Method Article

Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy proste metody badania regulacji funkcji i ekspresji transportera serotoniny w jelitach (SERT) za pomocą modelu hodowli in vitro komórek Caco-2 hodowanych w 3D oraz modelu ex vivo jelit myszy. Metody te mają zastosowanie do badania innych transporterów nabłonkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek jelitowy pełni ważne funkcje transportowe i barierowe, które odgrywają kluczową rolę w normalnych funkcjach fizjologicznych organizmu, stanowiąc jednocześnie barierę dla obcych cząstek. Upośledzony transport nabłonkowy (jonów, składników odżywczych lub leków) jest związany z wieloma chorobami i może mieć konsekwencje wykraczające poza normalne funkcje fizjologiczne transporterów, na przykład wpływając na integralność nabłonka i mikrobiom jelitowy. Zrozumienie funkcji i regulacji białek transportowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych interwencji terapeutycznych. Największym wyzwaniem w badaniach nad transportem nabłonkowym jest opracowanie odpowiedniego systemu modelowego, który podsumowuje ważne cechy natywnych komórek nabłonka jelitowego. Kilka modeli hodowli komórkowych in vitro, takich jak komórki Caco-2, T-84 i HT-29-Cl.19A, jest zwykle wykorzystywanych w badaniach nad transportem nabłonkowym. Te linie komórkowe reprezentują redukcjonistyczne podejście do modelowania nabłonka i były wykorzystywane w wielu badaniach mechanistycznych, w tym w badaniu interakcji nabłonkowo-mikrobiologicznych. Jednak monowarstwy komórkowe nie odzwierciedlają dokładnie interakcji komórka-komórka i mikrośrodowiska in vivo. Komórki hodowane w 3D okazały się obiecującymi modelami do badań nad przepuszczalnością leków. Pokazujemy, że komórki Caco-2 w 3D mogą być wykorzystywane do badania transporterów nabłonkowych. Ważne jest również, aby badania na komórkach Caco-2 zostały uzupełnione innymi modelami, aby wykluczyć efekty specyficzne dla komórek i uwzględnić złożoność jelita natywnego. Do oceny funkcjonalności transporterów stosowano już kilka metod, takich jak pęcherzyk pęcherzykowy i wychwyt w izolowanych komórkach nabłonka lub w izolowanych pęcherzykach błony komórkowej. Biorąc pod uwagę wyzwania w tej dziedzinie w odniesieniu do modeli i pomiaru funkcji transportu, demonstrujemy tutaj protokół hodowli komórek Caco-2 w 3D i opisujemy zastosowanie komory Ussinga jako skutecznego podejścia do pomiaru transportu serotoniny, takiego jak w nienaruszonym spolaryzowanym nabłonku jelitowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek jelitowy jest wyposażony w różne białka transportowe (kanały, ATPazy, kotransportery i wymienniki), które pełnią liczne funkcje, począwszy od wchłaniania składników odżywczych, elektrolitów i leków, a skończywszy na wydzielaniu płynów i jonów w świetle. Białka transportowe generują gradienty elektrochemiczne, które umożliwiają ruch jonów lub cząsteczek w sposób wektorowy. Osiąga się to dzięki asymetrycznemu rozkładowi systemów transportowych w błonach wierzchołkowych i podstawno-bocznych spolaryzowanych komórek nabłonkowych. Ponadto ścisłe połączenia, które wiążą sąsiednie komórki nabłonkowe, odgrywają ważną rolę w tym procesie, służąc jako bariera dla wewnąt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Badanie transporterów jelitowych w systemie hodowli 3D Caco-2: Hodowla komórek 3D Caco-2 na galaretowatej mieszance białek

  1. Rozmrażanie czynnika wzrostu zredukowało galaretowatą mieszaninę białek na lodzie przez 8 godzin (lub O/N) w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu przygotować 1 ml lub 500 μl porcji do wykorzystania lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. W dniu hodowli należy wstępnie schłodzić płytki hodowlane (do ekstrakcji RNA i białka) lub szkiełka komorowe (do barwienia immunologicznego) na lodzie. Dodać 30 μl galaretowatej mieszaniny białek do każdego dołka ośmiodołkowego szkiełka szklanego (lub 120 μl na z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie immunologiczne w torbielach 3D Caco-2 pokazano na rysunku 1. Reprezentatywny obraz płaszczyzny XY przedstawiającej dobrze odgraniczone światło w torbieli 3D wybarwionej aktyną falloidyny przedstawiono na rysunku 1A. Strona zwrócona w stronę światła oznacza stronę wierzchołkową. Komórki nabłonkowe hodowane w środowisku 3D dają solidny fenotyp nabłonka. Różne torbiele Caco-2 w dniu 12, kiedy aktyna i SERT były jednocześnie barwione, pokazano na

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pełni zróżnicowane monowarstwy komórek Caco-2 były szeroko stosowane jako monowarstwy spolaryzowanego nabłonka do badania transportu jelitowego 10,11,12,13,14,15. Jednak, aby naśladować fizjologiczną organizację komórek nabłonka jelitowego, pojawiło się duże zainteresowanie opracowaniem kultury Caco-2 w 3D. Niedawno opracow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Panu Christopherowi Manzelli, doktorantowi w laboratorium RKG, za pomoc w redagowaniu i korekcie naszego rękopisu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC® HTB&nieśmiały; 37&handel;Komórek
10x PBSCarl ZeissMicrosope do obrazowania konfokalnego
3[H]-5-HT LabtekII152453Komórki hodowlane do mikroskopii
5-HT Gibco70013-032Nie jest substancją niebezpieczną
95% O2- 5% CO2 butlaKPL71-00-27Nie jest substancją niebezpieczną
Agar (do płytek agarowych)FischerBP151-100Toksyczność ostra, Ora
Agar (do elektrody)SigmaG7126-1KGNie jest substancją niebezpieczną
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLNie jest substancją niebezpieczną
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaP6148-500GDziała szkodliwie w przypadku połknięcia lub wdychania
CaCl2LifeTechnologiesA12380Nie jest substancją niebezpieczną
Komórki Caco-2SigmaA8806-5GNie jest substancją niebezpieczną
Bufor do lizy komórekFischerBP337-100Nie a substancja niebezpieczna
Zjeżdżalnie zamazaneSigmaS5886-1KGNie jest substancją niebezpieczną
Roztwór kolagenu typu 1SigmaS8045-500G
ElektrodySigmaS-0876
EMEMGibco firmy Life Technologies25200-056
Surowica bydlęca płodu (FBS)Corning356234Używana jako macierz zewnątrzkomórkowa
FluoksetynaQiagen74104
GentamycynaATCC30-2003Pożywka do hodowli komórkowych
GlicynaSygnalizacja komórkowa, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco firmy Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco firmy Life Technologies15710-064
KOHGibco firmy Life Technologies15630-080
Kwas L-askorbinowy Gibco by Life Technologies10082147
Licznik scyntylacyjny ciecz Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
MannitolPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
Wielokanałowy zacisk napięciowy/prądowyPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Normalna surowica kozia (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Odczynnik do oznaczania białekSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Koktajl inhibitorów proteinazMEDOX, Chicago, IL styl G- 12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Jednokanałowy moduł wejściowy elektrody Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Suwaki do komór snapwellSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Fosforan sodu (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsyna EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (tylko komora)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Systemy studzienek użytkowychSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles