Artykuł metodologiczny

Identyfikacja białek wiążących lód roślinny poprzez ocenę inhibicji i izolacji rekrystalizacji lodu za pomocą oczyszczania o powinowactwie do lodu

DOI:

10.3791/55302

⸱

5 maja 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3School of Environmental Sciences, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia identyfikację białek wiążących lód z roślin odpornych na zamrażanie poprzez ocenę aktywności hamowania rekrystalizacji lodu i późniejszą izolację rodzimych IBP za pomocą oczyszczania o powinowactwie do lodu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka wiążące lód (IBP) należą do rodziny białek wywołanych stresem, które są syntetyzowane przez pewne organizmy wystawione na działanie temperatur poniżej zera. W roślinach uszkodzenia spowodowane zamarzaniem występują, gdy rosną zewnątrzkomórkowe kryształki lodu, co powoduje pęknięcie błon plazmatycznych i możliwą śmierć komórki. Adsorpcja IBP do kryształków lodu ogranicza dalszy wzrost w procesie znanym jako hamowanie rekrystalizacji lodu (IRI), zmniejszając w ten sposób uszkodzenia komórek. IBP wykazują również zdolność do obniżania temperatury zamarzania roztworu poniżej równowagowej temperatury topnienia, co jest właściwością znaną jako aktywność histerezy termicznej (TH). Te właściwości ochronne wzbudziły zainteresowanie identyfikacją nowych IBP ze względu na ich potencjalne zastosowanie w zastosowaniach przemysłowych, medycznych i rolniczych. W artykule opisano identyfikację roślinnych IBP poprzez 1) indukcję i ekstrakcję IBP w tkance roślinnej, 2) badanie przesiewowe ekstraktów pod kątem aktywności IRI oraz 3) izolację i oczyszczanie IBP. Po indukcji IBP przez ekspozycję na niską temperaturę, ekstrakty są badane pod kątem aktywności IRI za pomocą "testu rozpryskowego", który umożliwia obserwację wzrostu kryształów lodu przy użyciu standardowego mikroskopu świetlnego. Test ten wymaga niskiego stężenia białka i generuje wyniki, które są szybko uzyskiwane i łatwe do interpretacji, zapewniając wstępne badanie przesiewowe aktywności wiązania lodu. IBP można następnie wyizolować z zanieczyszczających białek, wykorzystując właściwości IBP do adsorpcji do lodu, za pomocą techniki zwanej "oczyszczaniem powinowactwa do lodu". Używając lizatów komórkowych zebranych z ekstraktów roślinnych, półkula lodowa może być powoli hodowana na mosiężnej sondzie. W ten sposób IBP zostają włączone do struktury krystalicznej lodu polikrystalicznego. Nie wymagając a priori wiedzy biochemicznej ani strukturalnej na temat IBP, metoda ta pozwala na odzyskanie aktywnego białka. Oczyszczone lodem frakcje białkowe mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, w tym do identyfikacji sekwencji peptydowych za pomocą spektrometrii mas i analizy biochemicznej białek natywnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka wiążące lód (IBP) to różnorodna rodzina białek ochronnych, które odkryto w wielu organizmach, w tym w roślinach1, owadach2, fish3, oraz mikrobach4. Kluczową cechą tych białek jest ich wyjątkowa zdolność do specyficznej i efektywnej adsorpcji kryształków lodu, modyfikując ich wzrost. IBP mają kilka udokumentowanych właściwości, z których dwie najlepiej scharakteryzowane to histereza termiczna (TH) i hamowanie rekrystalizacji lodu (IRI). Aktywność TH jest łatwiej obserwowana w IBP wytwarzanych u zwierząt z nietolerancją mrozu. Działanie to powoduje obniżenie temperatury zamarzania płynów krążeniowych lub śródmiąższowych organizmów, aby zapobiec zamarzaniu. W przeciwieństwie do tego, w organizmach odpornych na mróz, które nieuchronnie zamarzają w temperaturach poniżej zera, IBP wydają się mieć niską aktywność TH. Pomimo niskiej aktywności TH, w przypadku tych białek często obserwuje się wysoką aktywność IRI w celu ograniczenia wzrostu kryształów lodu. W przypadku organizmu odpornego na zamarzanie ta aktywność IRI prawdopodobnie pomaga chronić komórki przed niekontrolowanym wzrostem lodu w przedziałach zewnątrzkomórkowych.

Model "przycisku materaca" może być użyty do opisania mechanizmu, za pomocą którego IBP zapobiegają wzrostowi kryształków lodu5. W tym modelu IBP specyficznie adsorbują się na powierzchni kryształów lodu w odstępach czasu, tak że cząsteczki wody mogą łączyć się z rosnącą siecią kryształów lodu tylko w przestrzeni między związanymi IBP. Tworzy to krzywiznę, która sprawia, że włączenie dodatkowych cząsteczek wody jest niekorzystne, zdarzenie, które można opisać za pomocą efektu Gibbsa-Thomsona6. Hipoteza zakotwiczonych wód klatratowych dostarcza mechanizmu specyficznego wiązania IBP z powierzchnią kryształu lodu, przy czym obecność naładowanych reszt, specyficznie umieszczonych w miejscu wiązania lodu białkowego, powoduje reorganizację cząsteczek wody tak, aby pasowały do jednej lub więcej płaszczyzn sieci kryształów lodu7.

Aktywność TH można określić ilościowo, mierząc różnicę między temperaturą topnienia i zamarzania pojedynczego kryształu lodu w obecności IBP. Podczas gdy aktywność TH jest powszechnie akceptowaną metodą oceny aktywności IBP, niska przerwa TH wytwarzana przez roślinne IBP (zwykle tylko ułamek stopnia) zwykle wymaga wysokiego stężenia białka, specjalistycznego sprzętu i doświadczenia operatora. Chociaż nie-IBP mogą ograniczać wzrost kryształów lodu, jest to właściwość wspólna dla wszystkich IBP, a zatem badanie aktywności IRI jest skutecznym początkowym badaniem przesiewowym na obecność IBP, szczególnie w przypadku tych o niskiej aktywności TH. Metodologia stosowana do badania tej aktywności jest znana jako "test rozpryskowy", w którym próbka białka jest błyskawicznie zamrażana w celu wytworzenia monowarstwy małych kryształków lodu, które obserwuje się przez pewien czas w celu określenia, czy wzrost kryształków lodu jest ograniczony. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do badania przesiewowego próbki tkanki źródłowej pod kątem obecności IBP, technika ta ma zastosowanie do niskich stężeń białka w zakresie 10-100 ng, wykorzystuje łatwy w produkcji sprzęt i generuje dane, które można szybko i łatwo zinterpretować. Należy jednak podkreślić, że test ten stanowi wstępne badanie przesiewowe dla IBP, po którym powinno nastąpić określenie TH i kształtowania kryształów lodu.

Izolacja natywnych białek jest wyzwaniem, często wymaga informacji na temat strukturalnych i biochemicznych właściwości interesującego białka. Powinowactwo IBP do lodu pozwala na izolację tych białek przy użyciu lodu jako substratu do celów oczyszczania. Ponieważ większość cząsteczek jest wypychana przed granicę lodu i wody podczas wzrostu kryształów lodu, powolny wzrost półkuli lodowej w obecności próbki IBP skutkuje wysoce oczyszczoną próbką, pozbawioną dużych ilości zanieczyszczających białek i substancji rozpuszczonych. Ta metoda została wykorzystana do identyfikacji IBP na podstawie owadów8,9,10, bacteria11, fish12 i plants13,14. Dodatkowo, frakcje wzbogacone w IBP uzyskane tą metodą mogą być również wykorzystane do dalszej analizy biochemicznej. W artykule przedstawiono identyfikację IBP w roślinach poprzez indukcję i ekstrakcję IBP, analizę aktywności IRI w celu potwierdzenia obecności białek oraz izolację białek za pomocą oczyszczania powinowactwa do lodu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja aparatury Splat

  1. Napełnij programowalną temperaturowo obiegową łaźnię wodną glikolem etylenowym (50% v/v w wodzie).
    UWAGA: Można stosować ekologiczny samochodowy glikol etylenowy.
  2. Aby zmontować komorę zewnętrzną, użyj izolowanej plastikowej rurki, aby przymocować łaźnię wodną do szklanej miski o podwójnych ściankach. Zaizoluj szklaną miskę styropianem i przykryj plastikową pokrywką szalki Petriego. Wytnij 3-4-calowy otwór w dnie komory styropianowej, aby źródło światła było widoczne przez szklaną komorę.
  3. Zamontuj zewnętrzną komorę na mikroskopie preparacyjnym, wyposażonym w port kamery i spolaryzowaną soczewkę obiektywu 4X z soczewką okularową 10x. Umieść dodatkowy kawałek folii spolaryzowanej na dnie komory zewnętrznej.
  4. Zaciśnij rurkę o długości 1-1,5 m (~5 cm średnicy) na stojaku retortowym i umieść w dużym pojemniku z polistyrenu wraz z blokiem chłodzącym umieszczonym pod rurką u podstawy stojaka na retortę.

2. Przygotowanie natywnych ekstraktów białkowych do analizy IRI

  1. W celu wywołania ekspresji IBP w trawach mrozoodpornych lub innych gatunkach roślin odpornych na mróz, rośliny aklimatyzują się w niskich temperaturach do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C, w warunkach słabego oświetlenia (6 godzin światła / 18 godzin ciemności). Nie dotyczy to próbek pobranych w terenie, które były już narażone na działanie niskich temperatur i okresów aklimatyzacji.
  2. Uzyskaj około 0,1 g tkanki liścia, przecinając u podstawy łodygi, a następnie umieść w probówce o pojemności 1,5 ml. Natychmiast błyskawicznie zamrozić próbkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  3. Aby zlizać komórki, zmiel próbkę tkanki na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka pod ciekłym azotem. Upewnij się, że ciekły azot nie odparuje podczas procesu homogenizacji.
  4. Zmielone próbki należy natychmiast umieścić na lodzie i pozostawić ciekły azot do całkowitego odparowania. Dodać 1 ml natywnego buforu do ekstrakcji białek zawierającego 10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7,5), z dwiema tabletkami inhibitora proteazy wolnymi od EDTA dodanymi bezpośrednio przed użyciem. Odpipetować do mieszania; Nie wirować.
    UWAGA: Może być konieczne zastosowanie dodatkowych dodatków, jeśli lizat zawiera metabolity wtórne (patrz Dyskusja).
  5. Delikatnie wstrząsnąć próbkami przez noc (18-24 h) w temperaturze 4 °C. Pozostałe etapy przeprowadzić w temperaturze 4 °C.
  6. Usuń resztki komórkowe, odwirowując próbki o stężeniu ~16 000 x g przez 5 minut. Zachowaj rozpuszczalną frakcję i odwiruj przez dodatkowe 5 minut, jeśli resztki komórkowe utrzymują się. Oczyszczone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. Test rozprysku Przygotowanie do eksperymentu

  1. Wlej 100 ml heksanu do zewnętrznej komory ustawionej z folią spolaryzowaną i dodaj 5-6 kulek osuszających, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci na szkiełkach. Dodaj niewielką ilość smaru próżniowego do płytki przykrywającej kąpiel i przekręć, aby zapewnić szczelne uszczelnienie i zapobiec parowaniu heksanu.
  2. Schłodzić kąpiel heksanową w temperaturze od -4 °C do -6 °C za pomocą programowalnej łaźni wodnej na około 2-3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Upewnij się, że sprawdziłeś temperaturę heksanu za pomocą termometru przed rozpoczęciem eksperymentu.
  3. Umieść blok chłodzący w styropianowym pudełku bezpośrednio pod plastikową rurką i całkowicie przykryj suchym lodem na 40 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
  4. Przed rozpoczęciem testu upewnij się, że probówka jest wypoziomowana. Aby określić, w którym miejscu bloku chłodzącego spadnie próbka, najpierw przetestuj procedurę z wodą i wskaż markerem, gdzie próbka spada za pomocą markera (jak opisano poniżej).
  5. Usuń suchy lód z górnej części zimnego bloku i umieść szklane szkiełko podstawowe mikroskopu na śladzie kropli, który został oznaczony wodą.
  6. Bezpośrednio przed rozpoczęciem badania włącz źródło światła i zeskrob lód, który utworzył się na dnie szklanej komory. Unikaj włączania źródła światła, chyba że widoczne są kryształki lodu, aby zapobiec podgrzaniu heksanu.

