Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Hung-Ju Chiang; Sih-Ling Yeh; Chien-Chung Peng; Wei-Hao Liao; Yi-Chung Tung

doi:10.3791/55292

Method Article

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

DOI:

10.3791/55292

⸱

February 23rd, 2017

Hung-Ju Chiang¹ , Sih-Ling Yeh¹ , Chien-Chung Peng¹ , Wei-Hao Liao¹ , Yi-Chung Tung¹

¹Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje urządzenie mikroprzepływowe wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) z wbudowaną cienką warstwą poliwęglanu (PC) do badania migracji komórek w kombinacjach gradientów chemicznych i tlenowych. Zarówno gradienty chemiczne, jak i tlenu mogą znacznie wpływać na migrację komórek in vivo; Jednak ze względu na ograniczenia techniczne przeprowadzono bardzo niewiele badań w celu zbadania ich skutków in vitro. Urządzenie opracowane w ramach tych badań wykorzystuje szereg kanałów w kształcie serpentyny do generowania pożądanych gradientów chemicznych i wykorzystuje przestrzennie ograniczoną metodę reakcji chemicznej do generowania gradientu tlenu. Kierunki gradientów chemicznych i tlenu są do siebie prostopadłe, co umożliwia prostą interpretację wyników migracji. Aby efektywnie generować gradienty tlenu przy minimalnym zużyciu środków chemicznych, wbudowana cienka folia PC jest wykorzystywana jako bariera dyfuzyjna gazu. Opracowane urządzenie mikroprzepływowe może być uruchamiane za pomocą pomp strzykawkowych i umieszczane w konwencjonalnym inkubatorze komórkowym podczas eksperymentów migracji komórek, co pozwala na uproszczenie konfiguracji i zoptymalizowanie warunków hodowli komórek. W eksperymentach komórkowych użyliśmy urządzenia do zbadania migracji adenocyrakinomicznych ludzkich komórek podstawnych nabłonka pęcherzyków płucnych, A549, w kombinacjach chemokiny (czynnik pochodzący z komórek zrębowych, SDF-1α) i gradientów tlenu. Wyniki eksperymentów pokazują, że urządzenie może stabilnie generować prostopadłe gradienty chemokin i tlenu oraz jest kompatybilne z komórkami. Wyniki badań migracji wskazują, że gradienty tlenu mogą odgrywać istotną rolę w kierowaniu migracją komórek, a zachowanie komórek w kombinacjach gradientów nie może być przewidziane na podstawie tych w pojedynczych gradientach. Urządzenie stanowi potężne i praktyczne narzędzie dla naukowców do badania interakcji między gradientami chemicznymi i tlenowymi w hodowli komórkowej, co może przyczynić się do lepszych badań migracji komórek w mikrośrodowiskach podobnych do in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzenny rozkład czynników rozpuszczalnych i napięcia tlenu może regulować wiele ważnych funkcji komórkowych in vivo¹^,²^,³^,⁴. Aby lepiej zbadać ich wpływ na komórki, bardzo pożądana jest platforma do hodowli komórkowych in vitro, która będzie w stanie stabilnie generować gradienty chemiczne i tlenowe. Różne rozpuszczalne czynniki odgrywają kluczową rolę w aktywności biologicznej i wpływają na zachowanie komórek. Ostatnio, ze względu na postęp technik mikroprzepływowych, opracowano szereg urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do stabilnego generowania gradientów chemicznych do badania migracji komórek⁵. Co więcej, kilka badań wykazało również konieczność stosowania tlenu w hodowlach komórkowych in vitro⁶^,⁷^,⁸. Jednak kontrola napięcia tlenu w hodowli komórkowej opiera się głównie na bezpośrednim dodawaniu substancji chemicznych do usuwania tlenu lub inkubatorach komórkowych z butlami z gazem pod ciśnieniem. Bezpośrednie dodawanie substancji chemicznych zmienia pożywkę do hodowli komórkowej i wpływa na odpowiedzi komórkowe. Inkubatory z kontrolą tlenu wymagają specjalnej konstrukcji inkubatora, precyzyjnej kontroli przepływu gazu i dużej ilości azotu w celu osiągnięcia warunków niedotlenienia. Co więcej, niemożliwe jest kontrolowanie przestrzennego rozkładu tlenu za pomocą tego układu, który opóźnia badanie zachowania komórkowego przy różnych napięciach i gradientach tlenu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano szereg urządzeń mikroprzepływowych do generowania gradientów tlenu do zastosowań w hodowlach komórkowych⁹. Jednak większość z nich jest zasilana gazami pod ciśnieniem, co może powodować problemy z parowaniem i tworzeniem pęcherzyków. W związku z tym często wymagają one wyrafinowanego oprzyrządowania i mogą nie być wiarygodne w przypadku długoterminowych badań nad hodowlami komórkowymi.

Aby sprostać wyzwaniom i dalej badać interakcje między gradientami chemicznymi i tlenowymi dla migracji komórek, opracowaliśmy mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórek wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) z wbudowaną cienką warstwą poliwęglanu (PC)¹⁰. Urządzenie składa się z dwóch warstw kanałów mikroprzepływowych oddzielonych membraną PDMS. Górna warstwa to warstwa PDMS-PC do generowania gradientu tlenu; dolna warstwa wykonana jest z PDMS do generowania gradientu chemicznego i hodowli komórkowej. Urządzenie może jednocześnie generować prostopadłe gradienty chemiczne i tlenu bez użycia butli gazowych i zaawansowanych systemów kontroli przepływu. W urządzeniu PDMS zapewnia doskonałą przezroczystość optyczną, przepuszczalność gazów i kompatybilność biologiczną z hodowlą komórkową i obrazowaniem. Wbudowana folia PC służy jako bariera dyfuzyjna dla efektywnej kontroli napięcia tlenu. W kanale mikroprzepływowym użyliśmy szeregu kanałów w kształcie serpentyny do generowania gradientów chemicznych. Konstrukcja została szeroko wykorzystana do generowania gradientów chemicznych w urządzeniach mikroprzepływowych do różnych zastosowań ze względu na swoją niezawodność i łatwą konfigurację eksperymentalną. Co więcej, profile gradientu chemicznego można zaprojektować, zmieniając wcześniej geometrię kanału za pomocą symulacji numerycznej. Do generowania gradientu tlenu wykorzystaliśmy metodę reakcji chemicznej ograniczonej przestrzennie, która została wcześniej opracowana w naszym lab¹⁰^,¹¹^,¹². Tlen może być pobierany z wyznaczonych obszarów bez przedmuchiwania azotem. Do praktycznego zastosowania w laboratoriach biologicznych, cała konfiguracja eksperymentalna jest kompatybilna z konwencjonalnymi inkubatorami do hodowli komórkowych. Integrując te metody, możemy jednocześnie generować stabilne gradienty chemiczne i tlenowe bez dużych butli z gazem i zaawansowanego oprzyrządowania w celu zbadania migracji komórek.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Całe urządzenie mikroprzepływowe jest wytwarzane przy użyciu procesu formowania replik miękkiej litografii¹³.

Wykonanie form do warstw PDMS w urządzeniu mikroprzepływowym
1. Zaprojektuj wzorce kanałów mikroprzepływowych za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do ilustracji lub rysowania. Prześlij plik do firmy w celu wydrukowania przezroczystej maski fotograficznej w wysokiej rozdzielczości¹⁴.
2. Czyste płytki krzemowe należy oczyścić acetonem (≥99,5%), alkoholem izopropylowym (IPA; ≥99,9%) i buforowanym wytrawianiem tlenkowym (BOE; 6:1 NH₄F.HF). Spłucz wodą dejonizowaną (DI) i odwodnij wafel za pomocą pistoletu do azotu.
3. Przędzić warstwę około 20 g fotorezystu o odcieniu negatywu, SU-8 2050, na płytkach z prędkością 500 obr./min przez 15 sekund, a następnie 2,000 obr./min przez 30 sek.
  UWAGA: W warunkach powlekania wirowego po litografii optycznej powinny powstać warstwy fotorezystu SU-8 2050 o grubości około 75 μm na płytkach.
4. Wafle pieczemy na miękko na płycie grzewczej o temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 9 minut. Po miękkim upieczeniu naświetl wafle za pomocą wyrównywacza maski z zaprojektowanymi przezroczystymi maskami w świetle UV; całkowita energia ekspozycji powinna wynosić około 300 mJ/^cm2. Pieczenie wafli po ekspozycji (PEB) w temperaturze 65 °C przez 2 min, a następnie w temperaturze 95 °C przez 7 min.
5. Po PEB zanurzyć płytki w wywoływaczu SU-8 z silnym mieszaniem lub w kąpieli ultradźwiękowej (37 kHz i 180 W efektywnej mocy ultradźwiękowej) na 7 minut. Przepłukać wafel acetonem i IPA w celu usunięcia pozostałości SU-8.
6. Umieścić wafel i 100 μl silanu (1H,1H,2H,2H-perfluorooktyltrichlorosilan) na szalce Petriego o średnicy 6 cm w eksykatorze połączonym z membranową pompą próżniową do silanizacji powierzchni płytki, aby zapobiec niepożądanemu wiązaniu. Włączyć pompę na 15 minut, wyłączyć ją i uszczelnić eksykator próżnią na 30 minut.
7. Wyjąć silanizowane płytki z eksykatora i przykleić je taśmą do szalek Petriego o średnicy 15 cm w celu przeprowadzenia następującego procesu miękkiej litografii:
Produkcja i montaż warstw PDMS
1. Przygotowanie prepolimeru PDMS
  1. Wymieszaj monomer PDMS (zasada) i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v). Odgazowuje mieszaninę w eksykatorze przez 60 minut.
2. Wykonanie warstwy wierzchniej wbudowanej w komputer PC
  1. Przenieś 2 g prepolimeru PDMS na formę z wzorami kanałów płynnych górnej warstwy, aby uzyskać cienką warstwę PDMS. Umieść formę w ustawieniu eksykatora, aby odgazować PDMS przez 60 minut.
  2. Umieść formę na noc w piekarniku o temperaturze 60 °C do utwardzenia PDMS. Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej.
  3. Ostudzić formę do temperatury pokojowej. Wlać dodatkowe 13 g prepolimeru PDMS na formę i odgazować PDMS w konfiguracji eksykatora przez 60 minut.
  4. Powoli zanurz folię PC o grubości 1 mm w świeżej warstwie PDMS jako barierę dyfuzyjną gazu; w razie potrzeby usuń wszelkie pęcherzyki.
  5. Wstaw formę na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C i upewnij się, że jest w płaszczyźnie poziomej.
  6. Schłodzić utwardzony PDMS do temperatury pokojowej. Przytnij urządzenie skalpelem na powierzchnię około 5,5 x 5 cm², która może pokryć wszystkie wzory kanałów, i oderwij płytę PDMS od formy.
  7. Przebij otwory na wloty i wyloty za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm. Spreparowaną górną warstwę PDMS-PC należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia do późniejszego montażu.
3. Wykonanie dolnej warstwy PDMS
  1. Wlej 11 g prepolimeru PDMS na formę na dolną warstwę. Umieść formę w eksykatorze, aby odgazować PDMS na 60 minut. Przechowuj formę przez noc w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby utwardzić PDMS. Upewnij się, że leży na płaszczyźnie poziomej.
  2. Schłodzić PDMS do temperatury pokojowej. Przytnij urządzenie do obszaru o wymiarach około 5,5 x 5 cm², który może pokryć wszystkie wzory kanałów, i oderwij je od formy. Spreparowaną dolną warstwę PDMS należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia w celu późniejszego montażu.
4. Wykonanie membrany PDMS
  1. Przędzić około 4 g prepolimeru PDMS na silanizowaną pustą płytkę z prędkością 100 obr./min przez 90 sekund, a następnie 3 000 obr./min przez 4 sekundy. Piecz wirową wafel w piekarniku o temperaturze 60 °C przez noc.
5. Montaż urządzenia
  1. Umieść wyprodukowaną wierzchnią warstwę PDMS-PC i płytkę z membraną PDMS powlekaną spinowo w maszynie do plazmowej obróbki powierzchni_O2 powierzchniami klejenia skierowanymi do góry. Powierzchnie PDMS należy traktować plazmą O₂ o mocy 90 W przez 40 sekund.
  2. Przyklej górną warstwę do membrany PDMS zaraz po obróbce powierzchni plazmą_O2. Umieść ciężarek (około 600 g) na łączonych warstwach i wstaw go na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C, aby ułatwić wiązanie.
  3. Schłodzić połączone warstwy do temperatury pokojowej i przyciąć membranę przyklejoną do wierzchniej warstwy za pomocą skalpela na powierzchnię około 5,5 x 5 cm², która może pokryć wszystkie wzory kanałów. Oderwij połączoną strukturę od płytki krzemowej i przebij otwory na wlotach i wylotach kanału gradientu chemicznego za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 2 mm.
  4. Umieść górną warstwę klejoną membraną i wyprodukowaną dolną warstwę PDMS w maszynie do plazmowej obróbki powierzchni O₂, powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry, aby aktywować powierzchnie PDMS za pomocą plazmy o mocy 90 W przez 40 sekund.
  5. Połącz ze sobą górną i dolną warstwę w celu sklejenia natychmiast po obróbce powierzchni. Umieść ciężarek (około 600 g) na wierzchu całego urządzenia i wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C.
  6. Wyjmij całe wyprodukowane urządzenie z piekarnika i ostudź je do temperatury pokojowej.

2. Test migracji komórek mikroprzepływowych

UWAGA: W tym artykule używamy powszechnie używanej linii komórkowej, adenocykoraksynomicznej ludzkiej komórki podstawnego nabłonka pęcherzyków płucnych (A549) oraz chemokiny, czynnika pochodzącego z komórek zrębu (SDF-1α), jako przykładów. Badacze pracujący nad innymi komórkami i chemokinami proszeni są o odpowiednie dostosowanie procesów eksperymentalnych.

