Artykuł metodologiczny

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

14.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55292

⸱

23 lutego 2017

 ,  ,  ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

W tym artykule

Podsumowanie

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Streszczenie

Ten artykuł opisuje urządzenie mikroprzepływowe wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) z wbudowaną cienką warstwą poliwęglanu (PC) do badania migracji komórek w kombinacjach gradientów chemicznych i tlenowych. Zarówno gradienty chemiczne, jak i tlenu mogą znacznie wpływać na migrację komórek in vivo; Jednak ze względu na ograniczenia techniczne przeprowadzono bardzo niewiele badań w celu zbadania ich skutków in vitro. Urządzenie opracowane w ramach tych badań wykorzystuje szereg kanałów w kształcie serpentyny do generowania pożądanych gradientów chemicznych i wykorzystuje przestrzennie ograniczoną metodę reakcji chemicznej do generowania gradientu tlenu. Kierunki gradientów chemicznych i tlenu są do siebie prostopadłe, co umożliwia prostą interpretację wyników migracji. Aby efektywnie generować gradienty tlenu przy minimalnym zużyciu środków chemicznych, wbudowana cienka folia PC jest wykorzystywana jako bariera dyfuzyjna gazu. Opracowane urządzenie mikroprzepływowe może być uruchamiane za pomocą pomp strzykawkowych i umieszczane w konwencjonalnym inkubatorze komórkowym podczas eksperymentów migracji komórek, co pozwala na uproszczenie konfiguracji i zoptymalizowanie warunków hodowli komórek. W eksperymentach komórkowych użyliśmy urządzenia do zbadania migracji adenocyrakinomicznych ludzkich komórek podstawnych nabłonka pęcherzyków płucnych, A549, w kombinacjach chemokiny (czynnik pochodzący z komórek zrębowych, SDF-1α) i gradientów tlenu. Wyniki eksperymentów pokazują, że urządzenie może stabilnie generować prostopadłe gradienty chemokin i tlenu oraz jest kompatybilne z komórkami. Wyniki badań migracji wskazują, że gradienty tlenu mogą odgrywać istotną rolę w kierowaniu migracją komórek, a zachowanie komórek w kombinacjach gradientów nie może być przewidziane na podstawie tych w pojedynczych gradientach. Urządzenie stanowi potężne i praktyczne narzędzie dla naukowców do badania interakcji między gradientami chemicznymi i tlenowymi w hodowli komórkowej, co może przyczynić się do lepszych badań migracji komórek w mikrośrodowiskach podobnych do in vivo.

Wprowadzenie

Przestrzenny rozkład czynników rozpuszczalnych i napięcia tlenu może regulować wiele ważnych funkcji komórkowych in vivo1,2,3,4. Aby lepiej zbadać ich wpływ na komórki, bardzo pożądana jest platforma do hodowli komórkowych in vitro, która będzie w stanie stabilnie generować gradienty chemiczne i tlenowe. Różne rozpuszczalne czynniki odgrywają kluczową rolę w aktywności biologicznej i wpływają na zachowanie komórek. Ostatnio, ze względu na postęp technik mikroprzepływowych, opracowano szereg urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do stabilnego generowania gradientów chemicznych do badania migracji komórek5. Co więcej, kilka badań wykazało również konieczność stosowania tlenu w hodowlach komórkowych in vitro6,7,8. Jednak kontrola napięcia tlenu w hodowli komórkowej opiera się głównie na bezpośrednim dodawaniu substancji chemicznych do usuwania tlenu lub inkubatorach komórkowych z butlami z gazem pod ciśnieniem. Bezpośrednie dodawanie substancji chemicznych zmienia pożywkę do hodowli komórkowej i wpływa na odpowiedzi komórkowe. Inkubatory z kontrolą tlenu wymagają specjalnej konstrukcji inkubatora, precyzyjnej kontroli przepływu gazu i dużej ilości azotu w celu osiągnięcia warunków niedotlenienia. Co więcej, niemożliwe jest kontrolowanie przestrzennego rozkładu tlenu za pomocą tego układu, który opóźnia badanie zachowania komórkowego przy różnych napięciach i gradientach tlenu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano szereg urządzeń mikroprzepływowych do generowania gradientów tlenu do zastosowań w hodowlach komórkowych9. Jednak większość z nich jest zasilana gazami pod ciśnieniem, co może powodować problemy z parowaniem i tworzeniem pęcherzyków. W związku z tym często wymagają one wyrafinowanego oprzyrządowania i mogą nie być wiarygodne w przypadku długoterminowych badań nad hodowlami komórkowymi.

