Tradycyjne modelowanie częściowej niedrożności ujścia pęcherza moczowego u gryzoni jest obarczone śmiertelnością zwierząt. Poważnym problemem jest również uraz odnerwienia spowodowany rozwarstwieniem wokół bliższej cewki moczowej i szyi pęcherza moczowego. Opracowaliśmy i oceniliśmy bezpieczny i niezawodny model niedrożności środkowej części cewki moczowej, unikając wad tradycyjnego modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oszczędzająca nerwy niedrożność środkowej cewki moczowej (NeMO) u samic małych gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Częściowa niedrożność ujścia pęcherza moczowego (pBOO) jest bardzo częsta, powoduje znaczne obciążenie pacjentów i ogromne koszty opieki zdrowotnej. Najczęstszym modelem zwierzęcym do badania przebudowy pęcherza moczowego w pBOO są samice gryzoni poddawane częściowej niedrożności w bliższej części cewki moczowej. Zmienność stopnia niedrożności i śmiertelność zwierząt są głównymi problemami związanymi z niedrożnością proksymalną. Ponadto preparacja wokół bliższej cewki moczowej i szyi pęcherza moczowego zagraża unerwieniu pęcherza.
Opracowaliśmy model NeMO (oszczędzającej nerwy) niedrożność środkowej cewki moczowej dla pBoo, unikając wad tradycyjnego modelu. Zbliżyliśmy się do cewki moczowej znajdującej się nieco poniżej spojenia łonowego, co wyeliminowało potrzebę laparotomii, a także rozwarstwienia w tym obszarze; Również prążkowany zwieracz cewki moczowej pozostał nietknięty. Przeprowadziliśmy NeMO u samic szczurów Sprague-Dawley (12 przeszkód, 6 zwierząt pozorowanych), a także u samic myszy C57 / bl6 (20 niedrożności, 18 zwierząt pozorowanych). Po dwóch tygodniach oceniliśmy czynność pęcherza, masę pęcherza moczowego i masę ciała.
Nie mieliśmy żadnej śmiertelności wśród samic szczurów operowanych z blokadą lub pozorowanych; zgodnie z opisem dla tradycyjnej metody proksymalnego pBOO, zawiązaliśmy szew wokół bliższej cewki moczowej i tymczasowo umieszczonym metalowym prętem o średnicy 0,9 mm. NeMO wywołało 85% wzrost masy pęcherza moczowego po dwóch tygodniach, średnia resztkowa objętość moczu wynosiła 0,4 ml u częściowo niedrożnych szczurów, podczas gdy tylko 0,03 ml u zwierząt pozorowanych. U myszy przetestowaliśmy 3 rozmiary kaniul, które umieściliśmy wzdłuż cewki moczowej podczas wiązania szwu. Odkryliśmy, że użycie kaniuli o rozmiarze 27 spowodowało ponad 50% śmiertelność zwierząt; Umieszczenie kaniuli o rozmiarze 25 nie dało pożądanej odpowiedzi w postaci zwiększenia masy pęcherza; Zastosowanie kaniuli o rozmiarze 26 przyniosło korzystne wyniki przy minimalnej śmiertelności zwierząt (1/8), ale znacznym 2-krotnym wzroście masy pęcherza.
Wprowadzenie
Częściowa niedrożność ujścia pęcherza moczowego (pBOO) jest często częsta i może prowadzić do poważnych zaburzeń czynności pęcherza1; spektrum waha się od wrodzonych wad rozwojowych, takich jak tylne zastawki cewki moczowej lub spodziectwo, przez nabyte zwężenia cewki moczowej, aż po łagodny przerost gruczołu krokowego. To ostatnie dotyka ponad 30% mężczyzn w wieku sześćdziesięciu lat i starszych2. Duże obciążenie pacjentów i ogromne koszty opieki zdrowotnej związane z pBOO uzasadniają znaczny wysiłek badawczy włożony w badanie przebudowy pęcherza moczowego w odpowiedzi na zwiększony opór odpływu3. W latach 2006-2015 opublikowano ponad 220 artykułów indeksowanych przez PubMed dotyczących wpływu pBOO na pęcherz moczowy.
Chociaż modele zwierzęce dla pBOO zostały opracowane w kilku gatunkach4, takich jak rat5, rabbit6, pig7, oraz mouse8,9, prawdopodobnie najczęściej używanym modelem zwierzęcym są jednak samice szczurów doświadczające częściowej niedrożności bliższej cewki moczowej; dostęp do brzucha zwierząt, eksterioryzacja pęcherza moczowego, oraz Rozwarstwienie wokół szyi pęcherza moczowego jest nieuniknione w przypadku tej tradycyjnej techniki niedrożności bliższej cewki moczowej. Zmienność stopnia niedrożności i śmiertelność zwierząt to tylko niektóre z problemów związanych z tą procedurą10,11; Wykazaliśmy, że u zwierząt operowanych pozorowo rozwarstwienie wokół bliższej cewki moczowej prowadzi do zmian fizjologicznych, które korelują z utratą włókien nerwowych na szyi pęcherza moczowego12. Odkrycie to wskazuje, że najczęściej stosowany model zwierzęcy pBoo, który polega na dostępie do bliższej cewki moczowej u samic gryzoni, prowadzi do uszkodzenia odnerwionego z towarzyszącymi zmianami strukturalnymi i funkcjonalnymi pęcherza moczowego, dotykając zwierzęta pozorowane i z niedrożnością. W związku z tym potrzebne było alternatywne podejście, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych odnerwieniem. Nasze laboratorium opracowało i oceniło metodę NeMO (Nerw-En) EnTrenchation (Nerw w kierunku niedrożności), skuteczną w wywoływaniu oczekiwanych zmian związanych z niedrożnością pęcherza moczowego, takich jak wzrost masy narządowej i resztki moczu, podczas gdy zwierzęta pozorowane były nie do odróżnienia od nieoperowanych zwierząt kontrolnych. Również prążkowany zwieracz cewki moczowej pozostał nietknięty, ponieważ leży proksymalnie do poziomu rozwarstwienia. Ponadto zmienność we wzroście masy pęcherza moczowego wywołanym niedrożnością była znacznie niższa niż w tradycyjnej proksymalnej niedrożności cewki moczowej, a śmiertelność zwierząt wynosiła zero.
Z powodzeniem zastosowaliśmy również NeMO u samic myszy z mniej niż 10% śmiertelnością u zwierząt z blokadą, podczas gdy wszystkie modele pBOO dla myszy opisane do tej pory były związane ze śmiertelnością około 50%. Badanie przebudowy pęcherza moczowego w kontekście pBOO u myszy przyniesie korzyści z możliwości zastosowania całego spektrum modyfikacji transgenicznych.
Sekcja wokół środkowej cewki moczowej u samic gryzoni nie wywołuje niepożądanych i mylących zmian strukturalnych lub funkcjonalnych w pęcherzu moczowym, obserwowanych w tradycyjnym modelu niedrożności proksymalnej. Niemniej jednak wywołanie częściowej niedrożności na poziomie środkowej cewki moczowej nadal wywołuje przerost pęcherza moczowego i zwiększony zalegający mocz, zgodnie z oczekiwaniami na podstawie modelu zwierzęcego pBOO. Co ważne, przeprowadzenie NeMO u myszy otwiera badania nad przebudową pęcherza moczowego w pBOO na metody transgeniczne, które są praktycznie niedostępne u większych gryzoni
.Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Następujący protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez komitet ds. opieki nad zwierzętami instytucji.
1. NeMO u samic szczurów
- preparat
- Samicę szczura Sprague-Dawley o wadze około 200 g należy poddać 3% znieczuleniu izofluranowemu, zważyć zwierzę oraz ogolić i zdezynfekować obszar przedłonowy 3 razy za pomocą jodowego peelingu chirurgicznego.
- Na poduszce grzewczej przyklej tylne kończyny i ogon w dół i cewnikuj pęcherz za pomocą angiocewnika o rozmiarze 20, który jest również delikatnie przyklejony taśmą, aby zapobiec przesuwaniu się.