Dzień 0: Przygotowanie komórek
1. Hoduj zapas komórek A549 w kompletnej pożywce wzrostowej zawierającej substytut L-glutaminy DMEM F12, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) przeciwbakteryjny roztwór przeciwgrzybiczy. Subkultura przez dysocjację z 0,25% trypsyną-EDTA.
2. Przygotować zawiesiny komórek do doświadczeń, odwirowując zdysocjowane komórki w temperaturze 140 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. W eksperymentach z urządzeniem mikroprzepływowym należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zasiać co najmniej 1 x 10⁶ komórek w kolbie T75 z 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej.
  UWAGA: Wszystkie procesy hodowli komórkowej przeprowadza się w inkubatorze o temperaturze 37 °C i atmosferze 5%_CO2
Dzień 1: Przygotowanie urządzenia
1. Umieść urządzenie w maszynie plazmowej_O2 i potraktuj je plazmą_O2 o mocy 90 W przez 40 sekund, aby powierzchnie kanałów mikroprzepływowych stały się hydrofilowe.
2. Natychmiast po obróbce powierzchni zainstaluj dwie igły 14 G, bezpośrednio wkładając igły do otworów o średnicy 2 mm wybitych w warstwie PDMS na wlotach kanałów gradientu chemicznego. Upewnij się, że igły nie blokują kanałów mikroprzepływowych. Pobrać 0,8 ml ddH₂O za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 14 G. Wstrzyknąć ddH₂O do kanału gradientu chemicznego od wylotu, aż woda wypłynie z obu igieł na wlotach.
3. Przygotować 1 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml, rozcieńczając bulion fibronektyny solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
4. Roztwor fibronektyny należy wlać w infuzji z wylotu kanału gradientu chemicznego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 14 G, aż roztwór wypłynie z obu igieł na wlotach.
5. Inkubuj całe urządzenie przez noc w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych.
Dzień 2: Wysiewanie komórek i obrazowanie mikroskopowe
1. Wysiewanie komórek
  1. Odessać pożywkę z komórek, które były hodowane od dnia 0 i przemyć komórki 5 ml DPBS 2 razy. Odessać DPBS, dodać 2 ml trypsyny-EDTA i inkubować komórki w inkubatorze przez 5 minut, aby oderwać komórki od powierzchni kolby.
  2. Poczekać, aż komórki zostaną odłączone i zawieszone w roztworze, a następnie dodać 8 ml pożywki niezawierającej surowicy (DMEM F12 + 1% (v/v) przeciwbakteryjny roztwór przeciwgrzybiczy) do kolby. Przenieść cały płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 140 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać odpowiednią ilość pożywki wolnej od surowicy, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 x 10⁶ komórek/ml. Wyjmij urządzenie mikroprzepływowe przygotowane w dniu 1. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub innego automatycznego przyrządu do liczenia komórek.
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą igłą o sile 14 G wstrzyknąć pożywkę pozbawioną surowicy z ujścia kanału gradientu chemicznego, aż pożywka wypłynie z obu igieł na wlotach. Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórek z wylotu kanału gradientu chemicznego.
  5. Obserwuj komorę hodowli komórkowej w urządzeniu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały wprowadzone do kanału mikroprzepływowego. Umieść urządzenie w wilgotnym pojemniku (np. plastikowym pudełku z ddH₂O w środku) i przechowuj je w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 5 godzin, aby ułatwić przyleganie komórek do powierzchni urządzenia.
2. Przygotowanie odczynników do generowania gradientów chemicznych
  1. Przygotować substancję chemiczną (SDF-1α) o pożądanym stężeniu (100 ng/ml) w podłożu bez surowicy. Narysuj pożywkę bez surowicy z substancją chemiczną i bez niej do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 μl/min do późniejszego użycia.
3. Przygotowanie odczynników do generowania gradientu tlenu
  1. Przygotować 15 ml 1 M roztworu NaOH i 15 ml 200 mg/ml roztworu pirogalolu. Pobrać roztwory NaOH i pirogalolu do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 15 ml połączonych odpowiednio z rurką PTFE o wysokiej czystości i rurką o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 5 μl/min do późniejszego użycia.
4. Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego
  1. Po 5 godzinnej inkubacji wyjmij całe urządzenie i umieść je na szalce Petriego o średnicy 15 cm. Zamocuj urządzenie na szalce Petriego za pomocą szpachli klejącej. Przenieść szalkę Petriego do mikroskopu do obrazowania żywych komórek w inkubatorze.
  2. Podłącz rurki ze strzykawek w celu generowania gradientu chemicznego do wlotów kanału gradientu chemicznego. Podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego.
  3. Podłączyć rurki o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających NaOH i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu tlenu.
  4. Dodaj około 15 ml ddH₂O do szalki Petriego, aby utrzymać nawilżenie urządzenia. Skonfiguruj mikroskop do obrazowania żywych komórek do przechwytywania obrazu poklatkowego i rób zdjęcie co 15 minut.
Dzień 3: Gromadzenie i analiza danych
1. Przenieś przechwycone pliki obrazów do komputera. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, ImageJ, z wtyczką open source do ręcznego śledzenia (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) i bezpłatnym oprogramowaniem Chemotaxis Tool (http://ibidi.com/xtproducts/en/Software-and-Image-Analysis/Manual-Image-Analysis/Chemotaxis-and-Migration-Tool)¹⁵^,¹⁶.

3. Charakterystyka gradientów

UWAGA: Gradienty chemiczne i tlenowe można scharakteryzować przed lub po eksperymentach na komórkach.

