Artykuł metodologiczny

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty u myszy

DOI:

10.3791/55293

⸱

14 marca 2017

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, 2College of Arts and Science, New York University, 3Department of Health Technology and Informatics, Faculty of Health and Social Sciences, The Hong Kong Polytechnic University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC) zachowuje podstawowe cechy regularnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC), eliminując jednocześnie użycie respiratora z intubacją tchawiczą. Okazuje się, że jest to wysoce pożądana metoda w wysokoprzepustowych badaniach przeciążenia lewej komory, szczególnie w badaniach translacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC) jest bardziej pożądaną metodą zwężenia aorty poprzecznej u myszy niż standardowe zwężenie poprzeczne aorty (TAC) z otwartą klatką piersiową. Chociaż poprzeczne zwężenie aorty jest wysoce funkcjonalną metodą indukcji wysokiego ciśnienia w lewej komorze, jest to procedura trudniejsza i bardziej długotrwała ze względu na zastosowanie sztucznej wentylacji z intubacją tchawicy. TAC jest również często mniej przeżywalny, ponieważ nowsza metoda, MTAC, nie wymaga przecinania żeber i mięśni międzyżebrowych ani intubacji tchawicy z konfiguracją wentylacyjną. W MTAC, w przeciwieństwie do torakotomii w celu uzyskania dostępu do jamy klatki piersiowej, do łuku aorty dociera się przez nacięcie w linii środkowej w przedniej części szyi. Tarczyca jest odciągnięta do tyłu, aby odsłonić wcięcie mostka. Mostek jest następnie przycinany do drugiego poziomu żeber, a do łuku aorty dociera się po prostu poprzez oddzielenie tkanek łącznych i grasicy. Stamtąd szew można owinąć wokół łuku i zawiązać przekładką, a następnie naciąć mostek i skórę można zamknąć. MTAC jest znacznie szybszym i mniej inwazyjnym sposobem indukcji nadciśnienia lewokomorowego i umożliwia przeprowadzenie badań wysokoprzepustowych. Powodzenie zwężenia można zweryfikować za pomocą echokardiografii przezklatkowej o wysokiej częstotliwości, w szczególności Dopplera kolorowego i Dopplera z falą pulsacyjną, w celu określenia prędkości przepływu łuku aorty oraz lewej i prawej tętnicy szyjnej, wymiaru naczyń krwionośnych oraz funkcji i morfologii lewej komory. Skuteczne zwężenie wywoła również istotne zmiany histopatologiczne, takie jak przerost komórek mięśnia sercowego ze zwłóknieniem śródmiąższowym i okołonaczyniowym. W tym miejscu opisano procedurę MTAC, pokazując, w jaki sposób wynikające z tego zmiany przepływu w tętnicach szyjnych można badać za pomocą echokardiografii, morfologii ogólnej i zmian histopatologicznych w sercu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tego artykułu jest pokazanie, jak można zmodyfikować poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy, aby uzyskać prostszą i bardziej celową operację. TAC został po raz pierwszy wprowadzony w 1991 roku1 i umożliwił biologom molekularnym badanie szlaków komórkowych i molekularnych, które prowadzą do przerostu w lewej komorze i niewydolności serca, szczególnie u małych zwierząt ze zmanipulowanymi genomami2,3,4,5,6. Pomimo swojej skuteczności w wytwarzaniu pożądanego przeciążenia ciśnieniowego, technika ta jest ostatecznie ograniczona przez trudności w wykonaniu zabiegu i niski wskaźnik przeżycia. Chirurg przeprowadzający TAC musi być w stanie wykonać intubację dotchawiczą, torakotomię i zastosować sztuczną wentylację, aby zapobiec zapadnięciu się płuc1.

Często pożądana jest prosta i mniej inwazyjna metoda. W związku z tym opracowano minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC)3. Chociaż wynik (w szczególności przerost lewej komory) jest taki sam, procedura obejmuje znacznie mniej aparatów i mniejsze uszkodzenia zwierzęcia. MTAC okazuje się być pożądaną metodą, która ma większy wskaźnik przeżycia, powyżej 90%, a czas operacji wynosi zaledwie 15 do 25 minut. Rzadkie przypadki zgonów po udanej operacji można przypisać zbyt ciasnemu zwężeniu łuku aorty, co skutkuje ogromnym przeciążeniem lewej komory i śmiertelnym zmniejszeniem dopływu krwi do krytycznych narządów, takich jak nerki.