- Rozwarstwienie
- Za pomocą skalpela należy wykonać podłużne nacięcie skóry o średnicy 8 mm od wyczuwalnego spojenia łonowego w kierunku ujścia cewki moczowej. Zdejmij skórę z obu stron, aby ułatwić późniejsze zamknięcie rany.
- Wypreparuj tępo, aby zidentyfikować stentowaną cewkę moczową poprzez podłużne rozprowadzanie cienkimi nożyczkami. Umieść cienkie, samozatrzymujące się haczyki na skórę, aby zwiększyć ekspozycję cewki moczowej.
- Wykonaj delikatne rozprowadzanie wzdłużne za pomocą zakrzywionych nożyczek grzbietowo do cewki moczowej, aby rozwinąć płaszczyznę między cewką moczową a pochwą. Następnie tępo przełóż jedwabny szew 4-0 za cewką moczową i przygotuj podwójny rzut węzła chirurgicznego.
- Częściowa niedrożność cewki moczowej
- Wyjmij angiocewnik, umieść metalowy pręt o średnicy 0,9 mm równolegle do cewki moczowej, a następnie zaciśnij węzeł wokół cewki moczowej i metalowego pręta, aby ten ostatni nadal łatwo się wysuwał.
- Zabezpiecz węzeł 3 kolejnymi rzutami, delikatnie napinając pręt przed zdjęciem pręta. Odetnij końce szwów o długości około 3 mm lub 4 mm, jeśli późniejsze uwolnienie przeszkody jest częścią eksperymentu.
- Zamykanie ran
- Przybliżyć gruczoły okołocewkowe za pomocą zakopanego pojedynczego szwu wchłanialnego plecionego szwu 4-0.
- Zamknij skórę zakopanym poziomym ściegiem materacowym za pomocą tego samego wchłanialnego szwu. Uwaga: Chociaż stosowanie wchłanialnego szwu do szwu penetrującego skórę może wydawać się niekonwencjonalne, nie napotkaliśmy powikłań, takich jak infekcje ran, a usunięcia szwów można uniknąć.
- Po pielęgnacji
- Buprenorfinę należy wstrzyknąć podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc. przed umieszczeniem szczura w klatce ratunkowej.
- Zaoferuj miękką dietę regeneracyjną przez pierwsze 24 godziny szczurowi trzymanemu samotnie. Po tym okresie zwierzęta trzymane są ponownie w tych samych parach, co przed zabiegiem, pod warunkiem, że czują się dobrze i należą do tej samej grupy leczonej.
- Codziennie sprawdzaj szczury pod kątem wielkości pęcherza moczowego i ogólnego samopoczucia; rejestruj ich wagę co najmniej raz w tygodniu.
2. NeMO u samic myszy
- preparat
- Umieść samicę myszy C57BL/6 o wadze około 18 g i postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.
- Postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.1.2, z wyjątkiem użycia angiocewnika o rozmiarze 24.
- Rozwarstwienie
- Za pomocą skalpela należy wykonać podłużne nacięcie skóry o średnicy 6 mm od wyczuwalnego spojenia łonowego w kierunku ujścia cewki moczowej.
- Wypreparuj tępo, aby zidentyfikować stentowaną cewkę moczową poprzez podłużne rozprowadzanie cienkimi nożyczkami. Podnieś pęczek nerwowo-naczyniowy biegnący brzusznie po cewce moczowej przez analogiczne rozwarstwienie.
- Wykonaj delikatne rozprowadzanie wzdłużne za pomocą zakrzywionych nożyczek grzbietowo do cewki moczowej, aby rozwinąć płaszczyznę między cewką moczową a pochwą. Następnie tępo przełóż niewchłanialny szew pleciony 5-0 za cewkę moczową i przygotuj podwójny rzut węzła chirurgicznego.
- Częściowa niedrożność cewki moczowej
- Połączyć angiocewnik ze strzykawką o pojemności 1 ml i wstrzyknąć 0,1 ml soli fizjologicznej do pęcherza.