Symulacja numeryczna gradientu chemicznego
1. Oszacuj naturę przepływu laminarnego w mikrofluidyce za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów (CFD).
Eksperymentalna charakterystyka gradientu tlenu
1. Przygotować wrażliwy na tlen barwnik fluorescencyjny, sześciowodny chlorek tris(2,2′-bipirydylo)rutenu(III), roztwór w wodzie o stężeniu 5 mg/ml.
2. Pobrać wrażliwy na tlen roztwór barwnika do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 μl/min (identycznym z natężeniem przepływu używanym do generowania gradientu chemicznego).
3. Podłączyć rurkę ze strzykawek do wlotów kanału gradientu chemicznego. Podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego.
4. Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, w którym światło wzbudzenia przechodzi przez filtr optyczny 470 ± 20 nm. Zbieraj światło emisyjne przez długoprzepustowy filtr emisyjny 515 nm za pomocą chłodnej kamery CCD.
5. Podłączyć rurki o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających NaOH i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu tlenu.
6. Zbierz obrazy fluorescencyjne wrażliwego na tlen barwnika przepływającego w komorze hodowli komórkowej.
7. Zatrzymaj przepływ w celu wytworzenia gradientu tlenu i odłącz wszystkie rurki od kanału wytwarzania tlenu. Podłącz rurki o wysokiej czystości z butli gazowych do wylotu kanału gradientu tlenu.
8. Zbierz obrazy fluorescencyjne wrażliwego na tlen barwnika przepływającego w komorze hodowli komórkowej, gdy przepływa powietrze, czysty azot i czysty tlen do rurki podłączonej do kanału gradientu tlenu.
9. Oszacuj gradienty tlenu, analizując obrazy fluorescencji przy użyciu równania Sterna-Volmera zgodnie z odniesieniami 10 i 11.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfabrykowane hybrydowe urządzenie do hodowli komórek mikroprzepływowych PDMS-PC. Rys. 1 przedstawia zdjęcie i ilustrację urządzenia mikroprzepływowego. Dolna warstwa zawiera cztery poziomy kanałów w kształcie serpentyn do generowania roztworów z odczynników wprowadzonych z dwóch oddzielnych wlotów o sześciu różnych proporcjach mieszania. Teoretycznie sześć różnych proporcji mieszania to 1:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 i 0:1 (po lewej:po prawej) między dwoma roztworami wprowadzonymi z wlotów. Gradienty chemiczne zbudowane przez sześć roztworów o różnych proporcjach mieszania mogą być generowane w komorze hodowli komórkowej, znajdującej się poniżej. Górna i dolna warstwa są oddzielone membraną PDMS. W górnej warstwie odczynniki do reakcji chemicznej oczyszczania tlenu są wprowadzane do kanału mikroprzepływowego z dwóch oddzielnych wlotów. Odczynniki są mieszane ze sobą w celu przeprowadzenia reakcji bezpośrednio przed przelaniem na wierzch komory hodowli komórkowej w celu usunięcia tlenu z dolnego kanału, bez bezpośredniego kontaktu chemicznego. Wbudowana folia PC, o mniejszym współczynniku dyfuzji gazu w porównaniu z PDMS, działa jak bariera dyfuzyjna, która sprawia, że oczyszczanie tlenu jest bardziej wydajne. Tlen stopniowo dyfunduje z powrotem do komory hodowli komórkowej przez PDMS w obszarze poniżej, tworząc gradient tlenu wzdłuż kierunku przepływu. Ponieważ reakcja chemiczna wychwytywania tlenu jest ograniczona przestrzennie, wpływa to tylko na lokalne napięcia tlenu. W rezultacie, urządzenie może być używane w konwencjonalnym inkubatorze komórkowym bez zmiany jego globalnego ciśnienia tlenu. W eksperymentach migracyjnych komórki są wysiewane w komorze hodowli komórkowej w celu obserwacji. Pożywka wzrostowa i odczynniki chemiczne są wprowadzane do urządzenia za pomocą pomp strzykawkowych o precyzyjnie kontrolowanych natężeniach przepływu.

Charakterystyka gradientów chemicznych i tlenowych generowanych wewnątrz urządzenia. Ze względu na naturę przepływu laminarnego w mikrofluidyce, zachowania przepływu można przewidzieć za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów (CFD). W tym artykule skonstruowaliśmy model 3D i przeprowadziliśmy symulację przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania do modelowania wielofizycznego. Rys. 2(a) przedstawia porównanie eksperymentalnie scharakteryzowanych profili stężeń fluoresceiny na całej szerokości komory hodowli komórkowej w oparciu o pomiary intensywności fluorescencji z wynikami symulacji numerycznych. Zgodność między wynikami eksperymentu i symulacji sugeruje, że model CFD może dobrze oszacować gradienty chemiczne generowane wewnątrz urządzenia. Rys. 2(b) przedstawia symulowany gradient SDF-1α generowany w komorze hodowli komórkowej. Rys. 3 przedstawia wyniki charakterystyki gradientu tlenu poprzez przepływ wrażliwego na tlen barwnika fluorescencyjnego do komory hodowli komórkowej przed eksperymentami na komórkach. Wynik wskazuje, że gradient tlenu, w zakresie od około 1 do 16%, można ustalić za pomocą wyżej wymienionego protokołu.