Aby sprostać wyzwaniom i dalej badać interakcje między gradientami chemicznymi i tlenowymi dla migracji komórek, opracowaliśmy mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórek wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) z wbudowaną cienką warstwą poliwęglanu (PC)10. Urządzenie składa się z dwóch warstw kanałów mikroprzepływowych oddzielonych membraną PDMS. Górna warstwa to warstwa PDMS-PC do generowania gradientu tlenu; dolna warstwa wykonana jest z PDMS do generowania gradientu chemicznego i hodowli komórkowej. Urządzenie może jednocześnie generować prostopadłe gradienty chemiczne i tlenu bez użycia butli gazowych i zaawansowanych systemów kontroli przepływu. W urządzeniu PDMS zapewnia doskonałą przezroczystość optyczną, przepuszczalność gazów i kompatybilność biologiczną z hodowlą komórkową i obrazowaniem. Wbudowana folia PC służy jako bariera dyfuzyjna dla efektywnej kontroli napięcia tlenu. W kanale mikroprzepływowym użyliśmy szeregu kanałów w kształcie serpentyny do generowania gradientów chemicznych. Konstrukcja została szeroko wykorzystana do generowania gradientów chemicznych w urządzeniach mikroprzepływowych do różnych zastosowań ze względu na swoją niezawodność i łatwą konfigurację eksperymentalną. Co więcej, profile gradientu chemicznego można zaprojektować, zmieniając wcześniej geometrię kanału za pomocą symulacji numerycznej. Do generowania gradientu tlenu wykorzystaliśmy metodę reakcji chemicznej ograniczonej przestrzennie, która została wcześniej opracowana w naszym lab10,11,12. Tlen może być pobierany z wyznaczonych obszarów bez przedmuchiwania azotem. Do praktycznego zastosowania w laboratoriach biologicznych, cała konfiguracja eksperymentalna jest kompatybilna z konwencjonalnymi inkubatorami do hodowli komórkowych. Integrując te metody, możemy jednocześnie generować stabilne gradienty chemiczne i tlenowe bez dużych butli z gazem i zaawansowanego oprzyrządowania w celu zbadania migracji komórek.

Protokół

1. Produkcja urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Całe urządzenie mikroprzepływowe jest wytwarzane przy użyciu procesu formowania replik miękkiej litografii13.

  1. Wykonanie form do warstw PDMS w urządzeniu mikroprzepływowym
    1. Zaprojektuj wzorce kanałów mikroprzepływowych za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do ilustracji lub rysowania. Prześlij plik do firmy w celu wydrukowania przezroczystej maski fotograficznej w wysokiej rozdzielczości14.
    2. Czyste płytki krzemowe należy oczyścić acetonem (≥99,5%), alkoholem izopropylowym (IPA; ≥99,9%) i buforowanym wytrawianiem tlenkowym (BOE; 6:1 NH4F.HF). Spłucz wodą dejonizowaną (DI) i odwodnij wafel za pomocą pistoletu do azotu.
    3. Przędzić warstwę około 20 g fotorezystu o odcieniu negatywu, SU-8 2050, na płytkach z prędkością 500 obr./min przez 15 sekund, a następnie 2,000 obr./min przez 30 sek.
      UWAGA: W warunkach powlekania wirowego po litografii optycznej powinny powstać warstwy fotorezystu SU-8 2050 o grubości około 75 μm na płytkach.
    4. Wafle pieczemy na miękko na płycie grzewczej o temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 9 minut. Po miękkim upieczeniu naświetl wafle za pomocą wyrównywacza maski z zaprojektowanymi przezroczystymi maskami w świetle UV; całkowita energia ekspozycji powinna wynosić około 300 mJ/cm2. Pieczenie wafli po ekspozycji (PEB) w temperaturze 65 °C przez 2 min, a następnie w temperaturze 95 °C przez 7 min.
    5. Po PEB zanurzyć płytki w wywoływaczu SU-8 z silnym mieszaniem lub w kąpieli ultradźwiękowej (37 kHz i 180 W efektywnej mocy ultradźwiękowej) na 7 minut. Przepłukać wafel acetonem i IPA w celu usunięcia pozostałości SU-8.
    6. Umieścić wafel i 100 μl silanu (1H,1H,2H,2H-perfluorooktyltrichlorosilan) na szalce Petriego o średnicy 6 cm w eksykatorze połączonym z membranową pompą próżniową do silanizacji powierzchni płytki, aby zapobiec niepożądanemu wiązaniu. Włączyć pompę na 15 minut, wyłączyć ją i uszczelnić eksykator próżnią na 30 minut.
