Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Podsumowanie

Opisujemy proste metody badania regulacji funkcji i ekspresji transportera serotoniny w jelitach (SERT) za pomocą modelu hodowli in vitro komórek Caco-2 hodowanych w 3D oraz modelu ex vivo jelit myszy. Metody te mają zastosowanie do badania innych transporterów nabłonkowych.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy pełni ważne funkcje transportowe i barierowe, które odgrywają kluczową rolę w normalnych funkcjach fizjologicznych organizmu, stanowiąc jednocześnie barierę dla obcych cząstek. Upośledzony transport nabłonkowy (jonów, składników odżywczych lub leków) jest związany z wieloma chorobami i może mieć konsekwencje wykraczające poza normalne funkcje fizjologiczne transporterów, na przykład wpływając na integralność nabłonka i mikrobiom jelitowy. Zrozumienie funkcji i regulacji białek transportowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych interwencji terapeutycznych. Największym wyzwaniem w badaniach nad transportem nabłonkowym jest opracowanie odpowiedniego systemu modelowego, który podsumowuje ważne cechy natywnych komórek nabłonka jelitowego. Kilka modeli hodowli komórkowych in vitro, takich jak komórki Caco-2, T-84 i HT-29-Cl.19A, jest zwykle wykorzystywanych w badaniach nad transportem nabłonkowym. Te linie komórkowe reprezentują redukcjonistyczne podejście do modelowania nabłonka i były wykorzystywane w wielu badaniach mechanistycznych, w tym w badaniu interakcji nabłonkowo-mikrobiologicznych. Jednak monowarstwy komórkowe nie odzwierciedlają dokładnie interakcji komórka-komórka i mikrośrodowiska in vivo. Komórki hodowane w 3D okazały się obiecującymi modelami do badań nad przepuszczalnością leków. Pokazujemy, że komórki Caco-2 w 3D mogą być wykorzystywane do badania transporterów nabłonkowych. Ważne jest również, aby badania na komórkach Caco-2 zostały uzupełnione innymi modelami, aby wykluczyć efekty specyficzne dla komórek i uwzględnić złożoność jelita natywnego. Do oceny funkcjonalności transporterów stosowano już kilka metod, takich jak pęcherzyk pęcherzykowy i wychwyt w izolowanych komórkach nabłonka lub w izolowanych pęcherzykach błony komórkowej. Biorąc pod uwagę wyzwania w tej dziedzinie w odniesieniu do modeli i pomiaru funkcji transportu, demonstrujemy tutaj protokół hodowli komórek Caco-2 w 3D i opisujemy zastosowanie komory Ussinga jako skutecznego podejścia do pomiaru transportu serotoniny, takiego jak w nienaruszonym spolaryzowanym nabłonku jelitowym.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy jest wyposażony w różne białka transportowe (kanały, ATPazy, kotransportery i wymienniki), które pełnią liczne funkcje, począwszy od wchłaniania składników odżywczych, elektrolitów i leków, a skończywszy na wydzielaniu płynów i jonów w świetle. Białka transportowe generują gradienty elektrochemiczne, które umożliwiają ruch jonów lub cząsteczek w sposób wektorowy. Osiąga się to dzięki asymetrycznemu rozkładowi systemów transportowych w błonach wierzchołkowych i podstawno-bocznych spolaryzowanych komórek nabłonkowych. Ponadto ścisłe połączenia, które wiążą sąsiednie komórki nabłonkowe, odgrywają ważną rolę w tym procesie, służąc jako bariera dla wewnątrzbłonowej dyfuzji składników między wierzchołkowymi i podstawnobocznymi domenami błonowymi. Odpowiednie systemy modelowe naśladujące te charakterystyczne cechy jelita natywnego (tj. polarność, różnicowanie i integralność połączeń ścisłych) mają kluczowe znaczenie dla badania funkcjonalności systemów transportu nabłonkowego.

Jeśli chodzi o modele, typowymi liniami komórkowymi używanymi obecnie w badaniach nad transportem nabłonka jelitowego są Caco-2, model w pełni zróżnicowanych, chłonnych komórek nabłonka jelita cienkiego; oraz komórki T84 lub subklony HT-29, modele komórek nabłonka jelita grubego pochodzących z krypty¹. Konwencjonalnie te linie komórkowe są hodowane jako monowarstwy na powierzchniach z tworzywa sztucznego lub w powlekanych wkładkach transwell. Wkładki do hodowli komórkowych trans-well do pewnego stopnia przypominają środowisko in vivo, umożliwiając spolaryzowanym komórkom odżywianie się podstawkowo-bocznie. Jednak ograniczeniem w konwencjonalnych systemach hodowli 2D jest to, że komórki są zmuszone do przystosowania się do sztucznej, płaskiej i sztywnej powierzchni. W związku z tym fizjologiczna złożoność natywnego nabłonka nie jest dokładnie odzwierciedlona w systemie 2D. To ograniczenie zostało przezwyciężone przez metody hodowli komórek w 3D w określonym mikrośrodowisku, takie jak galaretowata mieszanina białek, zawierająca różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej^2,3. Niemniej jednak hodowle in vitro nie mogą symulować złożoności nabłonka jelitowego, który ma wiele typów komórek i specyficzną dla regionu architekturę w jelicie. W związku z tym badania z wykorzystaniem modeli kultur komórkowych wymagają dalszej walidacji w jelicie natywnym. Korzystając z hodowli komórkowej 3D in vitro i błony śluzowej jelit myszy, opisujemy tutaj proste metody badania regulacji jelitowego transportera serotoniny (SLC6A4, SERT).

Transporter SERT reguluje pozakomórkową dostępność ważnego hormonu i neuroprzekaźnika, 5-hydroksytryptaminy (5-HT), szybko transportując ją przez proces zależny od Na^+/Cl. SERT jest znanym celem leków przeciwdepresyjnych, a ostatnio pojawił się jako nowy cel terapeutyczny w zaburzeniach żołądkowo-jelitowych, takich jak biegunka i zapalenie jelit. Metody badania wychwytu 5-HT w komórkach nabłonka jelitowego zostały już wcześniej opisane. Na przykład wykazano, że komórki Caco-2 hodowane na plastikowych podporach lub przepuszczalnych wkładkach wykazują wrażliwy na fluoksetynę wychwyt ³H-5-HT zarówno w domenie wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej⁴. Pomiar funkcji SERT w izolowanych pęcherzykach błony granicznej szczotki (BBMV) przygotowanych z jelita cienkiego dawcy narządów ludzkich został również opisany przez us⁵. ³Wykazano, że wychwyt H-5-HT w ludzkich BBVM jest wrażliwy na fluoksetynę i zależny od Na⁺/Cl ^oraz wykazywał kinetykę nasycenia przy K_m wynoszącym 300 nM⁵. Korzystając z podobnych metod, wcześniej zmierzyliśmy funkcję SERT jako wychwyt ³H-5-HT w jelitach myszy BBMVs⁶. Jednak przygotowanie czystych pęcherzyków błony plazmatycznej wymaga dużej ilości błony śluzowej tkanki. Inne metody, takie jak radiograficzna wizualizacja ³miejsc wychwytu H-5-HT, zostały również pokazane wcześniej w jelicie cienkim świnki morskiej i szczura⁷.

Komora Ussing dostarcza bardziej fizjologicznego systemu do pomiaru transportu jonów, składników odżywczych i leków przez różne tkanki nabłonkowe. Główną zaletą techniki komory Ussinga jest to, że umożliwia ona precyzyjny pomiar parametrów elektrycznych i transportowych nienaruszonego, spolaryzowanego nabłonka jelitowego. Ponadto, aby zminimalizować wpływ wewnętrznego układu nerwowo-mięśniowego, można przeprowadzić surowiczo-mięśniowe usuwanie błony śluzowej jelit w celu zbadania regulacji transporterów w nabłonku⁸.

Pokazujemy, że komórki Caco-2 hodowane w 3D na galaretowatym białku tworzą puste światło wyrażające wyraźne markery wierzchołkowe i podstawno-boczne. Komórki te wykazują wyższą ekspresję SERT niż komórki 2D Caco-2. Opisano metody hodowli komórek 3D oraz wykonywania barwienia immunologicznego lub ekstrakcji RNA i białek. Ponadto opisujemy metody badania funkcji i regulacji SERT przez TGF-β1, cytokinę plejotropową, w błonie śluzowej jelita cienkiego z wykorzystaniem techniki komory Usinga.

Protokół

1. Badanie transporterów jelitowych w systemie hodowli 3D Caco-2: Hodowla komórek 3D Caco-2 na galaretowatej mieszance białek

1. Rozmrażanie czynnika wzrostu zredukowało galaretowatą mieszaninę białek na lodzie przez 8 godzin (lub O/N) w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu przygotować 1 ml lub 500 μl porcji do wykorzystania lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
2. W dniu hodowli należy wstępnie schłodzić płytki hodowlane (do ekstrakcji RNA i białka) lub szkiełka komorowe (do barwienia immunologicznego) na lodzie. Dodać 30 μl galaretowatej mieszaniny białek do każdego dołka ośmiodołkowego szkiełka szklanego (lub 120 μl na zagłębienie na 6-dołkowej płytce) i równomiernie rozprowadzić. Uważaj, aby podczas procesu nie wytwarzać pęcherzyków powietrza.
3. Umieścić szkiełka/płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 15-30 minut i pozostawić galaretowatą mieszaninę białek do zestalenia się.
4. Podczas gdy galaretowata mieszanina białek krzepnie, trypsynizuj zlewającą się kolbę komórek Caco-2.
5. Policz liczbę komórek i obracaj je w proporcji 500 x g w wirówce stołowej przez 5 minut. W razie potrzeby ponownie zawiesić osad komórek w pożywce 3D Caco-2
.
6. Zasiej szkiełka szklanej komory w ilości 4 000 komórek na dołek (w przypadku płytek 20 000 na dołek). Pozwolić komórkom rosnąć w inkubatorze z wilgotnością 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Zmieniaj podłoże co 3 - 4 dni.

2. Barwienie immunofluorescencyjne transporterów nabłonka w komórkach 3D Caco-2: Dzień 1

1. Odessać pożywkę i utrwalić komórki 400 μl 2% paraformaldehydu (PFA) (w PBS o pH dostosowanym do 8,5 z NaOH) przez 30 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: Roztwór PFA nie powinien być przechowywany dłużej niż 1 tydzień w temperaturze 4 °C i można użyć świeżo przygotowanego roztworu. ostrożność: PFA jest wysoce toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Zawsze należy obchodzić się z nim ostrożnie w kapturze chemicznym i przy użyciu środków ochrony osobistej.
2. Przepłukać studzienki dwukrotnie 1x PBS i przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C w PBS (400 μl/studzienkę). Po utrwaleniu przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
3. Ogrzej szkiełka komory do temperatury mokrej (spowoduje to utwardzenie galaretowatego złoża mieszanki białkowej i ułatwi jej zasysanie podczas etapów mycia).
4. Przepuszczalność komórek z 0,5% trytonem w PBS nie dłużej niż 15 minut.
5. Przygotować bufor PBS-glicyny (130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3,5 mM NaH₂PO₄ i 100 mM glicyny). Płukać 3x 1x PBS-glicyną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przygotuj bufor immunofluorescencyjny (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3,5 mM NaH₂PO₄, 100 mM glicyny, 7,7 mM NaN₃, 0,1% BSA, 0,2% TritonX-100 i 0,05% Tween-20.
7. Przemyć 3x w buforze IF przez 10 minut w RT. Zablokować 5% normalnej surowicy koziej (NGS) w buforze IF. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w surowicy koziej IF + 1%, 200 μl/basenik, przez 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemywać buforem IF 3x przez 10 minut każdy.
8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:200) rozcieńczonym w IF + 1% NGS, 200 μl/basenik, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
9. Przemyć buforem IF trzy razy przez 10 minut każdy. Od tego kroku trzymaj slajdy w ciemności. Podnieś plastikowe komory ze szklanych szkiełek, umieszczając szkiełko komory w czarnym uchwycie i przesuwając biały podnośnik przez uchwyt, aż jego krawędź zetknie się z krawędzią studzienek. Delikatnie pociągnij komory do góry (uchwyt i podnośnik powinny być wyposażone w szkiełka hodowlane).
10. Zamontuj za pomocą powolnego podłoża zapobiegającego blaknięciu i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej.
11. Po całkowitym wyschnięciu uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i zobrazuj je za pomocą mikroskopii konfokalnej. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie lub w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

3. Ekstrakcja RNA i białek z komórek 3D Caco-2

1. Komórki hodowane na galaretowatej mieszaninie białek należy traktować przez 12 - 14 dni za pomocą czynnika testowego, takiego jak TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h).
2. Po zabiegu umyj komórki 1x PBS. Trzymaj komórki na lodzie przez 30 minut, aby upłynnić galaretowatą mieszaninę białek.
3. Umyć studzienki schłodzonym PBS i zebrać komórki do indywidualnych probówek wirówkowych. Zebrać komórki, odwirowując je na niskiej prędkości przy 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ekstrakcja RNA przy użyciu standardowych procedur i użycie RT-PCR w czasie rzeczywistym.
4. W celu ekstrakcji białka należy lizować komórki za pomocą 1x buforu do lizy komórek uzupełnionego 1x inhibitorem koktajlu proteazy. Po dodaniu buforu do lizy komórek do osadu, poddać komórki lizie przez sonikację i usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 7 500 x g i 4 °C przez 10 minut.

4. Pomiar wychwytu 5-HT w jelicie krętym myszy za pomocą komory usingowej: przygotowanie jelit i stripping surowo-mięśniowy

1. Po eutanazji należy przeprowadzić sekcję myszy i usunąć jelito cienkie (za żołądkiem i przed jelitem ślepym). Podziel jelito cienkie na trzy części. Odrzuć środkową trzecią, użyj bliższej trzeciej jako jelita czczego i użyj dystalnej trzeciej jako jelita krętego. Unikaj wyciągania jelita z przyczepu krezkowego, aby zapobiec uszkodzeniu nabłonka. Utrzymuj wycinek tkanki w chłodzie, przykrywając go lodowatym buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera (KBR).
2. Otwórz jelito wzdłużnie za pomocą nożyczek. Świeżo wycięte skrawki jelita inkubować w lodowatym, gazującym KBR zawierającym 1 μM indometacynę przez 10 minut przed oddzieleniem surowiczo-mięśniowym.
3. Przypiąć odcinek jelitowy (~1 cm długości) stroną śluzówkową do płytki zawierającej 7% agarozy lub utwardzonego elastomeru silikonowego (o grubości 0,5 cm).
4. Usuń warstwy surowiczo-mięśniowe pod stereomikroskopem preparacyjnym z dolnym oświetleniem. Przetnij warstwę surowiczo-mięśniową za pomocą ostrza skalpela z piór. Użyj cienkich kleszczyków, aby uzyskać krawędź warstwy wzdłuż osi podłużnej jelita.
   UWAGA: Podczas procedury usuwania powłoki dolne oświetlenie mikroskopu stereoskopowego pomaga zidentyfikować i uniknąć obszarów z plamami Peyera.
5. Po zakończeniu usuwania surowiczo-mięśniowego, ostrożnie zamontuj błonę śluzową na kołkach półkomory Usinga. Podczas całego procesu należy uważać, aby trzymać pozbawioną tkanki błony śluzowej za krawędzie, aby jej nie rozerwać się.

5. Równowaga i leczenie tkanek

1. Przygotować roztwór Kreba: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO₃, 2,4 mM K₂HPO₄, 1,2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂ i 0,4 mM KH₂PO₄ przy pH 7,4, zagazowane 95% O₂/5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Dodać 10 mM glukozy do kąpieli surowiczej, aby służyła jako substrat energetyczny i 10 mM mannitol do kąpieli śluzówkowej, aby utrzymać równowagę osmotyczną.
   UWAGA: Roztwór Kreba jest uzupełniany kwasem L-askorbinowym (100 μM) i pargyliną (100 μM, inhibitorem monoaminooksydazy) w celu zapobieżenia wewnątrzkomórkowej degradacji 5-HT.
2. Włóż suwak do komory, aby wystawić zarówno stronę wierzchołkową (luminalną), jak i podstawno-boczną (surowiczą) tkankę na działanie roztworu Kreba.
3. Po okresie równowagi wynoszącym 10 minut, wstępnie potraktować tkankę jelita krętego fluoksetyną (10 μM) przez 30 minut po stronie wierzchołkowej dla J_m-s (strumień śluzówkowo-surowiczy
).
4. Traktować tkankę TGF-β1 (10 ng / ml) przez 1 godzinę po stronie podstawno-bocznej, a następnie inkubować ją z ³[H]-5-HT (20 nM) przez 30 minut po stronie wierzchołkowej.