Wyniki migracji komórek. Jako demonstrację przeprowadziliśmy badania migracji komórek A549 w 4 kombinacjach gradientów chemokin (SDF-1α) i tlenu: (1) bez chemokiny i bez gradientów tlenu jako kontrola, (2) z gradientem chemokin i bez gradientu tlenu, (3) z gradientem tlenu i bez gradientu chemokin oraz (4) zarówno z gradientami chemokiny, jak i tlenu. Na rys. 4 przedstawiono zdjęcie całego układu doświadczalnego. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych z całym zestawem (w tym urządzeniami mikroprzepływowymi, pompami strzykawkowymi i mikroskopami do obrazowania żywych komórek) umieszczonymi w środku. Wyniki migracji komórek przedstawiono na ryc. 5. Rys. 5 (a) przedstawia obrazy zebrane podczas eksperymentów przy użyciu analizatora obrazowania żywych komórek, a rys. 5 (b) i (c) przedstawia trajektorie migracji komórek i średnie ruchy w czterech kombinacjach analizowanych przez oprogramowanie ImageJ z wtyczkami. Wyniki pokazują, że średnia odległość migracji komórek w grupie kontrolnej zbliża się do zera, co sugeruje losowy ruch komórek w eksperymencie. W przeciwieństwie do tego, przy samym gradiencie chemokin, średni ruch komórek odbywa się w lewo, gdzie stężenie SDF-1α jest wyższe. Wyniki sugerują chemotaksję komórek A549 w wyniku chemotaksji SDF-1α, o czym informowano już wcześniej. W eksperymencie, w którym występują tylko gradienty tlenu, średni ruch komórek odbywa się w górę, gdzie ciśnienie tlenu jest niższe. Co ciekawsze, w eksperymencie z prostopadłymi gradientami chemokin i tlenu, średni ruch komórek odbywa się w górę i bez żadnego widocznego ruchu w kierunku poziomym (kierunek gradientu chemokin

figure-results-1
Rysunek 1: Wyprodukowane urządzenie do mikroprzepływowej hodowli komórkowej PDMS-PC. a) Eksperymentalne zdjęcie wytworzonego urządzenia zdolnego do niezawodnego generowania prostopadłych gradientów chemicznych i tlenu do badań migracji komórek. Kanał gradientu chemicznego jest wypełniony niebieskimi i żółtymi barwnikami spożywczymi, aby zademonstrować wytwarzanie gradientu w komorze hodowli komórkowej. Kanał gradientu tlenu jest wypełniony czerwonym barwnikiem spożywczym. Podziałka wynosi 1 cm. (b) Schemat urządzenia mikroprzepływowego. Górna warstwa jest wytwarzana przy użyciu PDMS z wbudowaną warstwą PC jako barierą dyfuzyjną dla efektywnej kontroli gradientu tlenu wewnątrz komory hodowli komórkowej. (c) Formy wzorcowe do wytwarzania górnej i dolnej warstwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Gradient chemiczny wewnątrz mikroprzepływowego urządzenia do hodowli komórek. (a) Symulowany numerycznie i scharakteryzowany doświadczalnie gradient stężenia fluoresceiny wewnątrz komory hodowli komórkowej na całej szerokości komory hodowli komórkowej (kierunek Y). Podobieństwo między symulowanymi i eksperymentalnie zmierzonymi gradientami wskazuje, że symulacja może dobrze przewidzieć gradient chemiczny. Wstawka rysunku przedstawia trójwymiarowy (3D) model skonstruowany na potrzeby symulacji. b) Wynik symulacji numerycznej gradientu chemokin SDF-1α na całej szerokości komory hodowli komórkowej do badań migracji komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Gradient tlenu wewnątrz mikroprzepływowego urządzenia do hodowli komórek. Eksperymentalnie zmierzono gradienty tlenu w komorze hodowli komórkowej wzdłuż kierunku przepływu. Gradienty oszacowano za pomocą wrażliwego na tlen barwnika fluorescencyjnego i analizy obrazu. Scharakteryzowano gradienty od lewej do prawej strony komory, a wyniki pokazują spójne profile gradientu na całej szerokości komory.