Po zakończeniu procedury, echokardiografia może być wykorzystana do oceny skuteczności bandingu oraz morfologii i funkcji serca. System ultrasonograficzny o wysokiej częstotliwości może być wykorzystany do pomiaru średnicy i zmian przepływu w lewej i prawej tętnicy szyjnej, do wizualizacji zwężenia łuku aorty w celu pomiarów szczytowej prędkości przepływu oraz do określenia grubości ściany lewej komory i parametrów funkcjonalnych7,8. Po eutanazji narządy można również pobrać do badań histopatologicznych z barwieniem hematoksyliną i eozyną oraz barwieniem kolagenu Picrosirius, przy czym to ostatnie jest szczególnie przydatne do obserwacji zwłóknienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt w Nauczaniu i Badaniach (CULATR) na Uniwersytecie w Hongkongu.

1. Przygotowanie miejsca operacji

  1. Zdezynfekować miejsce operacji 75% alkoholem izopropylowym. Dostosuj temperaturę poduszki grzewczej do 37 °C, aby uniknąć zmian w częstości akcji serca i oddechu badanego zwierzęcia.
  2. Używać narzędzi chirurgicznych wysterylizowanych w grawitacyjnym sterylizatorze wyporowym w temperaturze 121 °C przez 30 min lub innymi odpowiednimi metodami.
  3. Weź 2 - 4 igły o rozmiarze 30 i wyginaj je za pomocą uchwytu na igłę, jak pokazano na rysunku 1, aby stworzyć narzędzie do podwiązania i separacji tkanek oraz do użycia jako retraktor. Zamontuj teraz zakrzywioną igłę na bawełnianym aplikatorze do użytku w chirurgii.
  4. Stępić igłę o rozmiarze 27 i wygiąć ją pod kątem 90º za pomocą uchwytu igły. Wygładź końcówkę, pocierając twardą powierzchnię, aby uzyskać przekładkę 0,4 mm w kroku podwiązywania.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Znieczulenie 2-miesięcznego samca o wadze 22-25 g myszy C57BL/6N należy znieczulić odpowiednią mieszaniną ketaminy i ksylazyny w stosunku do masy ciała: 100 mg/kg + 10 mg/kg i.p. Potwierdzić znieczulenie ujemnym odruchem szczypania ogona.
  2. Usuń włosy z przedniej części szyi i klatki piersiowej, nakładając krem do depilacji na 2 do 3 minut. Usuń krem ciepłą wodą i bawełnianym aplikatorem.
  3. Nałóż maść lub żel okulistyczny na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Ułóż zwierzę na poduszce grzewczej w pozycji leżącej na plecach i prowadź monitorowanie śródoperacyjne, pamiętając o prowadzeniu odpowiedniej dokumentacji co 15 minut.
  5. Użyj papierowej taśmy chirurgicznej, aby przymocować kończyny do poduszki grzewczej, aby utrzymać zwierzę we właściwej pozycji podczas operacji.
  6. Zdezynfekuj skórę na przemian trzykrotnie alkoholem i roztworem jodu powidonu.
  7. Użyj sterylnej serwety z odsłoniętym polem operacyjnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Używaj nowych sterylnych rękawiczek dla każdej myszy i w razie potrzeby.