- Umieść kaniulę o rozmiarze 26 równolegle do cewki moczowej. Delikatnie zaciśnij węzeł wokół cewki moczowej i kaniuli, jednocześnie odciągając angiocath.
- Zabezpiecz węzeł 3 kolejnymi rzutami, delikatnie napinając przed zdjęciem kaniuli.
- Sprawdzić, czy mocz pojawia się w ujściu przy delikatnym ucisku na pęcherz moczowy zwierzęcia; poluzuj opaskę, jeśli nie jest w stanie odciągnąć moczu. W przeciwnym razie odetnij końce szwów o długości około 3 mm.
- Zamykanie ran
- Zamknij skórę zakopanym poziomym ściegiem materaca za pomocą plecionego szwu wchłanialnego 5-0.
- Po pielęgnacji
- Należy wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny przed umieszczeniem myszy w klatce ratunkowej.
- Zaoferuj miękką dietę regeneracyjną przez pierwsze 48 godzin myszy trzymanej w jednym pomieszczeniu. Po tym okresie zwierzęta trzymane są ponownie w tych samych grupach, co przed zabiegiem, pod warunkiem, że czują się dobrze i należą do tej samej grupy poddawanej zabiegowi.
UWAGA: Myszy z wyczuwalnym palpacyjnie rozszerzonym pęcherzem moczowym 24 godziny po zabiegu, które nie oddają moczu podczas dotykania, są nadmiernie zatkane i umrą w ciągu najbliższych 1-2 dni, chyba że zostaną ponownie podjęte w znieczuleniu w celu usunięcia niedrożnej ligatury. - Codziennie sprawdzaj myszy pod kątem wielkości pęcherza moczowego i ogólnego samopoczucia; rejestruj ich wagę co najmniej raz w tygodniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Oszczędzająca nerwy obstrukcja środkowej części cewki moczowej (NeMO) u samic szczurów
Śmiertelność
Do tej pory przeprowadziliśmy zabieg niedrożności środkowej części cewki moczowej u ponad 40 samic szczurów i nie odnotowaliśmy żadnych zgonów.
Masa pęcherza
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Śmiertelność zwierząt jest jednym z głównych problemów tradycyjnego modelu pBOO w bliższej części cewki moczowej, na poziomie 15% lub więcej w wielu raportach 10,11,13. Wydaje się, że NeMO ma minimalną śmiertelność, gdy jest stosowany u samic szczurów. Niedrożność bliższej cewki moczowej u myszy jest technicznie trudniejsza niż u szczurów, a tym samym jeszcze bardziej podatna na powikłania. Używając kaniuli o ro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca została sfinansowana z grantu operacyjnego CHIR (DJB).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Samica szczura | Charles-River, Kanada | Sprague, Dawley, Szczur (Crl:SD); Kod szczepu: 400 | około 200 g |
| Waporyzator izofloranowy | Benson medical industries inc. | TEC III Izofluran; kod produktu: 53-T3ISO | |
| Isoflorane | Fresenius Kabi Zdrowie zwierząt | Isoflorane; kod produktu CP0406V2 | Butelka 250 ml |
| Jednorazowy skalpel | Ted Pella, Inc. | #15 Sterylne skalpele ze stali nierdzewnej; numer katalogowy 549-9-15S | |
| Kleszczyki do mikroskopów | Ted Pella, Inc. | Kleszczyki do mikroskopii Aesculap, Finepoint, 115mm; numer produktu 5443 | |
| Kleszcze Adson | Ted Pella, Inc. | Kleszcze preparacyjne Aesculap Adson, zakrzywione, 120mm; numer produktu 5002-9 | |
| Zakrzywione nożyczki chirurgiczne | Ted Pella, Inc. | Nożyczki chirurgiczne, zakrzywione, S/S, 105mm; Nr katalogowy 1376 | |
| 0,9 mm pręt metalowy inox | goodfellow.com | Stal nierdzewna - AISI 316L Średnica drutu:0.9mm; Kod zamówienia 911-684-65 | |
| Haczyki do skóry - wykonane samodzielnie ze stali inox | goodfellow.com | Stal nierdzewna - AISI 316L Średnica drutu:0,9mm; kod zamówienia 911-684-65 | |
