Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Papier jest powszechnie dostępny w różnych formułach lub gatunkach, może być funkcjonalizowany w celu dostrojenia swoich właściwości i może transportować płyny autonomicznie poprzez działanie kapilarne lub odprowadzanie wilgoci. Jeśli papier jest pokryty substancją hydrofobową (np. photoresist¹ lub wax²), przepuszczalność płynów może być kontrolowana przestrzennie w obrębie warstwy papieru. Na przykład nałożona próbka wodna może być kierowana do wielu różnych stref w celu reakcji z odczynnikami chemicznymi i biochemicznymi przechowywanymi w papierze. Wykazano, że te papierowe urządzenia mikroprzepływowe są użyteczną platformą do opracowywania przenośnych i niedrogich testów analitycznych^3,4,5,6,7. Zastosowania urządzeń mikroprzepływowych opartych na dokumentach papierowych obejmują diagnostykę w miejscu opieki nad pacjentem⁸, monitorowanie zanieczyszczeń środowiska⁹, wykrywanie podrabianych leków¹⁰ oraz zdecentralizowaną opiekę zdrowotną (lub "telemedycynę") w ustawieniach ograniczonych zasobów¹¹.

Wiele warstw wzorzystego papieru można połączyć w zintegrowane urządzenie, gdzie strefy hydrofilowe z sąsiednich warstw (tj. powyżej lub poniżej) łączą się, tworząc ciągłe sieci płynów, których wloty i wyloty mogą być sprzężone lub pozostawione niezależne. ¹² Każda warstwa może zawierać unikalny wzór, który umożliwia przestrzenne rozdzielanie odczynników i wykonywanie wielu testów na jednym urządzeniu. Powstałe w ten sposób trójwymiarowe urządzenie mikroprzepływowe jest nie tylko zdolne do odprowadzania płynów, aby umożliwić testy analityczne (np. testy czynnościowe wątroby¹³ i elektrochemiczne wykrywanie małych cząsteczek¹⁴), ale może również obsługiwać wiele zaawansowanych funkcji (np. zawory¹⁵ i proste maszyny¹⁶) wspólne dla tradycyjnych podejść mikroprzepływowych. Co ważne, ponieważ papier odprowadza płyny poprzez działanie kapilarne, urządzenia te mogą być obsługiwane przy minimalnym wysiłku ze strony użytkownika.

Ponieważ odczynniki mogą być przechowywane w trójwymiarowej architekturze urządzenia opartego na papierze, skomplikowane protokoły mogą być zredukowane do pojedynczego dodania próbki wodnej do urządzenia. Niedawno wprowadziliśmy ogólną trójwymiarową architekturę urządzenia, która może być wykorzystana do opracowania testów immunologicznych na bazie papieru przy użyciu techniki druku woskowego do tworzenia wzorzystych warstw. ^17,18 Badania te koncentrowały się na tym, w jaki sposób aspekty związane z konstrukcją urządzenia - liczba użytych warstw, skład warstw i wzór trójwymiarowej sieci mikroprzepływowej - kontrolowały ogólną wydajność testu immunologicznego. Ostatecznie udało nam się wykorzystać te zasady projektowania, aby ułatwić szybki rozwój multipleksowanego testu immunologicznego¹⁹. W tym manuskrypcie wcześniej opracowany test immunologiczny dla ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG; hormon ciążowy)¹⁷ jest używany jako przykład ilustrujący strategie, które opracowaliśmy dla montażu i produkcji trójwymiarowych testów immunologicznych opartych na papierze. W związku z tym skupiamy się na montażu i obsłudze urządzenia, a nie na opracowywaniu testu.