    7. Wyjąć silanizowane płytki z eksykatora i przykleić je taśmą do szalek Petriego o średnicy 15 cm w celu przeprowadzenia następującego procesu miękkiej litografii:
  2. Produkcja i montaż warstw PDMS
    1. Przygotowanie prepolimeru PDMS
      1. Wymieszaj monomer PDMS (zasada) i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v). Odgazowuje mieszaninę w eksykatorze przez 60 minut.
    2. Wykonanie warstwy wierzchniej wbudowanej w komputer PC
      1. Przenieś 2 g prepolimeru PDMS na formę z wzorami kanałów płynnych górnej warstwy, aby uzyskać cienką warstwę PDMS. Umieść formę w ustawieniu eksykatora, aby odgazować PDMS przez 60 minut.
      2. Umieść formę na noc w piekarniku o temperaturze 60 °C do utwardzenia PDMS. Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej.
      3. Ostudzić formę do temperatury pokojowej. Wlać dodatkowe 13 g prepolimeru PDMS na formę i odgazować PDMS w konfiguracji eksykatora przez 60 minut.
      4. Powoli zanurz folię PC o grubości 1 mm w świeżej warstwie PDMS jako barierę dyfuzyjną gazu; w razie potrzeby usuń wszelkie pęcherzyki.
      5. Wstaw formę na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C i upewnij się, że jest w płaszczyźnie poziomej.
      6. Schłodzić utwardzony PDMS do temperatury pokojowej. Przytnij urządzenie skalpelem na powierzchnię około 5,5 x 5 cm2, która może pokryć wszystkie wzory kanałów, i oderwij płytę PDMS od formy.
      7. Przebij otwory na wloty i wyloty za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm. Spreparowaną górną warstwę PDMS-PC należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia do późniejszego montażu.
    3. Wykonanie dolnej warstwy PDMS
      1. Wlej 11 g prepolimeru PDMS na formę na dolną warstwę. Umieść formę w eksykatorze, aby odgazować PDMS na 60 minut. Przechowuj formę przez noc w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby utwardzić PDMS. Upewnij się, że leży na płaszczyźnie poziomej.
      2. Schłodzić PDMS do temperatury pokojowej. Przytnij urządzenie do obszaru o wymiarach około 5,5 x 5 cm2, który może pokryć wszystkie wzory kanałów, i oderwij je od formy. Spreparowaną dolną warstwę PDMS należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia w celu późniejszego montażu.
    4. Wykonanie membrany PDMS
      1. Przędzić około 4 g prepolimeru PDMS na silanizowaną pustą płytkę z prędkością 100 obr./min przez 90 sekund, a następnie 3 000 obr./min przez 4 sekundy. Piecz wirową wafel w piekarniku o temperaturze 60 °C przez noc.
    5. Montaż urządzenia
      1. Umieść wyprodukowaną wierzchnią warstwę PDMS-PC i płytkę z membraną PDMS powlekaną spinowo w maszynie do plazmowej obróbki powierzchniO2 powierzchniami klejenia skierowanymi do góry. Powierzchnie PDMS należy traktować plazmą O2 o mocy 90 W przez 40 sekund.
      2. Przyklej górną warstwę do membrany PDMS zaraz po obróbce powierzchni plazmąO2. Umieść ciężarek (około 600 g) na łączonych warstwach i wstaw go na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C, aby ułatwić wiązanie.
      3. Schłodzić połączone warstwy do temperatury pokojowej i przyciąć membranę przyklejoną do wierzchniej warstwy za pomocą skalpela na powierzchnię około 5,5 x 5 cm2, która może pokryć wszystkie wzory kanałów. Oderwij połączoną strukturę od płytki krzemowej i przebij otwory na wlotach i wylotach kanału gradientu chemicznego za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 2 mm.
      4. Umieść górną warstwę klejoną membraną i wyprodukowaną dolną warstwę PDMS w maszynie do plazmowej obróbki powierzchni O2, powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry, aby aktywować powierzchnie PDMS za pomocą plazmy o mocy 90 W przez 40 sekund.
      5. Połącz ze sobą górną i dolną warstwę w celu sklejenia natychmiast po obróbce powierzchni. Umieść ciężarek (około 600 g) na wierzchu całego urządzenia i wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C.
      6. Wyjmij całe wyprodukowane urządzenie z piekarnika i ostudź je do temperatury pokojowej.

