Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55300

⸱

9 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Engineering Science and Mechanics Program, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biological Systems Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Streszczenie

Opracowaliśmy interfejs abiotyczno-biotyczny, który pozwala komórkom inżynieryjnym kontrolować właściwości materialne funkcjonalizowanej powierzchni. System ten składa się z dwóch modułów: syntetycznie zmodyfikowanego szczepu komórek E. coli oraz funkcjonalizowanego interfejsu materiałowego. W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół inżynierii genetycznej wybranych zachowań w obrębie szczepu E. coli przy użyciu strategii klonowania molekularnego. Po opracowaniu, szczep ten wytwarza podwyższony poziom biotyny pod wpływem induktora chemicznego. Dodatkowo szczegółowo opisujemy protokoły tworzenia dwóch różnych funkcjonalizowanych powierzchni, z których każda jest w stanie reagować na biotynę syntetyzowaną przez komórki. Podsumowując, przedstawiamy metodologię tworzenia połączonego, abiotyczno-biotycznego systemu, który pozwala zmodyfikowanym komórkom kontrolować skład materiału i montaż na podłożach nieożywionych.

Wprowadzenie

Tutaj opisujemy procedury tworzenia programowalnego substratu zdolnego do reagowania na sygnał chemiczny z zaprojektowanej linii komórkowej. 1 Robimy to, tworząc interfejs biotyna-streptawidyna, który reaguje na biotynę wytwarzaną przez syntetycznie modyfikowane komórki Escherichia coli (E. coli). Wcześniej programowalne powierzchnie były projektowane z myślą o szerokim zakresie zastosowań, od wykrywania toksyn 2 i diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem3 po obronę i bezpieczeństwo. 4 Podczas gdy programowalne powierzchnie mogą być użyteczne jako czujniki i siłowniki, można je uczynić "inteligentniejszymi" poprzez wyposażenie ich w zdolność adaptacji do różnych wyzwań środowiskowych. W przeciwieństwie do tego, nawet proste mikroorganizmy, takie jak E. coli, mają wrodzone zdolności adaptacyjne i są w stanie reagować na wyzwania za pomocą wyrafinowanych i często nieoczekiwanych rozwiązań. Ta zdolność adaptacji umożliwiła populacjom E. coli, kontrolowanym przez ich złożone sieci genów, efektywne kosztowo poszukiwanie zasobów,5 tworzyć produkty o wartości dodanej,6, a nawet napędzać robotykę na mikroskalę. 7 Łącząc adaptacyjne zalety żywych komórek z wykorzystaniem programowalnych powierzchni, możemy stworzyć inteligentne podłoże zdolne do reagowania na różne warunki środowiskowe.

Biologia syntetyczna dała naukowcom nowe możliwości programowania zachowania organizmów żywych. Poprzez modyfikację komórek tak, aby zawierały nowe sieci regulacyjne genów, naukowcy mogą projektować komórki, które wykazują szereg zaprogramowanych zachowań. 8,9 Poza badaniami podstawowymi, zachowania te mogą być wykorzystywane do zastosowań takich jak kontrolowanie montażu materiałów i biologiczne wytwarzanie produktów o wartości dodanej. 10 Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy narzędzia biologii syntetycznej do stworzenia szczepu E. coli, który syntetyzuje biotynę podczas indukcji. Szczep ten został opracowany przy użyciu metod klonowania enzymów restrykcyjnych w celu złożenia plazmidu, pKE1-lacI-bioB. Ten plazmid, po przekształceniu w szczep E. coli K-12 MG1655, nadaje komórkom zdolność do ekspresji podwyższonego poziomu bioB, enzymu niezbędnego do syntezy biotyny. Gdy transformowane komórki indukowano izopropylowym β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG) i zaopatrzono w prekursor biotyny, destiobiotynę (DTB), wytwarzano podwyższone poziomy biotyny.

Wiązanie biotyny ze streptawidyną jest jednym z najsilniejszych niekowalencyjnych wiązań występujących w naturze. W związku z tym interakcja biotyna-streptawidyna jest zarówno dobrze scharakteryzowana, jak i szeroko stosowana w biotechnologii. 11 W tym manuskrypcie prezentujemy dwie strategie wykorzystujące interakcję biotyna-streptawidyna do wykrywania i wykrywania biotyny wytwarzanej przez komórki za pomocą funkcjonalizowanej powierzchni. Te kontrastujące ze sobą powierzchnie nazywamy "pośrednimi" i "bezpośrednimi" schematami sterowania. W schemacie kontroli pośredniej biotyna wytwarzana przez komórki konkuruje z biotyną, która została sprzężona i unieruchomiona na powierzchni polistyrenu w poszukiwaniu miejsc wiązania streptawidyny. Ponadto streptawidyna jest sprzężona z peroksydazą chrzanową (HRP). HRP modyfikuje 3, 3', 5, 5'-tetrametylobenzydynę (TMB), w celu wytworzenia sygnału optycznego, 12, który może być monitorowany przez ilościowe określenie absorbancji widmowej (tj. gęstości optycznej) przy 450 nm (OD450). W ten sposób schemat kontroli pośredniej pozwala naukowcom mierzyć biotynę wytwarzaną przez komórki poprzez monitorowanie tłumienia sygnału OD450.

Schemat bezpośredniej kontroli wykorzystuje zdarzenie streptawidyna-biotyna, unieruchamiając streptawidynę bezpośrednio na powierzchni materiału i pozwalając wytwarzanej przez komórki biotynie i biotynylowanemu HRP konkurować o miejsca wiązania streptawidyny. Ponownie, względne poziomy biotyny wytwarzanej przez komórki są monitorowane poprzez pomiar sygnału OD450.

Razem wzięte, zmodyfikowane komórki i funkcjonalizowane powierzchnie pozwalają nam kontrolować właściwości programowalnej powierzchni poprzez indukowanie sieci w żywych komórkach. Innymi słowy, stworzyliśmy system, który wykorzystuje zdolności adaptacyjne organizmów żywych oraz niezawodność i specyfikację interfejsu z materiałów inżynieryjnych, łącząc te systemy ze sobą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki i hodowli

  1. Przygotować pożywkę LB (lysogeny broth), mieszając 25 g proszku LB z 1 L wody dejonizowanej (DI), a następnie wysterylizować roztwór w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
    1. Aby przygotować płytki LB, przed sterylizacją dodać do pożywki LB 15 g agaru (1,5%)
    2. Przygotować roztwór stokowy karbenicyliny (Cb) 1 0x w wodzie DI (50 mg/mL).
    3. W przypadku przygotowywania pożywki LB zawierającej antybiotyk do selekcji opornych transformantów, odczekać, aż temperatura wysterylizowanej pożywki LB spadnie poniżej 60 °C, a następnie dodać 1 µL roztworu stokowego antybiotyku na każdy 1 mL pożywki LB.
  2. Dla minimalnej pożywki M9 (Tabela 1) przygotować oddzielne roztwory stokowe następujących składników: soli M9 5X (56,4 g/L), 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 20% glukozy oraz 2% kwasów casamino bez biotyny.
    1. W butelce przystosowanej do autoklawowania połączyć 20 mL soli M9 5x, 20 µL 1M MgSO4, 10 µL 1 M CaCl2, 2 mL 20% glukozy, 1 mL 2% kwasów casamino bez biotyny oraz 76,8 mL wody DI.
    2. Roztwór przygotowany w kroku 1.2.1 wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
  3. Wszystkie kultury inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 40 rpm. Czas inkubacji zależy od eksperymentu i szczepu, ale zazwyczaj trwa od 8 do 12 h.

2. Generowanie szczepów E. coli produkujących biotynę (plazmid pKE1-lacI-bioB)

UWAGA: Obwód genetyczny składa się z dwóch części: represora lacI, sterowanego przez promotor PL,tetO-1, co skutkuje konstytutywną ekspresją ze względu na brak białka represora tetR, oraz systemu ekspresji biotyny zawierającego promotor Ptrc-2, po którym następuje silna sekwencja wiążąca rybosomy (rbs) sterująca ekspresją bioB. Wszystkie prace klonowania przeprowadzono w komercyjnym, szybko dzielącym się szczepie E. coli. Końcowy konstrukt został przetransformowany do szczepu E. coli MG165WT w celu przeprowadzenia testów. Startery (Tabela 2) zostały zakupione w drodze komercyjnej.

  1. Izolować bioB gen z E. coli genom poprzez przeprowadzenie polimerazy łańcuchowej (PCR) całych komórek:
    1. Hodowla *E. coli* komórki MG 1655WT przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. W probówce do PCR o objętości 0,2 ml połączyć 1 µL z hodowli nocnej przygotowanej w kroku 2.1.1 z 9 µL sterylnej wody dejonizowanej.
    3. Inkubować probówkę w temperaturze 95 °C przez 5 min w termocyklerze, a następnie natychmiast przenieść probówkę do -80 °C zamrażarka przez 10 min w celu lizy komórek. Pozwala to na wykorzystanie DNA genomowego jako matrycy do PCR.
    4. Rozmrozić roztwór i dodać (i) 2.5 µL każdy z primerów nBioB2-f1 i nBioB2-r, (ii) 5 µL buforu do polimerazy DNA 5x, (iii) 0.25 µL polimerazy DNA, (iv) 0.5 µL mieszanki dNTP oraz (v) 6.75 µL wody dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji wynoszącą 25 µL (Tabela 4).
    5. Uderz w bok (tj.(np. poprzez lekkie uderzenie w dno) probówki, aby wymieszać jej zawartość. Następnie należy niezwłocznie i szybko odwirować probówkę (ok. 2 s), aby upewnić się, że próbka znajduje się na dnie.
    6. Umieść probówkę w termocyklerze PCR i zastosuj program opisany w Tabela 3 z dodatkowym etapem trwającym 3 min w 95 °C na początku protokołu.
    7. Potwierdź pomyślny przebieg reakcji PCR za pomocą elektroforezy żelowej (agaroza 1,0–1,2% w wodzie dejonizowanej z bromkiem etydyny) w buforze TAE (tris-acetat-EDTA). Produkt PCR powinien mieć długość 1070 par zasad (bp).
    8. Należy użyć komercyjnych zestawów zgodnie z instrukcjami producenta w celu wyekstrahowania fragmentów DNA z żelu z etapu 2.1.7.
  2. Wyizoluj Ptrc-2 promotor i lacI operon z plazmidu pKDL07113 (dzięki uprzejmości laboratorium Jamesa Collinsa w MIT):
    1. HODOWANIE E. coli komórki zawierające plazmid pKDL071 przez noc w pożywce LB + Cb w temperaturze 37 °C.
    2. Wyizoluj plazmidowe DNA z komórek, używając komercyjnego zestawu do miniprepu zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid będzie służył jako matryca do reakcji PCR.
    3. Należy postępować zgodnie z protokołem PCR od punktu 2.1.4. do 2.1.8., wprowadzając następujące modyfikacje:
    4. W kroku 2.2.2 zastąp zlizowane komórki ekstraktem plazmidowym.
    5. Zastosowanie 2.5 µL każdy z primerów 1-f i 1-r dla lacI wyjmowanie kasety. Alternatywnie można zastosować 2.5 µL każda z par starterów nBioB1-f i nBioB1-r dla Ptrc-2 ekstrakcja
    6. Przeprowadź elektroforezę żelową (krok 2.1.7), aby potwierdzić, że produkty PCR są lacI kaseta i Ptrc-2 miejsce promotora. Powinny one mieć odpowiednio długość 1213 bp oraz 109 bp.
  3. Zastosuj PCR ze splataniem przez przedłużenie nakładkowe (SOE), aby zbudować kasetę bioB zawierającą Ptrc-2, syntetyczną sekwencję wiążącą rybosom (RBS) w starterze nBioB2-f2 oraz bioB gen. Program PCR dla termocyklera znajduje się w Tabela 3.
  4. Wstaw konstrukcje (PL,tetO-1 + lacI oraz Ptrc-2 + bioB ) do wektora plazmidowego pKE1-MCS13 szkielet (courtesy of laboratorium Jamesa Collinsa z MIT), trawiąc wektor i wkładkę za pomocą enzymów restrykcyjnych:
    1. Wyizoluj geny za pomocą enzymów restrykcyjnych i elektroforezy żelowej. Każda reakcja zawiera (i) 5 µL buforu reakcyjnego 10x, (ii) 1 µL enzymu restrykcyjnego 1, (iii) 1 µL enzymu restrykcyjnego 2, (iv) co najmniej 1 µg DNA, oraz (v) wody destylowanej (DI) do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 50 µL (Tabela 5). Trawić enzymami AatII i EcoRI w celu lacI kaseta oraz z enzymami HindIII i SacII dla bioB kaseta
    2. Po przygotowaniu mieszanin reakcyjnych należy je szybko wymieszać na wortexie, a następnie krótko odwirować (~ 2 s) przed inkubacją przez 1 h w temperaturze 37 °C.
    3. Podczas trawienia przygotować żele do elektroforezy zgodnie ze standardowymi protokołami.
    4. Połącz trawiony DNA z 6-krotnym buforem do ładowania w elektroforezie żelowej.
    5. Należy użyć drabinki 2-log w celu weryfikacji położenia pożądanego konstruktu, wyciąć fragment DNA z żelu, a następnie wykorzystać komercyjne zestawy do oczyszczania DNA z żelu zgodnie z instrukcją producenta, aby wyekstrahować fragmenty DNA z żelu.
  5. Oznacz ilość DNA metodą spektroskopii i oblicz objętości dla stosunków molowych wkładki do wektora 0:1, 1:1 oraz 3:1, korzystając z równania 1:
    Równanie równowagi chemicznej, wzór na częściowe wielkości molowe. Równanie 1
    W równaniu 1 M to stosunek insertu do wektora (0, 1 lub 3), Xi ilość DNA wstawki, bpi długość wstawki w parach zasad, bpv jest długością wektora w parach zasad, a Xv ilość wektora wynosi (50 ng).
  6. Wymieszać reakcję ligacji, łącząc (i) 1 µL Bufor ligazy 10X, (ii) 1 µL ligaza T4, (iii) 50 ng DNA wektora, (iv) masa DNA wkładki specyficzna dla każdej reakcji oraz (v) woda dejonizowana do 10 µL całkowita objętość reakcji (Tabela 6).
  7. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.
  8. Podczas inkubacji ligacji w kroku 2.7 należy przygotować komórki chemicznie kompetentne.
    1. Przenieść 1 ml kultur namnożonych przez noc do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    2. Wiruj w wirówce przy 16 20 x g przez 1 min.
    3. Odlaj supernatant i resuspenduj osad w 200 µL schłodzonego (w lodzie) 10 mM CaCl22Resuspender osad poprzez delikatne pipetowanie. Nie mieszać w wibratorze laboratoryjnym.
    4. Umieść probówkę do mikrowirówki w lodzie na 10 min.
    5. Odwiruj w wirówce, usuń nadsącz i resuspenduj osad w 100 µL schłodzonego 10 mM CaCl22i ponownie umieścić probówkę w lądzie.
    6. Odwiruj probówkę po raz ostatni i resuspenduj osad w 50 µL schłodzonego 10 mM CaCl22.
    7. Umieścić probówkę w lodzie i niezwłocznie wykorzystać kompetentne chemicznie komórki.
  9. Dodaj 5 µL ligowanego DNA, przygotowanego w krokach 2.6 i 2.7, do każdej probówki z kompetentnymi komórkami, przygotowanymi w kroku 2.8.
  10. Krótko wymieszaj zawartość probówki, uderzając w jej ściankę (np. poprzez lekkie pstryknięcie), a następnie umieść probówki w lodzie na 30 min.
  11. Poddaj probówki szokowi termicznemu przez 45 s w temperaturze 42 °C następnie należy ponownie umieścić probówki w lodzie na 2 min.
  12. Nanieść komórki pipetą na selektywne płytki z agarem LB z dodatkiem antybiotyku i rozprowadzić je za pomocą szklanych kulek do rozcierania.
  13. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  14. Następnego dnia rano należy wybrać kolonie z szalek zawierających inserty (t. j., płytki 1:1 i 3:1). Wybierz 3 kolonie, jeśli na płytce kontrolnej ujemnej 0:1 nie stwierdzono wzrostu, lub wybierz 5–8 kolonii, jeśli na płytce 0:1 widoczny jest pewien wzrost. Wybrane kolonie zaszczep do 5 ml LB + antybiotyk i inkubuj przez 8 h w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
  15. Wyodrębnić plazmidowe DNA z komórek za pomocą zestawu do minipreparatyki, zgodnie z instrukcją producenta. Wykonać cięcie testowe przy użyciu enzymów restrykcyjnych (stosując tę samą procedurę, która została szczegółowo opisana w kroku 2.4.1.).
  16. Zidentyfikuj komórki z prawidłowymi konstruktami, porównując długość fragmentów trawionego DNA z wynikami oczekiwanymi dla poprawnego konstruktu. Kultury zawierające prawidłowe konstrukty plazmidowe można przechowywać, mieszając w równych częściach kulturę z roztworem sterylnie filtrowanego, 40% glicerolu (w wodzie dejonizowanej) i zamrażając mieszaninę w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Transformacje plazmidów do innych E. coli szczepy (t.j., MG1655WT) można przeprowadzić, stosując się do powyższej procedury przygotowania komórek chemicznie kompetentnych.

3. Charakterystyka komórek: krzywa wzrostu i odpowiedź na dawkę

  1. Hodować zmodyfikowane szczepy przez noc w pożywce LB z odpowiednim antybiotykiem.
  2. W celu wyznaczenia krzywych wzrostu przygotować 50 mL minimalnej pożywki M9 z dodatkiem i bez dodatku IPTG (z roztworu stokowego 0,5 M) i/lub DTB (z roztworu stokowego 50 µg/mL) w następujący sposób:
    1. Przygotować 0 ng/mL DTB (0 µL roztworu stokowego)/ 0 mM IPTG (0 µL roztworu stokowego).
    2. Przygotować 20 ng/mL DTB (200 µL roztworu stokowego)/ 0 mM IPTG (0 µL roztworu stokowego).
    3. Przygotować 0 ng/mL DTB (0 µL roztworu stokowego)/ 0,5 mM IPTG (50 µL roztworu stokowego).
    4. Przygotować 20 ng/mL DTB (20 µL roztworu stokowego)/ 0,5 mM IPTG (50 µL roztworu stokowego).
    5. Zaszczepić kulturą nocną w stosunku 1:10 w pożywkach określonych powyżej.
    6. Do płytki 96-dołkowej nanieść po 20 µL kultury w trzech powtórzeniach do każdego dołka.
    7. Pomiar OD60 przeprowadzać co 5 min przez 24 h przy ciągłym wytrząsaniu i inkubacji w 37 °C w czytniku płytek.
  3. Do badań zależności dawka-odpowiedź zastąpić gen bioB w pKE1-lacI-bioB genem mCherry (czerwonym białkiem fluorescencyjnym) w celu optycznej kwantyfikacji w czasie rzeczywistym.
  4. Dodać zmienne ilości IPTG w zakresie od 0,1 mM do 5 mM, aby indukowć ekspresję w pożywce LB.
  5. Zaszczepić kulturą nocną w rozcieńczeniu 1:10.
  6. Pomiar fluorescencji przeprowadzać co 30 min przez 15 h.

4. Indukowanie produkcji biotyny z modyfikowanych komórek i przygotowanie naddatku

  1. Hodować pKE1-lacI-bioB w szczepie E. coli MG165 przez noc w pożywce LB.
  2. Uzupełnić pożywkę M9 o DTB w stężeniu od 30 do 20 ng/mL.
  3. Dodać 0,5 mM IPTG w celu indukcji syntezy biotyny.
  4. Zaszczepić uzupełnioną, wolną od biotyny minimalną pożywkę M9 kulturą nocną w rozcieńczeniu 1:100.
  5. Po 24 h hodowli odwirować komórki i zebrać supernatant wzbogacony w biotynę.
  6. Zmierzyć supernatant wzbogacony w biotynę przy użyciu funkcjonalizowanych powierzchni kontroli pośredniej oraz kontroli bezpośredniej. Użyć supernatantu zamiast próbki biotyny odpowiednio w krokach 5.23 i 6.12.

5. Przygotowanie funkcjonalizowanej powierzchni schematu pośredniej kontroli

  1. Przygotować następujące roztwory.
    1. Przygotować roztwór SMCC o stężeniu 20 mg/mL trans-4-(maleimidylowomiezylo)cykloheksano-1-karboksylanu N-hydroksysukcynimidowego (SMCC) w dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Przygotować roztwór SPDP o stężeniu 20 mg/mL propionianu succinimidylowego 3-(2-pyridyloditionowego) (SPDP) w DMSO.
    3. Przygotować LC-LC-biotynę w stężeniu 20 mg/ml w DMSO.
    4. Przygotować roztwór peroksydazy chrzanowej (HRP) o stężeniu 10 mg/ml w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).
    5. Przygotować streptawidynę (SA) o stężeniu 10 mg/ml w PBS.
    6. Przygotować roztwór albuminy surowicy wołowej (BSA) o stężeniu 10 mg/ml w buforze PBS.
    7. Przygotować 10 mM ditiotreitol (DTT) w wodzie dejonizowanej.
    8. Przygotować 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS.
    9. Przygotować 0,5% kazeinę w PBS.
    10. Przygotować 20% roztwór zapasowy Tween 80 w wodzie dejonizowanej.
    11. Przygotować 0,05% Tween 80 (z roztworu stokowego 20%) w PBS.
    12. Przygotować 50 mM octanu sodu w wodzie dejonizowanej (DI).
    13. Przygotować 1% roztwór TMB w DMSO.
    14. Przygotuj 3% H2O22O2 w wodzie dejonizowanej.
    15. Przygotować 2 M H2SO4 w wodzie dejonizowanej.
  2. Dodaj 1.4 µL roztworu SPDP do 20 µL roztwór SA
  3. Inkubować roztwór z etapu 5.2 przez 1,5 h w temperaturze pokojowej, owinięty w folię aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Etap ten umożliwia przyłączenie łącznika SPDP do SA poprzez grupę aminową, tworząc SA aktywowaną pyridylditio.
  4. Dodaj 2.4 µL roztworu DDT do roztworu z kroku 5.3 i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Pozwala to na odszczepienie pyridyny-2-tionu, w wyniku czego powstaje aktywowana grupą sulfhydrylową streptawidyna (SA).
  5. Dodaj 7.5 µL roztwór SMCC do 72 µL roztwór HRP i inkubować przez 1,5 h w temperaturze pokojowej, owinięte w folię aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. W wyniku tego procesu powstaje maleimidowo aktywowana HRP związana grupą aminową.
  6. Wymieszać 17 µL roztwór LC-LC-biotyny z 200 µL roztwór BSA i inkubować przez 1,5 h w temperaturze pokojowej, owinięty w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Ten etap umożliwia konjugację biotyny z BSA poprzez wiązanie amidowe.
  7. Przenieś roztwory z kroków 5.4, 5.5 i 5.6 do oddzielnych koncentratorów odśrodkowych w probówkach wirówkowych.
  8. W przypadku probówek zawierających SA-SPDP, z etapu 5.4, wirować z prędkością 10 0 x g, aż objętość w probówce osiągnie 100 µL lub przez 16 min. Napełnić probówkę wirówkową do 500 µL buforem PBS-EDTA.
    1. Powtórz krok 5.8 pięć razy. Przechowuj roztwór zapasowy w 4 °C.
  9. W przypadku probówek zawierających HRP-SMCC, zaczynając od kroku 5.5, wirować z prędkością 10 00 x g, aż objętość osiągnie 25 µL lub przez 16 min. Napełnić probówkę wirówkową do 500 µL buforem PBS.
    1. Powtórz krok 5.9 pięć razy. Przechowywać roztwór zapasowy w 4 °C.
  10. W przypadku probówek zawierających BSA-biotynę, z kroku 5.6, wirować z prędkością 10 0 x g, aż objętość osiągnie 100 µL lub przez 12 min. Napełnić probówkę wirówkową do 500 µL buforem PBS.
    1. Powtórz krok 5.10 cztery razy.
    2. Wirować przy 10 0 x g, aż objętość osiągnie 100 µL lub przez 12 min. Dodać 100 µL PBS do probówki. Przechowywać roztwór zapasowy w 4 °C.
  11. Dodać 25 µL roztworu HRP o stężeniu 10 mg/ml z 25 µL roztworu SA o stężeniu 10 mg/ml i przechowywać w 4 °C przez noc. Powoduje to sprzężenie SA z HRP za pomocą wiązania tioeterowego.
    1. Przygotuj 1:4 roztwór roboczy z roztworu inkubowanego przez noc i przechowuj w 4 °C lodówka. Przechowywać pozostały roztwór w temperaturze -20 °C.
  12. Przygotować dwa roztwory zawierające BSA-biotynę (lub BSA) w PBS, dodając 10 µL stoku BSA-biotyny (lub 10 µL roztwór zapasu BSA) do 490 µL buforu PBS.
  13. Dodaj 100 µL roztworu z kroku 5.12 do każdego dołka polistyrenowej płytki 96-dołkowej.
  14. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 h, owinięte folią.
  15. Przemyj studzienki płytki 0,05% roztworem Tween 80.
    1. Dodaj 200 µL do studzienek 0,05% PBS-Tween 80. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej. Odlać ciecz.
    2. Powtórzyć krok 5.15.1 trzykrotnie.
  16. Dodaj 200 µL roztworu kazeiny 0,5% do każdego z dołków płytki 96-dołkowej.
  17. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  18. Powtórz krok 5.15, aby trzykrotnie wypłukać dołki.
  19. Przygotuj roztwór, mieszając 12 ml 0,5% roztworu kazeiny z 7.5 µL 0,05% Tween 80.
  20. Rozcieńczyć roztwór stokowy SA-HRP w stosunku 1:10 0, używając roztworu przygotowanego w kroku 5.19.
  21. Dodaj 80 µL roztworu przygotowanego w kroku 5.20 do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
  22. Dodaj 20 µL przygotowanej próbki biotyny do każdego dołka płytki polistyrenowej. Nadpływ przygotowany w punkcie 4.6 może służyć jako próbka biotyny w tym kroku.
  23. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 h. Ten etap umożliwia konkurencyjne wiązanie wolnej biotyny i unieruchomionej BSA-biotyny do miejsc wiążących SA-HRP.
  24. Powtórz krok 5.15, aby trzykrotnie przemyć dołki.
  25. Wymieszać roztwór octanu sodu 50 mM, 1% roztwór TMB oraz 3% H2O22O2 roztwór w stosunku 10:10:1 (całkowita objętość 20 ml).
  26. Dodaj 200 µL roztworu z kroku 5.25 do każdej studzienki i pozostawić na 15 min w temperaturze pokojowej, przykrywszy folią.
  27. Dodaj 50 µL z 2 M H2SO4 do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję. Zmierz OD450 przy użyciu czytnika płytek.

6. Przygotowanie funkcjonalizowanej powierzchni schematu bezpośredniego sterowania

  1. Przygotować następujące roztwory.
    1. Przygotować 20 mg/mL LC-LC-biotyny w DMSO.
    2. Przygotować 10 mg/mL HRP w PBS.
    3. Przygotować 0,17 µg/mL SA w PBS.
    4. Przygotować 0,5% kazeiny w PBS.
    5. Przygotować 20% roztwór zapasu Tween 80 w wodzie DI.
    6. Przygotować 0,05% Tween 80 (z zapasu 20%) w PBS.
    7. Przygotować 50 mM octanu sodu w wodzie DI.
    8. Przygotować 1% TMB w DMSO.
    9. Przygotować 3% H2O2 w wodzie DI.
    10. Przygotować 2 M H2SO4 w wodzie DI.
  2. Dodać 7,5 µL LC-LC-biotyny do 72 µL HRP i inkubować przez 1,5 h w RT, owijając w folię aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Na tym etapie dochodzi do koniugacji biotyny z HRP poprzez wiązanie amidowe.
  3. Przenieść roztwór z kroku 6.2 do koncentratora odśrodkowego w probówce wirówkowej
    1. Odśrodkować roztwór przy 10 0 x g, aż objętość osiągnie 10 µL lub przez 12 min. Wypełnić probówkę wirówkową do 50 µL za pomocą PBS i powtórzyć odśrodkowanie oraz dodawanie PBS cztery razy. Przechowywać zapas w 4 °C.
  4. Dodać 10 µL roztworu SA z kroku 6.1.3 do każdego dołka w polistyrenowej płytce 96-dołkowej.
  5. Inkubować płytkę w 37 °C przez 1 h, owijając w folię.
  6. Przemyć dołki płytki 0,05% Tween 80.
    1. Dodać 20 µL 0,05% Tween 80 do dołków. Inkubować przez 2 min w RT. Odlać ciecz.
    2. Powtórzyć krok 6.6.1 trzy razy.
  7. Dodać 20 µL 0,5% roztworu kazeiny do każdego z dołków w płytce 96-dołkowej.
  8. Inkubować płytkę w 37 °C przez 1 h.
  9. Powtórzyć krok 6.6 trzy razy, aby przemyć dołki.
  10. Rozcieńczyć zapas biotyny-HRP w stosunku 1:10 0, używając roztworu przygotowanego w kroku 6.3.
  11. Dodać 80 µL roztworu przygotowanego w kroku 6.10 do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
  12. Dodać 20 µL przygotowanej próbki biotyny do każdego dołka płytki polistyrenowej. Jako próbkę biotyny na tym etapie można zastosować nadosad przygotowany w kroku 4.6.
  13. Inkubować płytkę w 37 °C przez 1 h. Ten etap umożliwia konkurencyjne wiązanie się wolnej biotyny i biotyny-HRP z immobilizowanymi miejscami wiążącymi SA.
  14. Powtórzyć krok 6.6, aby trzykrotnie przemyć dołki.
  15. Wymieszać roztwór 50 mM octanu sodu, roztwór 1% TMB oraz roztwór 3% H2O2 w stosunku 10:10:1 (całkowita objętość 20 mL).
  16. Dodać 20 µL roztworu z kroku 6.15 do każdego dołka i inkubować przez 15 min w RT, przykrywając folią.
  17. Dodać 50 µL roztworu 2 M H2SO4 do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję. Zmierzyć OD450 za pomocą czytnika płytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawiono na pięciu towarzyszących rycinach. Najpierw graficznie prezentujemy proces klonowania (Rycina 1), aby czytelnik mógł wizualnie prześledzić kluczowe etapy tworzenia syntetycznie zmodyfikowanego szczepu E. coli. W celu scharakteryzowania dynamiki populacyjnej komórek przedstawiamy krzywą wzrostu (Rycina 2) wygenerowaną poprzez pomiar gęstości optycznej populacji przy 600 nm (OD60). Następnie pokazujem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy nową strategię łączenia zmodyfikowanych żywych komórek z funkcjonalizowaną powierzchnią materiału. Udało się to osiągnąć poprzez opracowanie linii komórkowej zdolnej do syntezy podwyższonych poziomów biotyny podczas indukcji za pomocą IPTG. Podwyższony poziom biotyny może być następnie wykorzystany do modyfikacji funkcjonalizowanej powierzchni. Protokoły szczegółowo opisywały, jak zaprojektować linię komórkową E. coli i jak stworzyć dwie różne funkcjonalizowane powierzchnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony nagrody FA9550-13-1-0108 przyznanej przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych USA. Autorzy dodatkowo dziękują za wsparcie w postaci nagrody N00014-15-1-2502 przyznanej przez Biuro Badań Marynarki Wojennej USA, dofinansowania z Instytutu Technologii Krytycznych i Nauk Stosowanych w Virginia Polytechnic Institute i Uniwersytecie Stanowym oraz z National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, nagroda numer 1607310.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół LB, młynarz Fisher Scientific12-795-027
AgarFisher ScientificBP9744500
Karbenicylina Fisher ScientificBP26481
M9, Sole minimalne, 5xSigma-AldrichM6030
Casamino Acids Fisher ScientificBP1424-100
Siarczan magnezu, bezwodnyFisher ScientificM65-500
Chlorek wapnia, dwuwodnyFisher ScientificC79-500
Dekstroza (D-glukoza), bezwodnaFisher ScientificD16-1
NEB TurboEngland BiolabsC2984l
Oligonukleotyd PodkładyThermo Fisher ScientificSynteza N/A25N, oczyszczanie DSL
Q5 Polimeraza wysokiej wiernościNew England BiolabsM0491S
Q5 Bufor reakcyjnyNew England BiolabsB9027S
dNTP Mieszanina roztworówNew England BiolabsN0447S
AgarozaBioexpressE-3120-125
Etydyna Bromek, 1%Fisher ScientificBP1302-10
Zestawy do ekstrakcji żeluEpoch Biolabs2260250
GenCatch Plasmid DNA MiniprepEpoch Biolabs2160250
AatIINew England BiolabsR0117S
SacIINew England BiolabsR0157S
HindIII-HFNew England BiolabsR3104S
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101S
Cutsmart BufferNew England BiolabsB7204S
T4 DNA LigazaNew England BiolabsM0202S
T4 Lodoksyjka reakcyjna ligazy DNANew England BiolabsB0202S
Koraliki szklane ColiRolle EMD Millipore7101-3
GlicerolFisher ScientificBP229-1
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Fisher ScientificBP1755-10
NHS-Desthiobiotin (DTB)Thermo Fisher Scientific16129
Sukcynimidyl Trans-4-(maleimidylometylo)cykloheksano-1-karboksylan (SMCC) Thermo Fisher ScientificS1534
Dimetylosulfotlenek (DMSO) Fisher ScientificBP231-100
3-(2-pirydylodyjodio)propionian sukcynimidylu (SPDP) Thermo Fisher ScientificS1531
NHS-LC-LC-biotynaThermo Fisher Scientific21343
Peroksydaza chrzanowa (HRP) Thermo Fisher Scientific31490
buforowana fosforanami (PBS), 10x roztwórFisher ScientificBP399500
Streptawidyna (SA) Thermo Fisher Scientific21145
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Ditiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Kwas etylenodiaminooctowy (EDTA) Fisher ScientificS311-500
Animacja 80 Nadtlenek wodoru Fisher ScientificT164-500
Fisher ScientificH325-4
3, 3', 5, 5'-tetrametylobenzydyna (TMB)KoncentratoryScientific AC229280050
Vivaspin 500 Viva ProductsVS0192
Octan sodu, bezwodnyFisher ScientificBP333-500
96-dołkowe płytki polistyrenoweThermo Fisher Scientific266120
linia komórkowa New Sól fizjologiczna odśrodkowe Fisher

Bibliografia

  1. Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
  2. Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
  3. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
  4. Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
  5. Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
  6. Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
  7. Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
  8. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  9. Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988(2015).
  10. Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).
  11. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
  12. Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
  13. Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
  14. Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  15. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  16. Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
  17. Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modyfikowany szczep E coliprodukcja biotynyfunkcjonalizacja powierzchnisieciowanie SPDPkoniugacja HRPkonkurencyjny test wi zaniapomiar OD 450indukcja genetyczna
Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.