figure-results-4
Rysunek 4: Zdjęcia konfiguracji eksperymentalnej. Cała konfiguracja, w tym urządzenia mikroprzepływowe, pompy strzykawkowe i mikroskop do obrazowania żywych komórek, jest umieszczana w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych w celu zoptymalizowania warunków hodowli komórek podczas eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 5: Wyniki badania migracji komórek w prostopadłych gradientach SDF-1α i tlenu. (a) Obrazy wykonane przed i po 12-godzinnym badaniu migracji komórek. Ścieżki migracji komórek można analizować na podstawie przechwyconych obrazów poklatkowych za pomocą mikroskopu do obrazowania żywych komórek. (b) Ścieżki migracji komórek i analizowany średni ruch migracji na podstawie przechwyconych obrazów w 4 różnych kombinacjach gradientów: brak gradientu, tylko gradient chemokin, tylko gradient tlenu oraz gradienty zarówno chemokin, jak i tlenu. Zdjęcia były wykonywane co 15 minut. Podziałka wynosi 250 μm. (c) Wykresy średnich odległości migracji komórek w kierunku prostopadłym (gradient tlenu) i poziomym (gradient chemokiny) pod czterema różnymi kombinacjami gradientu. Dane są wyrażone jako średnia ± SD, uzyskana z trzech niezależnych zestawów eksperymentalnych, a w każdym eksperymencie analizowano 10 komórek. Istotne statystycznie odmienne wyniki (niesparowany test t-Studenta, p < 0,01) są oznaczone różnymi literami (a i b). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznymi krokami do wytworzenia urządzenia mikroprzepływowego PDMS z wbudowaną cienką folią PC są: (1) usunięcie wszystkich pęcherzyków podczas wkładania folii PC do prepolimeru PDMS podczas wytwarzania górnej warstwy PDMS-PC oraz (2) upewnienie się, że wszystkie procesy utwardzania PDMS są wykonywane na dobrze wypoziomowanej płaszczyźnie poziomej. W przypadku eksperymentów z migracją komórek najbardziej krytycznymi krokami są: (1) eliminacja pęcherzyków w urządzeniu mikroprzepływowym, rurkach i pompach strzykawkowych podczas eksperymentów; (2) zapewnienie, że urządzenie mikroprzepływowe jest umieszczone na dobrze wypoziomowanej płaszczyźnie poziomej podczas obrazowania żywych komórek w celu obserwacji migracji komórek; oraz (3) utrzymywanie urządzenia w stanie nawilżenia poprzez dodawanie ddH₂O do szalki Petriego podczas eksperymentów i upewnianie się, że woda nie jest wysuszona.

Aby skutecznie wytworzyć hybrydowe urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC bez rozwarstwiania, konieczne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków podczas wkładania folii PC. Folię PC można powoli wkładać pod kątem (około 15 do 30 stopni od powierzchni prepolimeru PDMS), aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków podczas wkładania folii PC do prepolimeru PDMS. W razie potrzeby cały prepolimer PDMS z wbudowaną folią PC można umieścić w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej na 10 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków. Jeśli folia PC unosi się w górę po procesie próżniowym, można użyć końcówki pipety, aby docisnąć folię PC do utwardzonej warstwy PDMS. W razie potrzeby powtórz procesy odkurzania i prasowania.

W przypadku eksperymentów komórkowych brak pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla mikroprzepływowej hodowli komórek. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są wprowadzane do całego zestawu mikroprzepływowego (w tym pomp strzykawkowych, przewodów i urządzenia mikroprzepływowego) podczas wykonywania połączeń. Jeśli pęcherzyki powietrza powstają w układzie mikroprzepływowym z powodu spadku rozpuszczalności gazów w podwyższonej temperaturze eksperymentów wewnątrz inkubatora, wszystkie składniki eksperymentalne (w tym strzykawki i rurki) i odczynniki (w tym pożywkę wzrostową, pirogalol i NaOH) można wcześniej umieścić w inkubatorze (co najmniej 20 minut przed użyciem), aby zminimalizować zmiany temperatury. Pompy strzykawkowe często wytwarzają ciepło w wyniku działania silników w pompach. Zazwyczaj dopuszczalne jest używanie pomp strzykawkowych wewnątrz inkubatorów; Należy jednak sprawdzić temperaturę inkubatora podczas eksperymentów. Jeśli temperatura wzrośnie podczas eksperymentów, należy przeprowadzić dodatkowe procedury chłodzenia. Można zastosować kilka możliwych metod chłodzenia, takich jak umieszczenie pudełka z lodem w inkubatorze, zmniejszenie liczby pomp strzykawkowych umieszczonych wewnątrz inkubatora lub użycie inkubatora z systemem chłodzenia siłowego.

Opracowane w tym artykule mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórek PDMS-PC jest w stanie niezawodnie generować prostopadłe gradienty chemiczne i tlenowe do badań migracji komórek. Ograniczeniem opracowanego urządzenia jest to, że generowane profile gradientu tlenu zależą od równowagi między strumieniem tlenu, napędzanym przez oczyszczanie reakcji chemicznych, a dyfuzją tlenu z atmosfery otoczenia, przez urządzenie i do medium. W rezultacie profile gradientu tlenu nie mogą być dowolnie kontrolowane wewnątrz urządzenia. W porównaniu z istniejącymi mikroprzepływowymi platformami do hodowli komórek, urządzenie opracowane w tym artykule jest pierwszym zdolnym do przeprowadzania badań hodowli komórkowych w połączeniu z gradientami chemicznymi i tlenowymi. Całe urządzenie można wytworzyć przy użyciu konwencjonalnego procesu formowania replik miękkiej litografii, bez żmudnego wyrównywania i kosztownego oprzyrządowania. Gradienty mogą być symulowane numerycznie i charakteryzowane eksperymentalnie, aby zapewnić bardziej fizjologiczne warunki podobne do mikrośrodowiska do badań komórkowych in vitro . Dzięki zastosowaniu ograniczonej przestrzennie metody reakcji chemicznej z folią PC jako barierą dyfuzyjną gazu, gradient tlenu można wygenerować bez użycia butli z gazem pod ciśnieniem i zaawansowanych jednostek kontroli przepływu gazu. Ponadto konfiguracja wymaga tylko niewielkich ilości chemikaliów (mniej niż 10 ml dziennie), aby utrzymać gradienty tlenu. Ponieważ kontrola napięcia tlenu jest ograniczona lokalnie wokół kanału mikroprzepływowego i nie zakłóca stężenia tlenu w otoczeniu, cały zestaw można umieścić w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych bez dodatkowego oprzyrządowania do kontroli temperatury, wilgotności i_CO2 . W związku z tym opracowane urządzenie ma ogromny potencjał do praktycznego zastosowania w laboratoriach biologicznych.