2. Test migracji komórek mikroprzepływowych

UWAGA: W tym artykule używamy powszechnie używanej linii komórkowej, adenocykoraksynomicznej ludzkiej komórki podstawnego nabłonka pęcherzyków płucnych (A549) oraz chemokiny, czynnika pochodzącego z komórek zrębu (SDF-1α), jako przykładów. Badacze pracujący nad innymi komórkami i chemokinami proszeni są o odpowiednie dostosowanie procesów eksperymentalnych.

  1. Dzień 0: Przygotowanie komórek
    1. Hoduj zapas komórek A549 w kompletnej pożywce wzrostowej zawierającej substytut L-glutaminy DMEM F12, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) przeciwbakteryjny roztwór przeciwgrzybiczy. Subkultura przez dysocjację z 0,25% trypsyną-EDTA.
    2. Przygotować zawiesiny komórek do doświadczeń, odwirowując zdysocjowane komórki w temperaturze 140 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. W eksperymentach z urządzeniem mikroprzepływowym należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zasiać co najmniej 1 x 106 komórek w kolbie T75 z 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej.
      UWAGA: Wszystkie procesy hodowli komórkowej przeprowadza się w inkubatorze o temperaturze 37 °C i atmosferze 5%CO2
      3. .
  2. Dzień 1: Przygotowanie urządzenia
    1. Umieść urządzenie w maszynie plazmowejO2 i potraktuj je plazmąO2 o mocy 90 W przez 40 sekund, aby powierzchnie kanałów mikroprzepływowych stały się hydrofilowe.
    2. Natychmiast po obróbce powierzchni zainstaluj dwie igły 14 G, bezpośrednio wkładając igły do otworów o średnicy 2 mm wybitych w warstwie PDMS na wlotach kanałów gradientu chemicznego. Upewnij się, że igły nie blokują kanałów mikroprzepływowych. Pobrać 0,8 ml ddH2O za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 14 G. Wstrzyknąć ddH2O do kanału gradientu chemicznego od wylotu, aż woda wypłynie z obu igieł na wlotach.
    3. Przygotować 1 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml, rozcieńczając bulion fibronektyny solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
    4. Roztwor fibronektyny należy wlać w infuzji z wylotu kanału gradientu chemicznego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 14 G, aż roztwór wypłynie z obu igieł na wlotach.
    5. Inkubuj całe urządzenie przez noc w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych.
  3. Dzień 2: Wysiewanie komórek i obrazowanie mikroskopowe
    1. Wysiewanie komórek
      1. Odessać pożywkę z komórek, które były hodowane od dnia 0 i przemyć komórki 5 ml DPBS 2 razy. Odessać DPBS, dodać 2 ml trypsyny-EDTA i inkubować komórki w inkubatorze przez 5 minut, aby oderwać komórki od powierzchni kolby.
      2. Poczekać, aż komórki zostaną odłączone i zawieszone w roztworze, a następnie dodać 8 ml pożywki niezawierającej surowicy (DMEM F12 + 1% (v/v) przeciwbakteryjny roztwór przeciwgrzybiczy) do kolby. Przenieść cały płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 140 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać odpowiednią ilość pożywki wolnej od surowicy, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 x 106 komórek/ml. Wyjmij urządzenie mikroprzepływowe przygotowane w dniu 1. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub innego automatycznego przyrządu do liczenia komórek.
      4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą igłą o sile 14 G wstrzyknąć pożywkę pozbawioną surowicy z ujścia kanału gradientu chemicznego, aż pożywka wypłynie z obu igieł na wlotach. Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórek z wylotu kanału gradientu chemicznego.
      5. Obserwuj komorę hodowli komórkowej w urządzeniu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały wprowadzone do kanału mikroprzepływowego. Umieść urządzenie w wilgotnym pojemniku (np. plastikowym pudełku z ddH2O w środku) i przechowuj je w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 5 godzin, aby ułatwić przyleganie komórek do powierzchni urządzenia.
    2. Przygotowanie odczynników do generowania gradientów chemicznych
      1. Przygotować substancję chemiczną (SDF-1α) o pożądanym stężeniu (100 ng/ml) w podłożu bez surowicy. Narysuj pożywkę bez surowicy z substancją chemiczną i bez niej do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 μl/min do późniejszego użycia.
    3. Przygotowanie odczynników do generowania gradientu tlenu
      1. Przygotować 15 ml 1 M roztworu NaOH i 15 ml 200 mg/ml roztworu pirogalolu. Pobrać roztwory NaOH i pirogalolu do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 15 ml połączonych odpowiednio z rurką PTFE o wysokiej czystości i rurką o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 5 μl/min do późniejszego użycia.
    4. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego
      1. Po 5 godzinnej inkubacji wyjmij całe urządzenie i umieść je na szalce Petriego o średnicy 15 cm. Zamocuj urządzenie na szalce Petriego za pomocą szpachli klejącej. Przenieść szalkę Petriego do mikroskopu do obrazowania żywych komórek w inkubatorze.
      2. Podłącz rurki ze strzykawek w celu generowania gradientu chemicznego do wlotów kanału gradientu chemicznego. Podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego.
      3. Podłączyć rurki o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających NaOH i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu tlenu.
      4. Dodaj około 15 ml ddH2O do szalki Petriego, aby utrzymać nawilżenie urządzenia. Skonfiguruj mikroskop do obrazowania żywych komórek do przechwytywania obrazu poklatkowego i rób zdjęcie co 15 minut.
  4. Dzień 3: Gromadzenie i analiza danych
    1. Przenieś przechwycone pliki obrazów do komputera. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, ImageJ, z wtyczką open source do ręcznego śledzenia (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) i bezpłatnym oprogramowaniem Chemotaxis Tool (http://ibidi.com/xtproducts/en/Software-and-Image-Analysis/Manual-Image-Analysis/Chemotaxis-and-Migration-Tool)15,16.

3. Charakterystyka gradientów

UWAGA: Gradienty chemiczne i tlenowe można scharakteryzować przed lub po eksperymentach na komórkach.

  1. Symulacja numeryczna gradientu chemicznego
    1. Oszacuj naturę przepływu laminarnego w mikrofluidyce za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów (CFD).
  2. Eksperymentalna charakterystyka gradientu tlenu
    1. Przygotować wrażliwy na tlen barwnik fluorescencyjny, sześciowodny chlorek tris(2,2′-bipirydylo)rutenu(III), roztwór w wodzie o stężeniu 5 mg/ml.
    2. Pobrać wrażliwy na tlen roztwór barwnika do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 μl/min (identycznym z natężeniem przepływu używanym do generowania gradientu chemicznego).
    3. Podłączyć rurkę ze strzykawek do wlotów kanału gradientu chemicznego. Podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego.
    4. Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, w którym światło wzbudzenia przechodzi przez filtr optyczny 470 ± 20 nm. Zbieraj światło emisyjne przez długoprzepustowy filtr emisyjny 515 nm za pomocą chłodnej kamery CCD.
    5. Podłączyć rurki o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających NaOH i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu tlenu.
    6. Zbierz obrazy fluorescencyjne wrażliwego na tlen barwnika przepływającego w komorze hodowli komórkowej.
    7. Zatrzymaj przepływ w celu wytworzenia gradientu tlenu i odłącz wszystkie rurki od kanału wytwarzania tlenu. Podłącz rurki o wysokiej czystości z butli gazowych do wylotu kanału gradientu tlenu.
    8. Zbierz obrazy fluorescencyjne wrażliwego na tlen barwnika przepływającego w komorze hodowli komórkowej, gdy przepływa powietrze, czysty azot i czysty tlen do rurki podłączonej do kanału gradientu tlenu.
    9. Oszacuj gradienty tlenu, analizując obrazy fluorescencji przy użyciu równania Sterna-Volmera zgodnie z odniesieniami 10 i 11.

Wyniki

Wykonane hybrydowe urządzenie mikroprzepływowe do hodowli komórkowych z PDMS-PC. Rys. 1 przedstawia zdjęcie i ilustrację urządzenia mikroprzepływowego. Warstwa dolna zawiera cztery poziomy kanałów o kształcie serpentyny, służące do generowania roztworów z odczynników wprowadzanych przez dwa oddzielne wloty z sześcioma różnymi stosunkami mieszania. Teoretycznie sześć różnych stosunków mieszania między dwoma roztworami wprowadzanymi przez wloty wynosi 1:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 oraz 0:1 (lewy:prawy). Gradienty chemiczne tworzone przez sześć roztworów o różnych stosunkach mieszania mogą być generowane w komorze hodowli komórkowej znajdującej się poniżej. Warstwy górna i dolna są oddzielone membraną z PDMS. W warstwie górnej odczynniki do chemicznej reakcji usuwania tlenu są wprowadzane do kanału mikroprzepływowego przez dwa oddzielne wloty. Odczynniki mieszają się ze sobą w celu przeprowadzenia reakcji bezpośrednio przed przepłynięciem nad komorą hodowli komórkowej, aby usunąć tlen z kanału dolnego bez bezpośredniego kontaktu chemicznego. Wbudowana folia PC, o mniejszym współczynniku dyfuzji gazów w porównaniu do PDMS, pełni rolę bariery dyfuzyjnej, która zwiększa wydajność usuwania tlenu. Tlen stopniowo dyfunduje z powrotem do komory hodowli komórkowej przez PDMS w obszarze poniżej, tworząc gradient tlenowy wzdłuż kierunku przepływu. Ponieważ chemiczna reakcja usuwania tlenu jest ograniczona przestrzennie, wpływa ona jedynie na lokalne ciśnienia parcjalne tlenu. W rezultacie urządzenie może być wykorzystywane w konwencjonalnym inkubatorze komórkowym bez zmiany globalnego poziomu tlenu. W eksperymentach z migracją komórki są wysiewane wewnątrz komory hodowli komórkowej w celu obserwacji. Pożywka wzrostowa i odczynniki chemiczne są wprowadzane do urządzenia za pomocą pomp strzykawkowych z precyzyjnie kontrolowanymi prędkościami przepływu.

Charakterystyka gradientów chemicznych i tlenowych generowanych wewnątrz urządzenia. Ze względu na laminarny charakter przepływu w mikrofluidyce, zachowanie przepływu można przewidzieć za pomocą symulacji numerycznej dynamiki płynów (CFD). W niniejszej pracy zbudowano model 3D i przeprowadzono symulację przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania do modelowania wielofizycznego. Ryc. 2(a) przedstawia porównanie eksperymentalnie określonych profilów stężeń fluoresceiny w poprzek szerokości komory hodowli komórek, opartych na pomiarach intensywności fluorescencji, z wynikami symulacji numerycznej. Zgodność wyników eksperymentalnych i symulacyjnych sugeruje, że model CFD pozwala na dokładną ocenę gradientów chemicznych generowanych wewnątrz urządzenia. Ryc. 2(b) przedstawia symulowany gradient SDF-1α generowany w komorze hodowli komórek. Ryc. 3 pokazuje wyniki charakterystyki gradientu tlenu uzyskane poprzez przepływ tlenoczułego barwnika fluorescencyjnego wewnątrz komory hodowli komórek przed eksperymentami z komórkami. Wynik wskazuje, że za pomocą opisanego protokołu można ustanowić gradient tlenu w zakresie od około 1 do 16%.

Wyniki migracji komórek. W ramach demonstracji przeprowadzono badania migracji komórek A549 w czterech kombinacjach gradientów chemokiny (SDF-1α) i tlenu: (1) brak gradientu chemokiny i tlenu jako kontrola, (2) z gradientem chemokiny i bez gradientu tlenu, (3) z gradientem tlenu i bez gradientu chemokiny oraz (4) z obydwoma gradientami, chemokiny i tlenu. Rys. 4 przedstawia zdjęcie całego układu eksperymentalnego. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórek, w którym umieszczono cały zestaw (w tym urządzenia mikroprzepływowe, pompy strzykawkowe i mikroskopy do obrazowania żywych komórek). Wyniki migracji komórek przedstawiono na Rys. 5. Rys. 5(a) pokazuje obrazy zebrane podczas eksperymentów za pomocą analizatora do obrazowania żywych komórek, a Rys. 5(b) i (c) przedstawiają trajektorie migracji komórek oraz średnie przemieszczenia w czterech analizowanych kombinacjach, opracowane za pomocą oprogramowania ImageJ z wtyczkami. Wyniki wskazują, że średni dystans migracji komórek w grupie kontrolnej dąży do zera, co sugeruje losowy ruch komórek w eksperymencie. W przeciwieństwie do tego, przy samym gradiencie chemokiny średni ruch komórek skierowany jest w lewo, gdzie stężenie SDF-1α jest wyższe. Wyniki sugerują zachowanie chemotaktyczne komórek A549 względem SDF-1α, co było raportowane we wcześniejszych badaniach. W eksperymencie z samymi gradientami tlenu średni ruch komórek skierowany jest w górę, gdzie ciśnienie tlenu jest niższe. Co ciekawsze, w eksperymencie z prostopadłymi gradientami chemokiny i tlenu średni ruch komórek skierowany jest w górę, bez żadnego wyraźnego przemieszczenia w kierunku poziomym (kierunku gradientu chemokiny).

Schemat chipa mikroprzepływowego z gradientami chemicznymi i tlenowymi do hodowli komórkowej; montaż warstw PDMS-PC.
Rycina 1: Wykonane mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórkowej z PDMS-PC. (a) Zdjęcie eksperymentalne wykonanego urządzenia zdolnego do niezawodnego generowania prostopadłych gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek. Kanał gradientu chemicznego jest wypełniony niebieskim i żółtym barwnikiem spożywczym w celu zademonstrowania generowania gradientu wewnątrz komory hodowli komórkowej. Kanał gradientu tlenowego jest wypełniony czerwonym barwnikiem spożywczym. Pasek skali wynosi 1 cm. (b) Schemat urządzenia mikroprzepływowego. Warstwa górna została wykonana z PDMS z osadzonymi warstwami PC jako barierą dyfuzji gazów dla efektywnej kontroli gradientu tlenowego wewnątrz komory hodowli komórkowej. (c) Formy matryc do wykonania warstw górnej i dolnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres dyfuzji fluoresceiny; COMSOL w porównaniu z wynikami eksperymentalnymi, konfiguracja komory mikroprzepływowej, gradient stężeń.
Rycina 2: Gradient chemiczny wewnątrz mikroprzepływowego urządzenia do hodowli komórek. (a) Numerycznie symulowany i eksperymentalnie określony gradient stężeń fluoresceiny wewnątrz komory hodowlanej w poprzek szerokości komory (kierunek Y). Podobieństwo między gradientami symulowanymi a zmierzonymi eksperymentalnie wskazuje, że symulacja pozwala na dokładne przewidzenie gradientu chemicznego. Wstawka na rysunku przedstawia trójwymiarowy (3D) model stworzony na potrzeby symulacji. (b) Wynik symulacji numerycznej gradientu chemokiny SDF-1α w poprzek szerokości komory hodowlanej dla badań migracji komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres napięcia tlenowego w funkcji pozycji; schemat przepływu w komorze hodowli komórkowej; charakterystyka eksperymentalna.
Rycina 3: Gradient tlenowy wewnątrz mikrofluidycznego urządzenia do hodowli komórek. Eksperymentalnie zmierzone gradienty tlenowe w komorze hodowli komórkowej wzdłuż kierunku przepływu. Gradienty oszacowano przy użyciu tlenoczułego barwnika fluorescencyjnego oraz analizy obrazu. Przedstawiono charakterystykę gradientów od lewej do prawej strony komory; wyniki wykazują spójne profile gradientów w całej szerokości komory.

Układ inkubacji hodowli komórkowej z pompami strzykawkowymi, urządzeniem mikroprzepływowym i mikroskopem do obrazowania żywych komórek.
Rycina 4: Zdjęcia układu eksperymentalnego. Cały układ, obejmujący urządzenia mikroprzepływowe, pompy strzykawkowe oraz mikroskop do obrazowania żywych komórek, umieszczono w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowej w celu zapewnienia optymalnych warunków hodowli podczas eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Migracja komórek w gradientach; schemat przedstawiający układ mikropilar oraz analizę ruchu wraz z wykresami.
Rysunek 5: Wyniki badania migracji komórek w prostopadłych gradientach SDF-1α​ i tlenu. (a) Obrazy zarejestrowane przed i po 12-godzinnym badaniu migracji komórek. Ścieżki migracji komórek można analizować na podstawie zarejestrowanych obrazów time-lapse przy użyciu mikroskopu do obrazowania żywych komórek. (b) Ścieżki migracji komórek i przeanalizowany średni ruch migracyjny z zarejestrowanych obrazów przy czterech różnych kombinacjach gradientów: brak gradientu, tylko gradient chemokiny, tylko gradient tlenu oraz gradient chemokiny i tlenu jednocześnie. Obrazy były rejestrowane co 15 min. Pasek skali wynosi 250 µm. (c) Wykresy średnich odległości migracji komórek w kierunku prostopadłym (gradient tlenu) i poziomym (gradient chemokiny) przy czterech różnych kombinacjach gradientów. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, uzyskane z trzech niezależnych serii eksperymentalnych, przy analizie 10 komórek w każdym doświadczeniu. Wyniki istotnie różniące się statystycznie (nieparzysty test t Studenta, p < 0.01) oznaczono różnymi literami (a i b). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi krokami do wytworzenia urządzenia mikroprzepływowego PDMS z wbudowaną cienką folią PC są: (1) usunięcie wszystkich pęcherzyków podczas wkładania folii PC do prepolimeru PDMS podczas wytwarzania górnej warstwy PDMS-PC oraz (2) upewnienie się, że wszystkie procesy utwardzania PDMS są wykonywane na dobrze wypoziomowanej płaszczyźnie poziomej. W przypadku eksperymentów z migracją komórek najbardziej krytycznymi krokami są: (1) eliminacja pęcherzyków w urządzeniu mikroprzepływowym, rurkach i pompach strzykawkowych podczas eksperymentów; (2) zapewnienie, że urządzenie mikroprzepływowe jest umieszczone na dobrze wypoziomowanej płaszczyźnie poziomej podczas obrazowania żywych komórek w celu obserwacji migracji komórek; oraz (3) utrzymywanie urządzenia w stanie nawilżenia poprzez dodawanie ddH2O do szalki Petriego podczas eksperymentów i upewnianie się, że woda nie jest wysuszona.

Aby skutecznie wytworzyć hybrydowe urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC bez rozwarstwiania, konieczne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków podczas wkładania folii PC. Folię PC można powoli wkładać pod kątem (około 15 do 30 stopni od powierzchni prepolimeru PDMS), aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków podczas wkładania folii PC do prepolimeru PDMS. W razie potrzeby cały prepolimer PDMS z wbudowaną folią PC można umieścić w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej na 10 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków. Jeśli folia PC unosi się w górę po procesie próżniowym, można użyć końcówki pipety, aby docisnąć folię PC do utwardzonej warstwy PDMS. W razie potrzeby powtórz procesy odkurzania i prasowania.

W przypadku eksperymentów komórkowych brak pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla mikroprzepływowej hodowli komórek. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są wprowadzane do całego zestawu mikroprzepływowego (w tym pomp strzykawkowych, przewodów i urządzenia mikroprzepływowego) podczas wykonywania połączeń. Jeśli pęcherzyki powietrza powstają w układzie mikroprzepływowym z powodu spadku rozpuszczalności gazów w podwyższonej temperaturze eksperymentów wewnątrz inkubatora, wszystkie składniki eksperymentalne (w tym strzykawki i rurki) i odczynniki (w tym pożywkę wzrostową, pirogalol i NaOH) można wcześniej umieścić w inkubatorze (co najmniej 20 minut przed użyciem), aby zminimalizować zmiany temperatury. Pompy strzykawkowe często wytwarzają ciepło w wyniku działania silników w pompach. Zazwyczaj dopuszczalne jest używanie pomp strzykawkowych wewnątrz inkubatorów; Należy jednak sprawdzić temperaturę inkubatora podczas eksperymentów. Jeśli temperatura wzrośnie podczas eksperymentów, należy przeprowadzić dodatkowe procedury chłodzenia. Można zastosować kilka możliwych metod chłodzenia, takich jak umieszczenie pudełka z lodem w inkubatorze, zmniejszenie liczby pomp strzykawkowych umieszczonych wewnątrz inkubatora lub użycie inkubatora z systemem chłodzenia siłowego.

Opracowane w tym artykule mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórek PDMS-PC jest w stanie niezawodnie generować prostopadłe gradienty chemiczne i tlenowe do badań migracji komórek. Ograniczeniem opracowanego urządzenia jest to, że generowane profile gradientu tlenu zależą od równowagi między strumieniem tlenu, napędzanym przez oczyszczanie reakcji chemicznych, a dyfuzją tlenu z atmosfery otoczenia, przez urządzenie i do medium. W rezultacie profile gradientu tlenu nie mogą być dowolnie kontrolowane wewnątrz urządzenia. W porównaniu z istniejącymi mikroprzepływowymi platformami do hodowli komórek, urządzenie opracowane w tym artykule jest pierwszym zdolnym do przeprowadzania badań hodowli komórkowych w połączeniu z gradientami chemicznymi i tlenowymi. Całe urządzenie można wytworzyć przy użyciu konwencjonalnego procesu formowania replik miękkiej litografii, bez żmudnego wyrównywania i kosztownego oprzyrządowania. Gradienty mogą być symulowane numerycznie i charakteryzowane eksperymentalnie, aby zapewnić bardziej fizjologiczne warunki podobne do mikrośrodowiska do badań komórkowych in vitro . Dzięki zastosowaniu ograniczonej przestrzennie metody reakcji chemicznej z folią PC jako barierą dyfuzyjną gazu, gradient tlenu można wygenerować bez użycia butli z gazem pod ciśnieniem i zaawansowanych jednostek kontroli przepływu gazu. Ponadto konfiguracja wymaga tylko niewielkich ilości chemikaliów (mniej niż 10 ml dziennie), aby utrzymać gradienty tlenu. Ponieważ kontrola napięcia tlenu jest ograniczona lokalnie wokół kanału mikroprzepływowego i nie zakłóca stężenia tlenu w otoczeniu, cały zestaw można umieścić w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych bez dodatkowego oprzyrządowania do kontroli temperatury, wilgotności iCO2 . W związku z tym opracowane urządzenie ma ogromny potencjał do praktycznego zastosowania w laboratoriach biologicznych.

Ze względu na ograniczenia techniczne, zachowania komórek pod ciśnieniem tlenu rzadko były badane w istniejącej literaturze. Za pomocą urządzenia opracowanego w tym artykule, hodowla komórkowa w gradientach tlenu może być przeprowadzana w łatwy sposób, który znacznie sprzyja badaniom komórek w gradientach tlenu. Co więcej, podobną zasadę działania można zastosować do generowania innych fizjologicznie istotnych gradientów gazowych, takich jak dwutlenek węgla i tlenek azotu, w badaniach hodowli komórkowych in vitro 17. Możliwości te pokazują, że urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC wykazuje ogromny potencjał w różnych zastosowaniach w hodowlach komórkowych, w tym w testowaniu leków oraz testach proliferacji i migracji komórek, w celu przyspieszenia badań nad hodowlami komórkowymi in vitro.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ten artykuł jest oparty na pracy wspieranej przez National Health Research Institutes (NHRI) na Tajwanie w ramach Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), Tajwańskie Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), Projekt Tematyczny Academia Sinica (AS-105-TP-A06) oraz Program Badawczy w Nanonauce i Nanotechnologii. Autorzy pragną podziękować Pani Rachel A. Lucas za korektę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ302104
1,5 ml Probówka do mikrowirówekSmartgene6011-000
Strzykawka 10 mlBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ302151
15 ml Probówka wirówkowaThermoFisher Scientific, Waltham, MAFalcon 352096
150 mmszalka Petriego Dogger ScienceDP-43151
1H,1H,2H,2H-PerfluorooctyltrichlorosilanAlfa Aesar, Ward Hill, MA78560-45-9
ml StrzykawkaBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ302118
4-calowy atrapa krzemu WafelWollemi Technical, Taoyuan, Tajwan
AcetonECHO Chemical, Miaoli, TajwanAH3102-000000-72EC
AG Nakładka na maskę z podwójną ekspozycjąM& R Nano Technology, Taoyuan, TajwanAG500-4D-D-V-S-H
Roztwór antybiotykowo-antymiotycznyThermoFisher Scientific, Waltham, MAGIBCO 15240-062
Dziurkacz do biopsjiMiltex, Plainsboro, NJ33-31
igłaJensenGlobal, Santa Barbara, CAMiernik 14
Hemocytometr jasnej liniiSigma-Aldrich, St. Louis, MOZ359629do zliczania komórek
Buffered Oxide EtchECHO Chemical, Miaoli, TajwanPH3101-000000-72EC
Inkubator kultur komórkowychCaron, Marietta, OH6016-1
COMSOL MultiphysicsCOMSOL, Burlington, MAVer. 4.3bdo numerycznej symulacji gradientów chemicznych w urządzeniu
D-PBSThermoFisher Scientific, Waltham, MAGIBCO 14190-144
DesicattorA-VAC Industries, Anaheim, CA35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1ThermoFisher Scientific, Waltham, MAGIBCO 10565-018
Surowica bydlęcapłodu ThermoFisher Scientific, Waltham, MAGIBCO 10082
Fibronektyna z ludzkiego osoczaSigma-Aldrich, St. Louis, MOF2006
Odwrócony Mikroskop fluorescencyjnyLeica Microsystems, Wetzlar, NiemcyDMIL LED
Alkohol izopropylowy (IPA)ECHO Chemical, Miaoli, TajwanCMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell ImagerNanoEnTek, Seul, KoreaMechaniczny piec konferencyjny DBJ01B
ThermoFisher Scientific, Waltham, MALindberg Blue M MO1450C
NaOHShowa Chemical Industry, Tokio, Japonia1943-0150
System pomiaru plazmyNordson MARCH, Concord CAPX-250do plazmowej obróbki powierzchni plazmą tlenową
Folia poliwęglanowa (PC)Quantum Beam Technologies, Tainan Tajwan
Polidimehtylsiloksan (PDMS)Dow Corning, Midland, MISYLGARD 184
PirogalolAlfa Aesar, Ward Hill, MAA13405
Usuwalna szpachlówka samoprzylepna3M860
Wirówka stołowa Sorvall Legend Mach 1.6RThermoFisher Scientific, Waltham, MA
SpinCoater ELS Technology, Hsinchu, TajwanELS 306MA
SU-8 2050MicroChem, Westborough, MASU-8 2050
SU-8 DeveloperMicroChem, Westborough, MAY020100
Ostrze chirurgiczneFeather, Osaka, Japonia5005093do cięcia PDMS
Pompa strzykawkowaChemyx, Houston, TXTermos do hodowli komórkowych Fusion 400
T75ThermoFisher Scientific, Waltham, MANunc 156367
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher Scientific, Waltham, MA15250061
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific, Waltham, MAGIBCO 25200
Rurki PTFE TygonSaint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Rurki TygonSaint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH621
3

Bibliografia

  1. Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).
  2. Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
  3. Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
  4. Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
  5. Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
  6. Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
  7. Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
  8. McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
  9. Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
  10. Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
  11. Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
  12. Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
  13. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
  14. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
  15. Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
  16. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
  17. Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenie mikroprzep ywowe PDMS PCchemiczne gradienty tlenugenerowanie gradientu prostopad egocharakterystyka gradientu tlenumigracja kom rek A549chemokina SDF 1 alfamikroskop do obrazowania ywych kom rekuk ad z pompy strzykawowejczenie plazm tlenow

Powiązane artykuły