4. Przeprowadzanie testu rozprysków

  1. Zanurz jednorazową końcówkę przymocowaną do pipety automatycznej (1-20 μl) w olejku immersyjnym, używając ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar oleju. Ten krok pozwoli na to, aby próbka opadła, a nie przylegała do zewnętrznej strony pipety.
    UWAGA: Usunięcie nadmiaru oleju z pipety ma kluczowe znaczenie, aby zapewnić, że kropelki oleju nie tworzą się na kryształkach lodu, co utrudnia wizualizację.
  2. Pobrać pipetę z 10 μl próbki i umieścić ją bezpośrednio na plastikowej rurce przed uwolnieniem próbki. Gdy próbka uderzy w szkiełko o szklaną pokrywę, powinien być słyszalny wyraźny dźwięk "splat", tworząc monowarstwę kryształków lodu.
  3. Szybko i ostrożnie wyjmij szkiełko mikroskopowe z zimnego bloku za pomocą pęsety i umieść w kąpieli heksanowej na wierzchu folii polaryzacyjnej.
  4. Patrząc pod mikroskop, umieść szkiełko mikroskopowe w polu view i wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby polaryzacja krzyżowa pozwalała na wizualizację kryształków lodu o wysokim kontraście. Dostosuj powiększenie do 40x.
  5. Podłącz kamerę do mikroskopu i ustaw ustawienia na "makro", aby umożliwić wyraźną wizualizację kryształków lodu i uchwycić obraz.
    UWAGA: Odczekanie do 1 godziny, aby kryształki lodu mogły wzrosnąć, może dać wyraźniejszy obraz.
  6. Powtórzyć kroki 4.1-4.5 dla wszystkich próbek. Zazwyczaj umieszcza się do 6 szkiełek z inną próbką w komorze heksanu.
  7. Wyłącz źródło światła i umieść plastikową płytkę nad kąpielą heksanową, zapewniając szczelne uszczelnienie. Pozwól kryształkom lodu wyżarzać się przez noc (12-24 godziny, zachowując stały okres wyżarzania w określonym teście). Po inkubacji zrób zdjęcia warstw lodu, jak opisano powyżej.
    UWAGA: Niektóre próbki mogą rekrystalizować szybciej niż inne. Jeśli po 12 godzinach nie jest widoczna rekrystalizacja, pozwól kryształom wyżarzać się przez maksymalnie 24 godziny, aby upewnić się, że nie dojdzie do rekrystalizacji.

5. Analiza danych testu rozpryskowego

  1. Prześlij zdjęcia do komputera i bezpośrednio porównaj wielkość kryształków lodu przed i po wyżarzaniu. Próbki z aktywnością rekrystalizacji lodu nie będą rosły, podczas gdy próbki bez aktywności IRI będą rekrystalizować się, tworząc zauważalnie większe kryształki lodu. Interferencja światła sprawi, że duże kryształki lodu pojawią się w nieco innych odcieniach, a tym samym będą łatwe do zauważenia.

6. Konfiguracja sprzętu do oczyszczania powinowactwa do lodu

  1. Napełnij programowalną temperaturowo obiegową łaźnię wodną glikolem etylenowym. Można stosować zielony samochodowy glikol etylenowy.
  2. Podłącz wannę do wydrążonej, mosiężnej sondy za pomocą izolowanej rurki z tworzywa sztucznego15.
  3. Zbuduj pojemnik z polistyrenu, w którym zmieści się zlewka o pojemności 150 ml. Utwórz pokrywkę pojemnika z otworem pośrodku na mosiężny zimny palec.

7. Przygotowanie próbek do oczyszczania pod względem powinowactwa do lodu

  1. Tkanka roślinna aklimatyzująca w niskich temperaturach, jak opisano w sekcji 2.1.
  2. Zbierz ~100-150 g zmielonej biomasy (krok 2.3) do probówek o pojemności 20 ml i natychmiast zamroź. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przed użyciem.
  3. Przygotować próbkę zgodnie z opisem w sekcjach 2.3-2.5. Do ponownego zawieszenia tkanki liścia należy użyć proporcji 1:1 (mg tkanki: ml natywnego buforu do ekstrakcji białka). Stosować dodatkowe tabletki inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji IBP przez endogenne proteazy.
    UWAGA: Jeśli próbka tkanki jest zbyt zagęszczona, dostosuj stosunek do 1:2 lub 1:3 (mg tkanki: ml natywnego buforu do ekstrakcji białka).
  4. Aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, przesiej lizę przez 2 warstwy gazy 3 razy. Osadzać szczątki przez odwirowanie w temperaturze 30 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zwiększyć objętość próbki do 120 ml przy użyciu natywnego buforu do ekstrakcji białek. Natychmiast użyj lizatu do oczyszczania z powinowactwa do lodu, aby uniknąć utraty aktywności wiązania lodu.

8. Przeprowadzanie oczyszczania powinowactwa do lodu

  1. Przed oczyszczaniem należy ustawić programowalną łaźnię wodną na chłodzenie z -0.5 °C do -3 °C z szybkością -0.04 °C/h.
    UWAGA: Szybkość chłodzenia można regulować w zależności od początkowej objętości próbki.
  2. Schłodzić palec lodowy do temperatury -0,5 °C, a następnie zanurzyć go w probówce o pojemności 50 ml zawierającej zimną wodę destylowaną. Dodaj kilka kawałków lodu, aby ułatwić zarodkowanie lodu i pozwól, aby na palcu utworzyła się cienka warstwa lodu. Proces ten trwa zwykle od 20 do 30 minut.
    UWAGA: Wszelkie grudki na palcu pokrytym lodem należy wygładzić dłonią w rękawiczce przed umieszczeniem w próbce. Jeśli warstwa lodu nie tworzy się w temperaturze -0,5 °C, obniż temperaturę do -0,75 °C.
  3. Umieścić próbkę w szklanej zlewce o pojemności 150 ml zawierającej małe mieszadło magnetyczne w pojemniku z polistyrenu umieszczonym na mieszadle magnetycznym. Upewnij się, że palec lodowy jest wyśrodkowany i opuszczony co najmniej do połowy próbki cieczy. Zamknij pojemnik.
  4. Pozwól programowi działać przez około dwa dni, sprawdzając co 24 godziny. Gdy 50% próbki zostanie zamrożone, zatrzymaj program. Włączenie IBP do półkuli lodowej spowoduje "trawienie lodu".
    UWAGA: Eksperymenty oczyszczania można przeprowadzić przy użyciu większych objętości próbek, przy czym czas działania programu jest odpowiednio dostosowany.
  5. W celu usunięcia półkuli lodowej należy ogrzać sondę do temperatury 4 °C, przepłukać półkulę wodą destylowaną w celu usunięcia niezwiązanego białka, a następnie rozmrozić w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Większość IBP nie jest stabilna w wodzie i odpowiedni bufor (tj. 50 mM Tris-HCl, pH 8 lub 50 mM wodorowęglanu amonu, pH 8) będzie musiał być okresowo dodawany podczas procesu rozmrażania (około 1 ml/2 h). Półkule lodowe można zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C przed rozmrożeniem.
  6. Jeśli półkula lodowa nadal zawiera pigment lub w celu zwiększenia oczyszczania próbki, powtórz kroki 8.1-8.5 2-3 razy.
    UWAGA: Chociaż stężenie IBP może być niższe po wielu rundach oczyszczania, czystość jest cenniejsza niż plon, jeśli oczyszczone próbki będą analizowane przy użyciu MS. Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość materiału, zaleca się trzy rundy oczyszczania z powinowactwem do lodu.

9. Identyfikacja IBP

  1. Ponieważ IBP są zawarte w dużej objętości po rozmrożeniu półkuli lodowej, należy zagęścić próbki. Zagęścić próbki zawierające ~100 g tkanki do ~1-3 ml za pomocą odśrodkowych probówek zatężających z odciętą masą cząsteczkową 3,000 Da, aby uniknąć utraty małych białek.
  2. Przed wysłaniem próbek do stwardnienia rozsianego należy określić stężenie białka za pomocą testu ilościowego białka, takiego jak test BCA lub test Bradforda. Oszacuj czystość próbek za pomocą elektroforezy żelowej, takiej jak SDS-PAGE. Przetestuj oczyszczone białka pod kątem aktywności IRI przed wysłaniem do SM, aby upewnić się, że aktywne białko zostało zachowane na etapach oczyszczania i zagęszczania.
  3. Skoncentrowanych próbek należy używać bezpośrednio do analizy spektrometrii mas10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla ułatwienia konfiguracji, Rysunek 1 i Rysunek 2 są dołączone jako wizualne reprezentacje sprzętu używanego odpowiednio do analizy IRI i oczyszczania powinowactwa do lodu. Wyniki analizy IRI z wykorzystaniem ekstraktów zebranych z zioła gorczycy z IBP i bez IBP przedstawiono na Rysunek 3. Wyniki te pokazują, że ekstrakty zebrane z chwastów gorczycy, które nie są odporne na mróz, nie były w s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla pomyślnej analizy i oczyszczenia IBP ważne jest zrozumienie wrażliwej na temperaturę natury niektórych z tych białek. Niektóre roślinne IBP stają się niestabilne w temperaturach powyżej 0 °C, co skutkuje rozwijaniem się, wytrącaniem i brakiem aktywności. W celu uzyskania aktywnych IBP często bardzo ważne jest, aby rośliny były przetwarzane w chłodni (~4 °C), a próbki były przechowywane na lodzie podczas eksperymentów. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu surowych lizatów całokomórkowych, jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu NSERC (Kanada) dla VKW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher05-408-129
Regulowany podnośnik laboratoryjnyFisherS63080
Wirówka stołowaDesaga MC2
Sonda mosiężnaNiestandardowy
port kamery/kameryKamera cyfrowa CanonCanon Power Shot SX110; Niestandardowy port
mikroskopuGazaPurewipe/Fisher Scientific06-665-25A
Probówki do zagęszczania (0,5 ml)EMD MilliporeUFC501008
Probówki do zagęszczania (15 ml)EMD MiliporeUFC900308
Rurki stożkowe (50 ml)Thermo FisherAM12502
Blok chłodzącyVWR13259Użyj metalowego bloku
grzewczegoOsuszaczpowietrza Whirlpool50 litrowy osuszacz Energy Star; zakup od lokalnego dostawcy
Koralikit.h.e. Dessicant/VWREM0017-2Rozmiar oczek 6-8; 100% wskazujące
Mikroskop preparacyjnyOlympus Tokyo
Szklana miska o podwójnych ściankachOgólnyZakup od lokalnego dostawcy szkła laboratoryjnego
Suchy lódOgólnyKorzystaj z lokalnego dostawcy; niebezpieczne 
Tabletki inhibitora proteazy EDTASigma Aldrich11836170001Roche cOmplete mini
Glikol etylenowyGenerycznyZielony samochodowy glikol etylenowy można kupić w dowolnym lokalnym sklepie z narzędziami (tj. Home Depot)
HexaneSigma Aldrich296090Bezwodny, 95%; niebezpieczny
Olejek immersyjnySigma Aldrich56822
Wirówka JA10/20Beckman
Duża plastikowa szalka PetriegoOgólny
Ciekły azotZastosowanie ogólneLokalny dostawca; niebezpieczne 
Mieszadło magnetyczneHanna InstrumentsHI190M
Szkiełka osłonowe mikroskopuFisher12-542A Plastikowa rurka
OgólnyKup rurę PVC w lokalnym sklepie z narzędziami
Folia spolaryzowanaEdmund Optics43-781
Pianka polistyrenowaOgólnyMoże być wykonany z polistyrenowych pudełek transportowych
Moździerz i tłuczek PoreclainFisherFB961
PVPPSigma Aldrich77627110 µ m Wielkość cząstek
Stojak na retortęFisher12-000
Mały mieszadłoFisher14-513-51
Łaźnia wodna programowalna temperaturowoVWR13271-118
Smar próżniowyDow Corning/Sigma AldrichZ273554
Rurki winyloweOgólny
dekoracyjne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256(2000).
  2. Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
  3. Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
  4. Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
  5. Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
  6. Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
  7. Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
  8. Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461(2005).
  9. Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
  10. Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
  11. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805(2012).
  12. Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153(2004).
  13. Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
  14. Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
  15. Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
  16. Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
  17. Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
  18. Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
  19. Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
  20. Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692(2015).
  21. Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  22. Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
  23. Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
  24. Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185(2014).
  25. Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
  26. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

test splathistereza termicznaekstrakcja z tkanki ro linnejtworzenie p sfery lodowejspektrometria masnanolitrowy osmometrtolerancja na mr z

Powiązane artykuły