3. Procedura podwiązania

  1. Otwórz skórę myszy w pozycji środkowej szyi i klatki piersiowej za pomocą skalpela.
  2. Pociągnij tarczycę w kierunku głowy, delikatnie oddzielając tkanki łączne nożyczkami.
  3. Oddziel warstwę mięśni na tchawicy na linii środkowej w kierunku obu stron za pomocą zakrzywionych igieł.
  4. Za pomocą nożyczek przetnij mostek do drugiego żebra (około 5 mm). Otwórz cięcie za pomocą retraktora lub zakrzywionych kleszczy.
  5. Oddziel płaty grasicy od siebie i dolną ścianę klatki piersiowej, oddzielając tkankę łączną zakrzywioną igłą; w tym miejscu wyraźnie widoczny będzie poprzeczny łuk aorty i dwie tętnice szyjne
    6. .
  6. Umieść zakrzywioną igłę pod łukiem i przebij między ścianą naczynia a tkanką łączną po drugiej stronie, wypychając zakrzywioną główkę.
  7. Za pomocą zakrzywionej igły przeciągnij szew monofilamentowy 6-0 pod łukiem aorty.
  8. Umieść przekładkę w pętli i przymocuj szew za pomocą podwójnego węzła. Delikatnie zdejmij przekładkę.
  9. Potwierdź udane zwężenie z pozycją węzła i odetnij końce szwu.
  10. Zamknij ścianę klatki piersiowej za pomocą jedwabnego szwu 6/0 z prostym przerywanym wzorem szwów. Zamknij skórę szwem monofilamentowym 6/0 w ciągłym wzorze szwów.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Nałóż roztwór jodu powidonu na miejsce szwu i umieść zwierzę we wstępnie ogrzanej klatce w celu rekonwalescencji i monitorowania pooperacyjnego.
  2. Buprenorfinę należy wstrzykiwać (0,05 - 0,1 mg/kg s.c. co 12 godzin) po odzyskaniu przytomności przez zwierzę w celu złagodzenia bólu i dostarczenia myszy odpowiedniego miękkiego pokarmu.
  3. Po pełnym wyzdrowieniu zwierzę należy umieścić w 12-godzinnym pomieszczeniu w cyklu jasnym/ciemnym.

5. Echokardiografia: potwierdzenie udanego podwiązania i pomiarów

  1. Po tygodniu znieczulij wcześniej prążkowaną mysz 3 - 5% izofluranem do indukcji i 1 - 1,5% do konserwacji, przy natężeniu przepływu tlenu 1 l/min.
  2. Usuń włosy na klatce piersiowej za pomocą kremu do depilacji. Dokładnie usuń krem ciepłą wodą i bawełnianym aplikatorem.
  3. Przymocuj mysz w pozycji leżącej na plecach do platformy do przenoszenia zwierząt, utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Nałóż żel elektrodowy na łapki i przyklej je do podkładki za pomocą elektrod.
  4. Nałóż żel ultradźwiękowy na klatkę piersiową myszy. Za pomocą sondy MS550D 40 MHz i systemu ultrasonograficznego wysokiej częstotliwości można wykonać kolorowy skan Dopplera i Dopplera falą pulsacyjną na lewej i prawej tętnicy szyjnej, a także na łuku aorty.
  5. Korzystając z trybu B, zlokalizuj lewą komorę. Za pomocą trybu M można zmierzyć skurczową i rozkurczową grubość ścianki. Użyj Cine Store i Frame Store, aby zapisać dane i obrazy zgodnie z wymaganiami.
  6. Korzystając z trybu B, zlokalizuj lewą tętnicę szyjną wspólną przed punktem rozgałęzienia. Użyj fali pulsacyjnej i kolorowego Dopplera, aby ocenić przepływ. Powtórz z prawą tętnicą szyjną w podobnym punkcie. Zapisz obrazy w trybach Cine Store i Frame Store, aby przeanalizować je później.
  7. Przechyl platformę do obsługi zwierząt maksymalnie w lewo, tak aby mysz znalazła się w lewej pozycji odleżynowa. Umieść sondę na myszy, przesuniętą o 30° od pozycji równoległej do głowy w pozycji przymostkowej i manipuluj X i Y, aby znaleźć łuk aorty.
  8. Zlokalizuj zwężenie. Użyj trybu kolorowego Dopplera, aby miejsce zwężenia było bardziej widoczne, ponieważ krew będzie przepływać przez wąski kanał między punktem, w którym dwie tętnice szyjne rozgałęziają się od łuku aorty.
  9. Użyj fali pulsacyjnej i kolorowego Dopplera, aby zmierzyć szczytową prędkość przepływu. Użyj Cine Store i Frame Store, aby zapisać dane i obrazy zgodnie z wymaganiami.
  10. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej w pozycji leżącej. Zwróć zwierzę do pierwotnej klatki w 12-godzinnym pomieszczeniu z cyklem światła/ciemności po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MTAC umożliwia indukcję znacznego nadciśnienia w lewej komorze w odpowiednim czasie.

Jak widać na rysunku 1, przygotowanie podstawowych narzędzi do zabiegu jest proste i minimalne, wymaga jedynie 2 - 4 igieł o rozmiarze 30, które muszą być zgięte i przytrzymane na miejscu za pomocą rurki poliuretanowej. Sam zabieg chirurgiczny jest również mniej skomplikowany w porównaniu do TAC i można go łatwo wykonać. Po cofn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rockman i współpracownicy opracowali pierwszą metodę opaski aortalnej jako metodę badania przeciążenia ciśnieniem w sercu. Umożliwiło to rozpoczęcie badań nad komórkowymi i molekularnymi konsekwencjami nadciśnienia tętniczego i niewydolności serca1. Ulepszona metoda, minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC), zapewnia łagodną, zależną od czasu metodę indukcji przeciążenia ciśnieniem w lewej komorze i niewydolności serca, bez wad konwencjonalnego poprzecznego zwężenia aorty

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Uniwersyteckiemu Ośrodku Badawczemu w Naukach Przyrodniczych (ULS) Uniwersytetu Politechnicznego w Hongkongu za dostarczenie systemu ultrasonograficznego Vevo 2100. Specjalne podziękowania dla dr Chunyi Wen z Interdyscyplinarnego Wydziału Inżynierii Biomedycznej Politechniki w Hongkongu za szkolenie i pomoc. Praca ta była wspierana przez rząd Hongkongu RGC Grant GRF 17127215, 764812 i HKU6/CRF/11G dla Billy'ego K C Chow.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-calowe igły o rozmiarze 30BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA. 305128Zakrzywiony jak w procedurze i Rysunek 1
27 Gauge NeedleBD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA. 301629Spraw, aby był i gładki dla dystans
6/0 DafilonB. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Niemcy.C0933066
6/0 SilkamB. Braun, 34212 Melsungen, Hesja, Niemcy.C0762067
Sterylne rękawiceA.R. Medicom, Inc (Azja), Hongkong.
Cotton ApplicatorMannings, Quarry Bay, Hongkong.Lokalne centrum handlowe
Depilatory CreamVeet (Hongkong), Kwun Tong, Kowloon, Hong KongLocal Shopping Center
Lexer-Baby ScissorFST, Kolumbia Brytyjska V7H 0A6, Kanada.14078-10
Zakrzywiony kleszcz do tęczówkiFST, Kolumbia Brytyjska V7H 0A6, Kanada.11065-07
Micro Olsen-Hegar Uchwyt na igłyWPI, Sarasota, FL 34240, USA. 501989
Stereo MicrioscopeWPI, Sarasota, FL 34240, USA. PZMIII-BS
strong>GenTeal Eye GelNovartis, East Hanover, NJ 07936, USA. Lokalna apteka
Poduszka grzewczaKent Scientific Corporation, Torrington, CT 06790, USA. DCT-20
Taśma chirurgicznadla zwierząt laboratoryjnych
ketamina i ksylazynazwierząt laboratoryjnych
betadynazwierząt laboratoryjnych
BuprenorfinaJednostkadla zwierząt laboratoryjnych
<Jednostka Jednostka dla Jednostka dla

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 8277-8281 (1991).
  2. de Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
  3. Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (3), H1261-H1269 (2003).
  4. Shimizu, I., et al. Excessive cardiac insulin signaling exacerbates systolic dysfunction induced by pressure overload in rodents. J Clin Invest. 120 (5), 1506-1514 (2010).
  5. Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods Mol Biol. 573, 115-137 (2009).
  6. Zhang, X., et al. A modified murine model for the study of reverse cardiac remodelling. Exp Clin Cardiol. 18 (2), e115-e117 (2013).
  7. Hartley, C. J., et al. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med Biol. 34 (6), 892-901 (2008).
  8. Scherrer-Crosbie, M., Thibault, H. B. Echocardiography in translational research: of mice and men. J Am Soc Echocardiogr. 21 (10), 1083-1092 (2008).
  9. Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: reduced peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J Thorac Cardiovasc Surg. 141 (2), 492-500 (2011).
  10. Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. J Vis Exp. (112), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Minimalnie inwazyjne TACprzerost lewej komoryechokardiografia wysokiej cz stotliwo cianaliza kolorowego Doppleradoppler pulsacyjnytechnika naci cia mostkapodwi zanie uku aortyprzerost mi nia sercowegozmiany histopatologiczne

Powiązane artykuły