Ze względu na ograniczenia techniczne, zachowania komórek pod ciśnieniem tlenu rzadko były badane w istniejącej literaturze. Za pomocą urządzenia opracowanego w tym artykule, hodowla komórkowa w gradientach tlenu może być przeprowadzana w łatwy sposób, który znacznie sprzyja badaniom komórek w gradientach tlenu. Co więcej, podobną zasadę działania można zastosować do generowania innych fizjologicznie istotnych gradientów gazowych, takich jak dwutlenek węgla i tlenek azotu, w badaniach hodowli komórkowych in vitro ¹⁷. Możliwości te pokazują, że urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC wykazuje ogromny potencjał w różnych zastosowaniach w hodowlach komórkowych, w tym w testowaniu leków oraz testach proliferacji i migracji komórek, w celu przyspieszenia badań nad hodowlami komórkowymi in vitro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł jest oparty na pracy wspieranej przez National Health Research Institutes (NHRI) na Tajwanie w ramach Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), Tajwańskie Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), Projekt Tematyczny Academia Sinica (AS-105-TP-A06) oraz Program Badawczy w Nanonauce i Nanotechnologii. Autorzy pragną podziękować Pani Rachel A. Lucas za korektę manuskryptu.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Strzykawka 1 ml	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302104
1,5 ml Probówka do mikrowirówek	Smartgene	6011-000
Strzykawka 10 ml	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302151
15 ml Probówka wirówkowa	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 352096
150 mm	szalka Petriego Dogger Science	DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilan	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	78560-45-9
ml Strzykawka	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302118
4-calowy atrapa krzemu Wafel	Wollemi Technical, Taoyuan, Tajwan
Aceton	ECHO Chemical, Miaoli, Tajwan	AH3102-000000-72EC
AG Nakładka na maskę z podwójną ekspozycją	M& R Nano Technology, Taoyuan, Tajwan	AG500-4D-D-V-S-H
Roztwór antybiotykowo-antymiotyczny	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 15240-062
Dziurkacz do biopsji	Miltex, Plainsboro, NJ	33-31
igła	JensenGlobal, Santa Barbara, CA	Miernik 14
Hemocytometr jasnej linii	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Z359629	do zliczania komórek
Buffered Oxide Etch	ECHO Chemical, Miaoli, Tajwan	PH3101-000000-72EC
Inkubator kultur komórkowych	Caron, Marietta, OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL, Burlington, MA	Ver. 4.3b	do numerycznej symulacji gradientów chemicznych w urządzeniu
D-PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 14190-144
Desicattor	A-VAC Industries, Anaheim, CA	35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 10565-018
Surowica bydlęca	płodu ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 10082
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F2006
Odwrócony Mikroskop fluorescencyjny	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	DMIL LED
Alkohol izopropylowy (IPA)	ECHO Chemical, Miaoli, Tajwan	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek, Seul, Korea	Mechaniczny piec konferencyjny DBJ01B
	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	Showa Chemical Industry, Tokio, Japonia	1943-0150
System pomiaru plazmy	Nordson MARCH, Concord CA	PX-250	do plazmowej obróbki powierzchni plazmą tlenową
Folia poliwęglanowa (PC)	Quantum Beam Technologies, Tainan Tajwan
Polidimehtylsiloksan (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI	SYLGARD 184
Pirogalol	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	A13405
Usuwalna szpachlówka samoprzylepna	3M	860
Wirówka stołowa Sorvall Legend Mach 1.6R	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA
Spin	Coater ELS Technology, Hsinchu, Tajwan	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem, Westborough, MA	SU-8 2050
SU-8 Developer	MicroChem, Westborough, MA	Y020100
Ostrze chirurgiczne	Feather, Osaka, Japonia	5005093	do cięcia PDMS
Pompa strzykawkowa	Chemyx, Houston, TX	Termos do hodowli komórkowych Fusion 400
T75	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	Nunc 156367
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 25200
Rurki PTFE Tygon	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Rurki Tygon	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH	621

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).">Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).
The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).">Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).">Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).">Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).">Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).">Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).">Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).">McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).">Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).">Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).">Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).">Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).">Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).">Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).">Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).">Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).">Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles