrzmiałych kleszczy i zmniejsza śmiertelność kleszczy z powodu zanieczyszczenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół (Numer-00682) opisany poniżej został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Nevada w Reno i jest zgodny z wytycznymi University of Nevada, komisji etyki badań na zwierzętach w Reno. Krótko mówiąc, myszy znieczulono izofluranem, a stożek nosowy był używany do utrzymywania ciągłego poziomu izofluranu przez 20 minut. Stosowano maść weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu oczu pod narkozą. Szczypanie palca u nogi służyło do ustalenia poziomu znieczulenia, a częstość oddechów była mierzona przez cały zabieg. Myszy trzymano w indywidualnych klatkach i monitorowano do czasu odzyskania przytomności. Myszy zostały użyte tylko raz do karmienia kleszczy i zostały poddane eutanazji po wyzdrowieniu kleszczy. Eutanazji dokonał personel Laboratorium Medycyny Zwierzęcej. CO2 i zwichnięcie szyjki macicy były wykorzystywane do eutanazji zwierząt.
UWAGA: Praca na kleszczach wymaga użycia kompletnego sprzętu ochrony osobistej. Do liczenia niedojrzałych kleszczy należy nosić białe fartuchy laboratoryjne, długie rękawice nitrylowe, aby zakryć otwór rękawa fartucha laboratoryjnego przykryty gumowymi opaskami i buty z zakrytymi palcami. Do zarażania myszy kleszczami użyj siatki na włosy, jednorazowych kombinezonów, rękawiczek z długimi rękawami na rękawach i pokrowców na stopy. Użyj białego lub jasnego kombinezonu, aby wykryć krnąbrne kleszcze. Okresowo sprawdzaj rękawice i rękawy pod kątem kleszczy.
1. Przygotowanie pomieszczenia do pomieszczenia dla zwierząt
- Wyznacz osobne pomieszczenie do trzymania myszy zarażonych kleszczami. Umieść lepką matę lub dwustronną taśmę do dywanów na zewnątrz i wewnątrz drzwi, aby zapobiec przypadkowej ucieczce kleszczy.
2. Liczenie kleszczy na czas inwazji myszy
- Umieść dwustronną taśmę wokół górnych krawędzi plastikowego pojemnika o wymiarach 7" x 5" x 14" i napełnij wodą do około 2 cm.
- Umieść kolejne małe pudełko lub szalkę Petriego na środku pojemnika i napełnij wodą do 1 cm, tworząc "fosę" wokół tego pojemnika
- Przechowywać fiolkę zawierającą larwy lub nimfy wewnątrz szalki Petriego.
- Użyj cienkiego pędzla, aby usunąć larwy lub nimfy z fiolki i policz pod mikroskopem. Policz 50 larw lub 25 nimf do oddzielnych fiolek scyntylacyjnych. Fiolki należy natychmiast przykryć siatką nylonową lub siatką z organdy i zamknąć gumkami.
3. Atakowanie myszy niedojrzałymi kleszczami
- Użyj białego lub jasnego stołu roboczego i przyklej taśmę dwustronną na obwodzie obszaru roboczego.
- Znieczulij mysz izofluranem. Sprawdź poziom znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi. Po znieczuleniu przenieś mysz na poduszkę grzewczą pokrytą ręcznikami papierowymi i przymocuj do stożka nosowego, aby zapewnić ciągłe dostarczanie izofluranu.
- Zastosuj maść do oczu na bazie wazeliny, aby uniknąć wysuszenia. Zwróć uwagę na wzorzec oddychania myszy, aby dostosować poziom izofluranu (80 - 230 oddechów na minutę jest normalne., Zmniejsz poziom izofluranu, jeśli częstość oddechów jest mniejsza niż 80 oddechów na minutę, aby uniknąć zabicia zwierzęcia).
- Weź jedną fiolkę z 50 larwami lub 25 nimfami i umieść kleszcze pod futrem na głowie między uszami za pomocą pędzla (ryc. 1). Trzymaj mysz pod narkozą przez 20 minut po umieszczeniu, aby dać wystarczająco dużo czasu na przyczepienie się kleszczy.
- Przenieś mysz do standardowej, plastikowej jednorazowej klatki na mysz typu pudełko po butach ze statycznymi pokrywkami i białą pościelą. Zapewnij zabawki, wodę i jedzenie ad libitum zgodnie z normalną pielęgnacją myszy.
- Przechowuj klatkę dla myszy w większej klatce dla szczurów lub myszoskoczków wyłożonej dwustronną taśmą klejącą wokół górnych krawędzi. Napełnij zewnętrzną klatkę 3 cm wody (Rysunek 2).
4. Zbieranie kleszczy od myszy
- Niedojrzałe kleszcze odrywają się między 3 a 6 dniem karmienia. Sprawdzaj klatki i fosę wodną pod kątem nabrzmiałych kleszczy codziennie po 3 dniu.
- Zbierz oderwane kleszcze z klatki między 4 a 6 dniem. Użyj pędzla lub miękkich kleszczy do zbierania nabrzmiałych kleszczy i przechowuj w czystych fiolkach scyntylacyjnych przykrytych nylonową siatką zabezpieczoną gumowymi opaskami.
- Znieczul i sprawdź mysz w dniu 7 pod kątem pozostałych przyczepionych kleszczy.
- Sprawdź ściółkę, koryto z jedzeniem i butelkę z wodą pod kątem nabrzmiałych kleszczy 7 dnia. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Autoklaw jednorazowych klatek, ściółki, butelki z wodą i koryta z jedzeniem, aby uniknąć ucieczki niekarmionych kleszczy.
5. Przechowywanie kleszczy Fed
- Utrzymuj nabrzmiałe kleszcze w wilgotności 90%, 20 °C i cyklu 12:12 światło: ciemność w inkubatorze o kontrolowanej wilgotności i temperaturze, aż do wystąpienia linienia. Może to potrwać około 12 do 18 tygodni.
- Podczas gdy wysoka wilgotność sprzyja przetrwaniu kleszczy, sprawia również, że kleszcze są podatne na przerost grzybów. Przynajmniej raz w tygodniu sprawdzaj karmione kleszcze pod mikroskopem pod kątem pleśni. W przypadku wykrycia należy umyć ocalałych w 70% etanolu przez 5 minut, spłukać w wodzie, przenieść na bibułę filtracyjną do wyschnięcia i przenieść do nowych, czystych fiolek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły hodowli kleszczy6,10 w celu poprawy wydajności żerowania i zmniejszenia stresu u myszy będących żywicielami. Wyniki pokazują, że standardowe klatki dla myszy w formie pudełek są dobrze dostosowane do hodowli kleszczy. Biała ściółka zapewniła dobry kontrast, co ułatwiło zbieranie najadłych kleszczy. Większość kleszczy po żerowaniu wspięła się na ścianki pojemników, co ułatwiło ich odłów. Ponadt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe kroki w ramach protokołu
Ważne jest, aby podczas hodowli kleszczy zachować kilka poziomów środków bezpieczeństwa, aby uniknąć przypadkowej ucieczki. Użycie taśmy klejącej i fosy wodnej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia bezpieczeństwa. Ważne jest, aby trzymać znieczuloną mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać stałą temperaturę ciała. Odkryliśmy również, że golenie myszy nie zapewnia żadnych dodatkowych korzyści w przypadku przyczepiania kleszczy. Pojedyncza mysz może być trzymana w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za pomoc ze strony personelu Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM otrzymało dofinansowanie od Nevada INBRE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Maść weterynaryjna Puralube | Amazon | Dostępne w każdym sklepie zoologicznym lub sklepie internetowym | |
| Jednorazowa klatka na myszy | Innovive, San Diego, Kalifornia | MV 2 | Zestaw dna i pokrywy |
| Biały Alpha dri pościel | Zaopatrzenie laboratorium, Fort Worth, Teksas | ALPHA-Dri&handel; |
Bibliografia
- Gleim, E. R., et al. Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA. Parasites & Vectors. 9 (125), Available from: http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6 1-13 (2016).
- Krober, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
- Kuhnert, F. Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides. ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).
- Voigt, W. P., et al. In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium. Parasitol. 107, 257-263 (1993).
- Gregson, J. D. Ticks. Insect Colonization and Mass Production. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. 2, Oxford University Press. New York. (1993).
- Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).
- Schumaker, T. S., Barros, D. M. Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory. J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).
- Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).
- James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