W teście immunologicznym typu sandwich, który jest formatem używanym do wykrywania hCG, przeciwciało wychwytujące specyficzne dla jednej podjednostki hormonu jest powlekane na stałym substracie, który jest następnie blokowany w celu ograniczenia niespecyficznej adsorpcji próbki lub jakiegokolwiek kolejnego odczynnika. Substratem tym jest najczęściej polistyrenowa płytka mikrodołkowa (np. do testu immunoenzymatycznego lub ELISA). Próbkę dodaje się następnie do studzienki i pozostawia do inkubacji przez pewien czas. Po dokładnym przemyciu dodaje się przeciwciało specyficzne dla drugiej podjednostki hCG i pozostawia do inkubacji. To przeciwciało detekcyjne może być sprzężone z cząstką koloidalną, enzymem lub fluoroforem w celu wytworzenia mierzalnego sygnału. Studzienka jest ponownie myta przed interpretacją wyników testu (np. za pomocą czytnika płytek). Podczas gdy zestawy komercyjne opierają się na tym czasochłonnym, wieloetapowym procesie, wszystkie te kroki można szybko wykonać w papierowych urządzeniach mikroprzepływowych przy minimalnej interwencji użytkownika.

Urządzenie używane do testu immunologicznego hCG składa się z sześciu aktywnych warstw, które są, od góry do dołu, używane do dodawania próbki, przechowywania koniugatu, inkubacji, wychwytywania, mycia i osuszania (Rysunek 1). Warstwa dodawania próbki jest wykonana z jakościowej bibuły filtracyjnej. Ułatwia wprowadzenie próbki ciekłej i zabezpiecza odczynniki w warstwie sprzężonej przed zanieczyszczeniem z otoczenia lub przypadkowym kontaktem ze strony użytkownika. Warstwa sprzężona (jakościowa bibuła filtracyjna) zawiera odczynnik wytwarzający kolor (np. przeciwciało znakowane złotem koloidalnym) do testu immunologicznego. Warstwa inkubacyjna (jakościowa bibuła filtracyjna) umożliwia próbce przemieszczanie się poprzecznie w płaszczyźnie bibuły, aby ułatwić wiązanie analitu z odczynnikami przed dotarciem do następnej warstwy, warstwy wychwytującej. Warstwa wychwytująca (membrana nylonowa) zawiera ligandy specyficzne dla analitu zaadsorbowanego w materiale. Po zakończeniu testu warstwa ta zostaje odsłonięta, aby umożliwić wizualizację gotowego immunokompleksu. Warstwa płucząca (jakościowa bibuła filtracyjna) wciąga nadmiar płynów, w tym wolne odczynniki sprzężone, z powierzchni warstwy wychwytującej do warstwy blot (gruba bibuła chromatograficzna). Sześciowarstwowe urządzenie jest utrzymywane razem przez pięć warstw wzorzystego, dwustronnego kleju: cztery warstwy trwałego kleju utrzymują integralność zmontowanego urządzenia, a jedna warstwa usuwalnego kleju ułatwia odklejanie się urządzenia w celu sprawdzenia wyników testu immunologicznego na warstwie wychwytującej.

Na potrzeby tego manuskryptu, używamy tylko negatywnych i pozytywnych próbek kontrolnych hCG (odpowiednio 0 mIU/ml i 81 mIU/mL), aby dostarczyć reprezentatywne wyniki papierowego testu immunologicznego, co pozwala na dedykowaną dyskusję na temat związku między metodami produkcji a wydajnością urządzenia. Oprócz pokazania, jak skutecznie wytwarzać urządzenia, zwracamy uwagę na kilka błędów produkcyjnych, które mogą prowadzić do awarii urządzenia lub nieodtwarzalnych wyników testów. Protokół i dyskusja szczegółowo opisane w tym manuskrypcie dostarczą naukowcom cennych informacji na temat tego, jak projektowane i wytwarzane są papierowe testy immunologiczne. Chociaż koncentrujemy się na testach immunologicznych, przewidujemy, że przedstawione tutaj wytyczne będą szeroko przydatne w produkcji trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru.

1. Przygotowanie warstw urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru

1. Przygotuj wzory warstw papieru, nylonu i kleju za pomocą programu do projektowania graficznego. ⁶ Każda warstwa może mieć inny wzór.
   UWAGA: Wzór może zawierać otwory wyrównujące, które nie są wymagane do funkcjonalnego testu immunologicznego opartego na papierze, ale pomagają w powtarzalnym wytwarzaniu urządzeń trójwymiarowych. Rozmieszczenie tych otworów będzie się różnić, jeśli urządzenia są montowane pojedynczo, w paskach lub jako pełne arkusze. Program używany do projektowania wzorów może się różnić w zależności od wybranej techniki tworzenia wzorów (np. fotolitografia, druk woskowy lub cięcie). ⁶
2. Spryskaj obszar roboczy roztworem 70% (v/v) etanolu i wody. Wytrzyj obszar roboczy czystym ręcznikiem papierowym.