| 4-0 Nici jedwabne | esutures.com | 4-0 Sofsilk 98" pasmo; numer produktu LS640 | |
| 5-0 Szew Vicry | esutures.com | 5-0 Vicryl niebarwiony 27" RB-1 stożek; numer produktu J213H | |
| Uchwyt igły | Medsupplier.com | Integra Miltex Carb-N-Sert Uchwyt igły Baumgartner - 5 1/2"; kod produktu SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC | |
| Temgesic (Buprenorfina) | pierwszy produkt weterynaryjny | Buprenex 0,3 MG/ml inj amps; pozycja #075701 | |
| Strzykawka 1 ml z igłą 27 G | Fisher Scientific | BD Strzykawka tuberkulinowa, BD 309623 | |
| 20 G Angiocath | Fisher Scientific | Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Nr katalogowy | |
| Dieta regeneracyjna | clearh2o | DietGel 31M; 72-08-5022 | |
| C57Bl/6 samice myszy | Charles-River Canada | C57BL/6 Mysz (C57BL/6NCrI); Kod szczepu: 027 | około 18 g |
| 24 G angiocath | Fisher Scientific | Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Nr katalogowy | |
| 5-0 Ethibond | esutures.com | 5-0 Ethibond zielony 30" RB-1 stożek; numer produktu X550H | |
| Igła strzykawkowa 26 G | Sigma-Aldrich | BD Precisionglide, Gauge 26; z192392 | |
| Sól fizjologiczna | Baxter | 0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, USP, 100 mL MINI-BAG; kod produktu 2B0043 |
Bibliografia
- Andersson, K. E. Storage and voiding symptoms: pathophysiologic aspects. Urology. 62 (5), 3-10 (2003).
- Boyle, P., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms in men and women in four centres. The UrEpik study. BJU Int. 92 (4), 409-414 (2003).
- Coyne, K. S., Wein, A., Nicholson, S., Kvasz, M., Chen, C. I., Milsom, I. Economic burden of urgency urinary incontinence in the United States: a systematic review. J Manag Care Pharm. 20 (2), 130-140 (2014).
- Buttyan, R., Chen, M. W., Levin, R. M. Animal models of bladder outlet obstruction and molecular insights into the basis for the development of bladder dysfunction. Eur. Urol. 32 (Suppl 1), 32-39 (1997).
- Mattiasson, A., Uvelius, B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 128 (6), 1340-1342 (1982).
- Chang, S., et al. Alteration of the PKC-mediated signaling pathway for smooth muscle contraction in obstruction-induced hypertrophy of the urinary bladder. Lab Invest. 89 (7), 823-832 (2009).
- Moore, J. A., Brading, A. F. A porcine model of bladder outlet obstruction incorporating radio-telemetered cystometry. BJU Int. 100 (5), 1192-1193 (2007).
- Beamon, C. R., Mazar, C., Salkini, M. W., Phull, H. S., Comiter, C. V. The effect of sildenafil citrate on bladder outlet obstruction: a mouse model. BJU Inte. 104 (2), 252-256 (2009).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Kang, Y. J., et al. Early Sequential Changes in Bladder Function after Partial Bladder Outlet Obstruction in Awake Sprague-Dawley Rats: Focus on the Decompensated Bladder. Korean J Urol. 52 (12), 835-837 (2011).
- Schroeder, A., et al. Protective effect of an oral endothelin converting enzyme inhibitor on rat detrusor function after outlet obstruction. J Urol. 172 (3), 1171-1174 (2004).
- Sidler, M., Aitken, K., Jiang, J., Bijos, D., Bägli, D. "sometimes a sham is just a sham" - why the rodent model of partial bladder outlet obstruction needs adjustment. J Urol. 195 (4), e379(2016).
- Jin, L. H., et al. Persistent detrusor overactivity in rats after relief of partial urethral obstruction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (4), R896-R904 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