6. Kwantyfikacja strumienia błony śluzowej do błony surowiczej (J_m-s) i akumulacji ³[H]-5-HT w tkance

1. Zebrać 0,75 ml podwielokrotności ze zbiornika surowiczego (łącznie 5 ml) w celu zmierzenia radioaktywności w liczniku scyntylacyjnym cieczy i obliczenia szybkości strumienia od błony śluzowej do surowiczej (J_m-s); strumień wrażliwy na fluoksetynę reprezentuje wychwyt ³[H]-5-HT za pośrednictwem SERT.
2. Aby uniknąć różnic ciśnienia hydrostatycznego w błonie śluzowej w okresie strumienia, należy pobrać próbki od strony surowiczej i zastąpić je identycznymi objętościami podłoża do kąpieli.
   UWAGA: Obliczenie strumienia koryguje rozcieńczenie próbki końcowej (4,25 ml / 5 ml = 0,85).
3. W celu ilościowego określenia ³[H]-5-HT nagromadzonego w tkance, należy zdjąć błonę śluzową z suwaka, przemyć ją raz lodowatym buforem KRB i umieścić w szklanych probówkach hodowlanych.
4. Inkubować błonę śluzową w 0,5 ml 10% KOH przez noc w temperaturze 37 °C. Zmierzyć radioaktywność w 150 μl podwielokrotności lizatów (w trzech powtórzeniach) za pomocą płynnego licznika scyntylacyjnego.
5. Do pomiaru stężenia białka metodą Bradforda należy użyć podwielokrotności (3 - 5 μl) lizatów.
   UWAGA: Jako wzorzec stosuje się 10 ml pożywki inkubacyjnej zawierającej radioaktywną serotoninę. 5-HT zatrzymany w tkance jest wyrażony jako pmol/mg białka/min.

Wyniki

Barwienie immunologiczne w torbielach 3D Caco-2 pokazano na rysunku 1. Reprezentatywny obraz płaszczyzny XY przedstawiającej dobrze odgraniczone światło w torbieli 3D wybarwionej aktyną falloidyny przedstawiono na rysunku 1A. Strona zwrócona w stronę światła oznacza stronę wierzchołkową. Komórki nabłonkowe hodowane w środowisku 3D dają solidny fenotyp nabłonka. Różne torbiele Caco-2 w dniu 12, kiedy aktyna i SERT były jednocześnie barwione, pokazano na

Dyskusja

W pełni zróżnicowane monowarstwy komórek Caco-2 były szeroko stosowane jako monowarstwy spolaryzowanego nabłonka do badania transportu jelitowego 10,11,12,13,14,15. Jednak, aby naśladować fizjologiczną organizację komórek nabłonka jelitowego, pojawiło się duże zainteresowanie opracowaniem kultury Caco-2 w 3D. Niedawno opracow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x PBS	ATCC	ATCC® HTB&nieśmiały; 37&handel;	Komórek
10x PBS	Carl Zeiss		Microsope do obrazowania konfokalnego
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Komórki hodowlane do mikroskopii
5-HT	Gibco	70013-032	Nie jest substancją niebezpieczną
95% O2- 5% CO2 butla	KPL	71-00-27	Nie jest substancją niebezpieczną
Agar (do płytek agarowych)	Fischer	BP151-100	Toksyczność ostra, Ora
Agar (do elektrody)	Sigma	G7126-1KG	Nie jest substancją niebezpieczną
Alexa Fluor Phalloidin	Sigma	C3867-1VL	Nie jest substancją niebezpieczną
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	P6148-500G	Działa szkodliwie w przypadku połknięcia lub wdychania
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Nie jest substancją niebezpieczną
Komórki Caco-2	Sigma	A8806-5G	Nie jest substancją niebezpieczną
Bufor do lizy komórek	Fischer	BP337-100	Nie a substancja niebezpieczna
Zjeżdżalnie zamazane	Sigma	S5886-1KG	Nie jest substancją niebezpieczną
Roztwór kolagenu typu 1	Sigma	S8045-500G
Elektrody	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco firmy Life Technologies	25200-056
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Corning	356234	Używana jako macierz zewnątrzkomórkowa
Fluoksetyna	Qiagen	74104
Gentamycyna	ATCC	30-2003	Pożywka do hodowli komórkowych
Glicyna	Sygnalizacja komórkowa, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco firmy Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco firmy Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco firmy Life Technologies	15630-080
Kwas L-askorbinowy	Gibco by Life Technologies	10082147
Licznik scyntylacyjny ciecz	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Wielokanałowy zacisk napięciowy/prądowy	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normalna surowica kozia (NGS, 10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Odczynnik do oznaczania białek	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Koktajl inhibitorów proteinaz	MEDOX, Chicago, IL	styl G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Jednokanałowy moduł wejściowy elektrody	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Suwaki do komór snapwell	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Fosforan sodu (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β 1	Perkin-Elmer, Waltham, MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsyna EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (tylko komora)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Systemy studzienek użytkowych	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296