2. Przygotowanie warstw papieru: dodawanie próbek, przechowywanie koniugatu, inkubacja i warstwy myjące

1. Przygotuj warstwy wysokiej jakości bibuły filtracyjnej za pomocą dużego noża do papieru stołowego. Wytnij standardowy arkusz papieru na papier o standardowym rozmiarze, aby ułatwić tworzenie wzorów za pomocą drukarki na stały atrament (wosk). Na przykład z jednego arkusza o wymiarach 460 x 570 mm² można uzyskać 4 arkusze papieru US Letter (8,5 x 11 cali²). Z papierem należy zawsze obchodzić się w czystych rękawicach, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
2. Załaduj wycięty arkusz papieru chromatograficznego do tacy drukarki. Wydrukuj wcześniej zaprojektowane warstwy (patrz rysunek 1).
   UWAGA: Wzór można wydrukować bezpośrednio na tym arkuszu za pomocą automatycznego podawania. Aby uniknąć zacięć papieru, należy drukować tylko jeden arkusz papieru na raz. W przypadku wszystkich warstw użyj ustawień drukowania "Ulepszone".

3. Przygotowanie warstwy membrany nylonowej: Warstwa przechwytująca

1. Pokrój rolkę membrany nylonowej na arkusze (7.5 x 10 cali²) za pomocą stołowego noża do papieru. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z nylonową membraną, aby zachować jej integralność i chronić przed rozerwaniem. Niewykorzystany materiał należy przechowywać w szafie eksykatora, ponieważ membrany nylonowe są wrażliwe na wilgoć.
   UWAGA: Arkusze cięte są węższe niż papier US Letter. Ponieważ membrany nylonowe są cienkie i delikatne, nie mogą być przetwarzane bezpośrednio przez drukarkę i wymagają wsparcia. Szczegóły omówiono poniżej.
2. Za pomocą drukarki woskowej wydrukuj wzór warstwy przechwytywania na kawałku papieru do kopiowania i przyklej go do kasetonu świetlnego, aby służył jako przewodnik do pozycjonowania nylonowej membrany. Kaseton świetlny pomaga w wyrównaniu wielu warstw.
3. Umieść czysty arkusz papieru do kopiowania na poprzednio wydrukowanym arkuszu papieru do kopiowania. Przyklej czystą kartkę papieru do kasetonu, ale nie sklejaj ze sobą dwóch arkuszy.
4. Umieść wycięty arkusz nylonowej membrany na czystym kawałku papieru do kopiowania. Upewnij się, że membrana zakrywa obszar wydruku dolnej warstwy papieru do kopiowania. Przyklej wszystkie cztery strony nylonowej membrany do czystego arkusza papieru do kopiowania.
   UWAGA: Upewnij się, że nylonowa membrana jest płaska i gładka, aby nie było problemów z drukowaniem (np. zacięcia papieru lub nierównomierne drukowanie wosku). Wosk może być drukowany na taśmie, na której membrana nylonowa jest przymocowana do papieru do kopiowania. W takim przypadku obszary, w których nylon nie jest w pełni wzorzysty z powodu pokrycia taśmą, należy wyrzucić. Do przyszłych przygotowań można użyć większych kawałków membrany nylonowej, aby uniknąć tego błędu drukowania.
5. Załaduj arkusz nylonowej membrany (podparty przymocowanym do niej papierem do kopiowania) do tacy drukarki podawanej ręcznie. Drukuj tylko jeden arkusz membrany nylonowej na raz.
   UWAGA: Nie są wymagane żadne czynności przygotowawcze dla warstwy kleksów, ponieważ nie jest ona wzorzysta.

4. Tworzenie barier hydrofobowych w warstwie drukowanej

1. Przyklej wydrukowane warstwy do akrylowej ramy, aby równomiernie podgrzać nad i pod warstwą po umieszczeniu w grawitacyjnym piecu konwekcyjnym. Nylonową membranę należy przykleić taśmą do arkusza nośnego papieru do kopiowania, aż wosk się stopi i utworzą się bariery hydrofobowe.
   UWAGA: Rama akrylowa to wykonany, wycinany laserowo kawałek tworzywa akrylowego o grubości 1/2 ". Zastosowano dwa rozmiary ram w zależności od ilości produkowanych urządzeń. Zewnętrzna krawędź mniejszej ramy ma wymiary 11 5/8" x 2 3/4", a wewnętrzny otwór ramy ma wymiary 10 3/8" x 1 3/4". Zewnętrzna krawędź większej ramy ma wymiary 11 5/8" x 8 7/8", a wewnętrzny otwór ramy ma wymiary 10 1/4" x 7 7/8". Otwarta, wewnętrzna przestrzeń pozwala na równomierne roztopienie wosku na całej grubości papieru.
2. Umieść warstwy w piekarniku w temperaturze 150 °C na 30 sekund, aż wosk rozpuści się w grubości papieru. Upewnij się, że wosk przeniknął przez grubość papieru, odwracając go i sprawdzając, czy w projekcie nie ma niedoskonałości.
   UWAGA: Piekarniki z wymuszonym obiegiem powietrza lub płyty grzejne mogą być również używane do topienia stałego atramentu woskowego. Czas topnienia lub temperatury mogą się różnić w zależności od metody ogrzewania.
3. Usuń papierową i nylonową membranę z ramy akrylowej. Usuń również nylonową membranę z arkusza nośnego papieru do kopiowania.

5. Przygotowanie warstw adhezyjnych

1. Wzorzec dwustronnych arkuszy folii samoprzylepnych za pomocą zrobotyzowanego plotera nożowego, korzystając z przygotowanych wcześniej plików projektowych (krok 1.1). Zabezpiecz odsłoniętą powierzchnię klejącą za pomocą arkusza woskowej wkładki.
   UWAGA: Dwustronny klej powinien być ozdobiony otworami, które umożliwiają przepływ próbki przez warstwy jako ciągłą ścieżkę płynną. Woskowy pas ochronny jest łatwy do usunięcia z kleju i służy do ochrony go przed zanieczyszczeniem i rozdarciem podczas cięcia. Wycinarka laserowa lub prasa matrycowa mogą być również używane do modelowania warstw folii samoprzylepnych.

6. Podkład warstw urządzenia za pomocą kleju

1. Spryskaj kaseton świetlny roztworem 70% (v/v) etanolu i wody. Wytrzyj czystym ręcznikiem papierowym.
2. Przyklej wzorzystą warstwę papieru lub nylonowej membrany, którą należy przykleić do kasetonu świetlnego zadrukowaną stroną do dołu.
3. Oderwij jedną stronę wkładki ochronnej od wzorzystego arkusza kleju i przymocuj ją do warstwy papieru lub membrany nylonowej. Użyj kasetonu świetlnego, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie wzorów. Ściśnij razem. Umieść częściowo zmontowane urządzenie w szlafroku ochronnym.
   UWAGA: Poślizg ochronny to zagięty kawałek podkładu z folii do laminowania, który chroni urządzenia przed zanieczyszczeniem lub uszkodzeniem, zapewniając, że nie stykają się one z rolkami laminatora.
4. Przepuść powstały dwuwarstwowy zespół przez automatyczny laminator, aby całkowicie docisnąć klej i papier do siebie, usuwając wszelkie kieszenie powietrza z przylegających warstw.
   UWAGA: Kieszenie powietrzne między warstwami urządzenia mogą zakłócać integralność urządzenia i odtwarzalność odprowadzania wilgoci, powodując nieszczelności.

7. Traktowanie warstwy sprzężonej odczynnikami do testów immunologicznych przed montażem urządzenia

1. Przyklej warstwę sprzężoną do ramy akrylowej w taki sposób, aby strefa hydrofilowa, która ma być poddana zabiegowi, była zawieszona i nie stykała się z ramą.
2. Dodać 2,5 μl 100 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do strefy hydrofilowej na warstwie sprzężonej. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
   UWAGA: Ta objętość wystarcza tylko do zwilżenia strefy papieru. Rozwiązanie BSA pomaga zapobiegać agregacji nanocząstek koloidalnych podczas procesu suszenia, co ułatwi uwalnianie nanocząstek, gdy papier i odczynniki są ponownie uwodnione przez próbkę.
3. Dodać 5 μl koloidalnej nanocząstki złota 5 O.D. sprzężonej z przeciwciałem anty-β-hCG i powtórzyć proces suszenia.
   UWAGA: Jednostki stężenia koloidalnych nanocząstek złota są często wyrażane jako gęstość optyczna (O.D.) mierzona przez absorbancję przy λ = 540 nm. Nie jest wymagana żadna obróbka podkładki przed montażem urządzenia w rozdziale 10.

8. Leczenie kanału bocznego odczynnikiem do testów immunologicznych przed montażem urządzenia

1. Przyklej boczną warstwę kanału do ramy akrylowej tak, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą.
2. Dodać 10 μl środka blokującego (5 mg/ml mleka beztłuszczowego i 0,1% (v/v) Tween 20 w 1x PBS) w celu leczenia kanału bocznego. Powtórzyć ten sam proces suszenia (2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie w temperaturze 65 °C przez 5 minut) jako warstwę sprzężoną.

9. Traktowanie warstwy wychwytującej odczynnikami do testów immunologicznych przed montażem urządzenia

1. Warstwa wychwytywania taśmy na ramie akrylowej w taki sposób, aby strefa hydrofilowa, która ma być leczona, była zawieszona i nie stykała się z ramą.
2. Warstwę wychwytującą należy poddać działaniu 5 μl przeciwciała anty-α-hCG o stężeniu 1 mg/ml, a następnie pozostawić próbkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie przez 8 minut w temperaturze 65 °C.
3. Dodać 2 μl środka blokującego (5 mg/ml mleka beztłuszczowego i 0,1% (v/v) Tween 20 w 1x PBS). Powtórz proces suszenia warstwy wychwytującej.
   UWAGA: Ta ilość jest odpowiednia do powlekania papierów bez zasłaniania porów membrany nylonowej, co może się zdarzyć, gdy zostanie użyta zbyt duża ilość środka blokującego.

10. Montaż trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru

1. Przyklej warstwę prania do kasety świetlnej (zadrukowaną stroną skierowaną do góry). Jeśli używane są otwory wyrównujące, usuń je z kolejnych warstw za pomocą ręcznego narzędzia do dziurkowania.
2. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy wychwytującej, aby odsłonić klej. Wyrównaj warstwę wychwytywania nad warstwą zmywającą, używając otworów wyrównujących jako prowadnicy. Dociśnij obie warstwy do siebie. Unikaj dotykania stref hydrofilowych, aby zminimalizować zanieczyszczenie lub uszkodzenie urządzenia. Do pomocy w montażu można użyć pęsety.
3. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy inkubacyjnej, aby odsłonić klej. Wyrównaj warstwę inkubacji nad warstwą wychwytywania i ściśnij je razem. Kontynuuj dodawanie warstw w ten sposób, aż wszystkie aktywne warstwy zostaną złożone.
4. Umieść częściowo zmontowane urządzenie w szkiełku ochronnym i mocno przymocuj warstwy do siebie za pomocą laminatora.
5. Usuń folię ochronną z tyłu warstwy myjącej i przymocuj warstwę blot do dolnej części urządzenia. Powtórzyć krok laminowania 10.4, aby zakończyć montaż trójwymiarowego urządzenia mikroprzepływowego na bazie papieru. Wytnij żądaną liczbę urządzeń z pasków lub arkuszy w pełni zmontowanych urządzeń za pomocą nożyczek.
   UWAGA: Przy użyciu podobnego podejścia można przygotować pełne arkusze urządzeń, paski urządzeń lub pojedyncze urządzenia.

11. Przeprowadzanie testu immunologicznego na papierze

1. Dodać 20 μl próbki do strefy hydrofilowej znajdującej się na górze urządzenia (tj. warstwy próbki).
2. Poczekaj, aż próbka całkowicie wsiąknie do urządzenia, a następnie dodaj 15 μl buforu do przemywania (0,05% v/v Tween 20 w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Po całkowitym wchłonięciu pierwszej porcji buforu do płukania do urządzenia, dodać drugą 15 μl porcji buforu do płukania.
   UWAGA: Bufor płuczący całkowicie wsiąkł do urządzenia, gdy kropla płynu zniknęła, nie widać menisku na powierzchni papieru. Oznaczenie uznaje się za zakończone, gdy druga podwielokrotność buforu do przemywania całkowicie dostanie się do urządzenia.
3. Aby ujawnić wyniki testu, oderwij trzy górne warstwy urządzenia za pomocą pęsety, aby odsłonić warstwę wychwytywania.
   1. Zinterpretuj wyniki testu jakościowo, obserwując obecność lub brak koloru. Alternatywnie, można zobrazować warstwę odczytu za pomocą skanera biurkowego i użyć oprogramowania lub algorytmów do przetwarzania obrazu w celu ilościowego określenia wyników i scharakteryzowania rozkładu intensywności w strefie wykrywania. ²⁰

Uzyskanie powtarzalnych wyników testów w trójwymiarowych urządzeniach mikroprzepływowych opartych na papierze opiera się na metodzie wytwarzania, która zapewnia spójność między urządzeniami. Aby osiągnąć ten cel, zidentyfikowaliśmy szereg procesów produkcyjnych i kwestii materiałowych i omawiamy je tutaj w kontekście demonstracji testu immunologicznego opartego na papierze. Stosujemy metodę druku woskowego do tworzenia barier hydrofobowych w urządzeniach mikroprzepływowych na bazie papieru (rysunek 2A). 2 Ta metoda jest idealna, ponieważ opiera się tylko na powszechnie dostępnym sprzęcie biurowym, wymaga minimalnych kroków proceduralnych do wykonania i nie wymaga użycia chemikaliów (np. fotorezystu), które mogłyby zakłócać adsorpcję białek lub zmieniać zwilżalność włókien papieru. Co więcej, druk woskowy wytwarza ścieżki płynowe o powtarzalnych wymiarach, co ma kluczowe znaczenie dla testów o powtarzalnych parametrach i czasie trwania. Po uformowaniu barier hydrofobowych na warstwy nakładane są arkusze kleju, które ułatwiają montaż urządzeń trójwymiarowych (rys. 2B). Wszelkie odczynniki wymagane do przeprowadzenia testu immunologicznego można nałożyć po dodaniu warstwy adhezyjnej na tylną stronę warstwy (ryc. 2C). Ta procedura jest przydatna w przypadku procesów produkcyjnych w laboratorium akademickim, ponieważ wiele urządzeń można przygotować równolegle. Proces montażu urządzenia do testów immunologicznych jest zakończony po ułożeniu wszystkich warstw urządzenia w stos i zalaminowaniu razem (rysunek 2D). Dodajemy próbkę, aby rozpocząć test. W tym przykładzie używamy zestawu do kontroli moczu do testów ciążowych, który zawiera ujemne i dodatnie próbki hCG w buforze, jako próbki demonstrujące działanie naszych urządzeń i odtwarzalność testów wykonanych za ich pomocą. Następnie kolejno dodaje się dwie porcje buforu do płukania. Gdy ostatnia podwielokrotność buforu płuczącego całkowicie dostanie się do urządzenia, test uważa się za zakończony. Trzy górne warstwy są następnie odklejane, aby odsłonić warstwę przechwytywania (rysunek 3A). Ten krok nieodwracalnie uszkadza urządzenie, uniemożliwiając jego ponowne użycie. Przeprowadzenie testu immunologicznego w formie papierowej skutkuje jakościowym odczytem koloru, który może wskazywać na ujemny lub dodatni wynik po oględzinach. Obiektywność tych wyników jest widoczna w nieskorygowanych obrazach uzyskanych za pomocą skanera płaskiego (ryc. 3B).

Nieudane eksperymenty często mogą uwypuklić pewne kroki proceduralne, których znaczenie może być niezauważalne w inny sposób, gdy analiza eksperymentu koncentruje się na udanych wynikach. Wykazujemy trzy błędy w produkcji i montażu trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru, które skutkują awariami testu immunologicznego: (i) Czasami awarie urządzenia nie są widoczne, dopóki test nie zostanie zakończony. Na przykład niewspółosiowość między warstwami składającymi się na kanał inkubacyjny i strefę przechwytywania może spowodować powstanie nieregularnego wzoru w sygnale dodatnim, co może skutkować błędną interpretacją sygnału jakościowego przez użytkownika (rysunek 4A). (ii) Jeżeli wosk nie zostanie zadrukowany w wystarczającej ilości lub nie zostanie dopuszczony do całkowitego stopienia na całej grubości papieru, wówczas integralność powstałych barier hydrofobowych może być zagrożona. Niepełne uformowanie tych barier spowoduje utratę kontroli nad odprowadzaniem wilgoci i doprowadzi do nieszczelności wewnątrz urządzenia. Na przykład, zamiast ograniczać przepływ do kanału w warstwie, półprzepuszczalna bariera woskowa pozwoli płynowi na odprowadzanie wody w inne miejsce w płaszczyźnie papieru. Bez zdefiniowanych kanałów jest mało prawdopodobne, aby próbka dotarła do warstw wychwytujących lub płuczących. Użytkownik będzie postrzegał ten rodzaj błędu jako znacznie skrócony czas trwania testu. Demonstrujemy tę awarię urządzenia, nakładając roztwór czerwonego barwnika spożywczego na warstwę, której wzór wosku nie mógł się stopić przez pełne 30 sekund (Rysunek 4B). Test immunologiczny z użyciem takiej warstwy został "zakończony" w ciągu 6 minut, co wyraźnie różni się od oczekiwanego czasu trwania wynoszącego 15 minut. (iii) Testy, które trwają dłużej niż oczekiwano, mogą wskazywać na nieprawidłowe działanie w produkcji urządzenia. Na przykład niewłaściwie przycięte spoiwo lub zasłonięte pory spowodowane zastosowaniem nadmiernej ilości odczynników (np. środków blokujących lub złota koloidalnego) może uniemożliwić przedostanie się próbki lub buforu płuczącego do wnętrza urządzenia (rysunek 4C).

Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół produkcyjny jest przydatny do równoległego wytwarzania wielu papierowych urządzeń mikroprzepływowych na skalę, która jest przydatna dla laboratorium akademickiego. Wykazujemy działanie papierowego testu immunologicznego hCG przygotowanego tą metodą, wykonując równolegle 70 testów: 35 ujemnych powtórzeń i 35 dodatnich powtórzeń. Na potrzeby tej demonstracji przygotowaliśmy zestaw warstw z projektami naszego urządzenia, przykleiliśmy warstwy papieru za pomocą kleju, a następnie pocięliśmy arkusze na rzędy urządzeń. Każdy arkusz został pocięty na 7 rzędów, w których znajdowało się dziesięć urządzeń. Ułatwiło to ułożenie warstw na mniejszych akrylowych ramach, na których warstwy są przyklejane taśmą, a następnie poddawane działaniu odczynników potrzebnych do przeprowadzenia testów. Ten sposób przygotowania urządzenia jest sugerowany w notatce w protokole. Po obróbce warstw urządzenia zostały zmontowane w paski po dziesięć, a następnie zalaminowane. Po zakończeniu końcowych etapów produkcji urządzenia, urządzenia pozostały w paskach po dziesięć, a próbka została dodana do każdego urządzenia. Zaobserwowaliśmy 0% wskaźnik awaryjności dla urządzeń wytworzonych przy użyciu naszego protokołu. Użyliśmy oprogramowania do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym20, aby określić ilościowo wyniki tych testów. Chociaż dostępnych jest wiele metod analizy rozkładu intensywności w punktach kołowych (np. rozkłady radialne lub liniowe)21 mierzymy średnią intensywność z zielonego kanału obrazu RGB urządzenia, używając całego miejsca detekcji jako obszaru zainteresowania. 17,18,19 Następnie normalizujemy pomiary zarówno pozytywnych, jak i ujemnych testów, odejmując surowe dane ujemne (Rysunek 3B). Określiliśmy współczynnik zmienności dla każdego zestawu danych na 1% dla testów przeprowadzonych przy użyciu próbek ujemnych i 3% dla testów wykonanych przy użyciu próbek dodatnich.

Rysunek 1: Schemat trójwymiarowego urządzenia papierowego. Ta ilustracja przedstawia hydrofobowe i hydrofilowe obszary, które definiują ścieżkę przepływu w urządzeniu, a także wzorzyste warstwy trwałego i usuwalnego kleju, które utrzymują warstwy razem. Każda warstwa jest oznaczona według funkcji, jaką pełni w teście. Czerwony, niebieski lub zielony kontur na każdej warstwie wskazuje materiał użyty do wytworzenia tej konkretnej warstwy (czerwony: bibuła chromatograficzna, niebieski: membrana nylonowa, zielony: gruby papier chromatograficzny). Wymiary są podane dla każdej strefy w urządzeniu w mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Procedura stosowana do wytwarzania testów immunologicznych z trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru. (A) Obrazy przedniej i tylnej strony arkusza bibuły chromatograficznej z wzorem wykonanym przy użyciu nadruku woskowego przed i po podgrzaniu. (B) Arkusz bibuły chromatograficznej pokryty warstwą wzorzystego kleju. (C) Zabiegi stosowane do stref hydrofilowych paska wzorzystej membrany nylonowej. (D) Montaż pasków urządzenia wielowarstwowego za pomocą kasety świetlnej i otworów wyrównujących jako prowadnicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Interpretacja wyników papierowego testu immunologicznego. (A) Trzy górne warstwy urządzenia na bazie papieru są odklejane w celu odsłonięcia warstwy wychwytywania i interpretacji wyników testu. (B) Graficzne przedstawienie działania testu immunologicznego na obecność hCG w wersji papierowej. Przedstawione wyniki są średnimi z 70 powtórzeń wykonanych jednocześnie, z których każdy zawiera 35 powtórzeń dla dodatnich i ujemnych próbek hCG. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe zestawu danych. Nieskorygowane, reprezentatywne obrazy przedstawiające dodatnie (kolor czerwony) i ujemne (kolor biały) wyniki testu immunologicznego hCG są pokazane powyżej odpowiednich danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykłady błędów produkcyjnych. (A) Ze względu na niewspółosiowość kanału bocznego powyżej warstwy wychwytującej, sygnał dodatni jest skoncentrowany na niewielkim obszarze strefy odczytu. Po prawej stronie strefy odczytu można zaobserwować "mokry" obszar kołowy (przerywany kontur) wynikający z kontaktu nieprawidłowo ustawionego kanału bocznego z warstwą przechwytującą (po lewej). Obraz dodatniego odczytu na warstwie przechwytywania prawidłowo wyrównanego urządzenia (po prawej). (B) Niepełne stopienie wosku na całej grubości warstwy może prowadzić do nieszczelności wewnątrz urządzenia. Do roztworu dodano barwniki spożywcze, aby pomóc w wizualizacji próbki w warstwach z niekompletnymi lub w pełni uformowanymi barierami hydrofobowymi. (C) Nieprawidłowo przycięty klej może zablokować sieć płynów między warstwami papieru, co zatrzyma przepływ próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru. Schemat przedstawia montaż i laminowanie wielu warstw wzorzystego papieru w gotowe trójwymiarowe urządzenia. W tym przykładzie można wykonać jednocześnie 70 urządzeń. Warstwy kleju i otworów wyrównujących zostały usunięte ze schematu w celu uproszczenia. Po zmontowaniu poszczególne urządzenia można wyjąć i wykorzystać w testach. Czerwone, niebieskie i zielone kontury na każdej warstwie wskazują materiał użyty do wytworzenia tej konkretnej warstwy (czerwony: bibuła chromatograficzna, niebieski: membrana nylonowa, zielony: gruby papier chromatograficzny). Podziałka = 25 mm z wyjątkiem oddzielnego urządzenia (po prawej), które ma wymiary 12 x 28 mm2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.