Method Article

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

DOI:

10.3791/55310

⸱

July 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agronomy and Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin - Madison, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin - Madison, 3Department of Soil, Water, and Climate, University of Minnesota, 4Faculty of Science and Engineering, Curtin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Społeczności mikrobiologiczne są ważnymi czynnikami napędzającymi i regulującymi procesy ekosystemowe. Aby zrozumieć, w jaki sposób zarządzanie ekosystemami może wpływać na społeczności drobnoustrojów, stosunkowo precyzyjną, ale pracochłonną techniką badania składu społeczności mikrobiologicznej jest analiza fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA). PLFA został opracowany do analizy biomarkerów fosfolipidowych, które mogą być wykorzystane jako wskaźniki biomasy mikrobiologicznej i składu szerokich grup funkcjonalnych grzybów i bakterii. Jest powszechnie używany do porównywania gleb w alternatywnych zbiorowiskach roślinnych, ekologii i reżimach zarządzania. Wykazano, że metoda PLFA jest czuła na wykrywanie zmian w składzie zbiorowisk drobnoustrojów.

Alternatywna metoda, ekstrakcja i analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych (MIDI-FA) została opracowana do szybkiej ekstrakcji całkowitej ilości lipidów, bez oddzielania frakcji fosfolipidowej, z czystych kultur jako technika identyfikacji mikrobiologicznej. Ta metoda jest szybka, ale jest mniej odpowiednia dla próbek gleby, ponieważ brakuje w niej początkowego etapu oddzielania cząstek gleby, a zamiast tego rozpoczyna się od reakcji zmydlania, która prawdopodobnie wytwarza artefakty z tła materii organicznej w glebie.

Ten artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami. Metoda łączy w sobie dokładność osiągniętą dzięki profilowaniu PLFA poprzez ekstrakcję i zagęszczenie lipidów glebowych jako pierwszy krok oraz zmniejszenie wysiłku poprzez zmydlanie wyekstrahowanego materiału organicznego i przetwarzanie metodą MIDI-FA jako drugi krok.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę kluczową rolę mikroorganizmów w obiegu składników odżywczych 1, modyfikacji składu zbiorowisk roślinnych 2, regulacji produktywności roślin 3, oraz rozkładu materii organicznej 4, zrozumienie zbiorowisk mikroorganizmów glebowych jest niezbędne do zrozumienia ekosystemów lądowych.

Ze względu na ich stosunkowo dużą obfitość w glebie i ich sygnaturę chemiczną, biomarkery lipidowe mogą być używane do profilowania dominujących grup ekologicznych tworzących społeczności mikroorganizmów glebowych 5. Określając ilościowo biomarkery lipidowe, które są charakterystyczne dla różnych grup drobnoustrojów, możemy oszacować całkowitą liczbę lipidów, a następnie podzielić te lipidy na grupy istotne ekologicznie, takie jak bakterie Gram-dodatnie (Gm+) i Gram-ujemne (Gm-), grzyby mikoryzowe arbuskularne (AM) i saprotroficzne oraz promieniowce 5,6,7,8.

Istnieje wiele metod charakteryzowania aspektów społeczności mikroorganizmów. Metoda PLFA jest powszechnie stosowana do zrozumienia podstawowej struktury zbiorowisk drobnoustrojów. Jest to skuteczny sposób oceny względnej liczebności grup drobnoustrojów, a także całkowitej biomasy drobnoustrojów. Ze względu na szybki obrót lipidów, profilowanie PLFA pozwala również na stosunkowo szybkie wykrycie zmian w zbiorowisku mikroorganizmów glebowych i dostarcza informacji, które umożliwiają porównanie funkcji ekosystemu, np. stosunek grzybów do bakterii w celu oceny tempa obiegu składników odżywczych 1,9,10. Jednakże, chociaż metoda ekstrakcji PLFA jest uświęcona tradycją i szanowana, jest również czasochłonna i nie nadaje się dobrze do badań na skalę ekosystemu, które wymagają dużej liczby próbek z replik w skali terenowej11,12.

Dla kontrastu, metoda ekstrakcji estrem metylowym kwasów tłuszczowych (MIDI-FA) ma potencjał, aby umożliwić szybką przepustowość. W tej metodzie próbki są zmydlane, przekształcane w FAME, ekstrahowane, a następnie analizowane. Metoda MIDI-FA jest szybka, ale mniej dyskryminująca niż PLFA, która łączy ekstrakcję lipidów z separacją różnych klas lipidów13 (fosfolipidy, lipidy obojętne i glikolipidy).

W tym protokole opisujemy metodę, która łączy w sobie elementy profilowania lipidów zarówno PLFA, jak i MIDI-FA. Polega ona na ekstrakcji lipidów przy użyciu początkowych etapów ekstrakcji chloroformem zmodyfikowanej metody Bligha i Dyera, a następnie zmydlaniu i konwersji do FAME. Zapewnia to niezawodny sposób wykrywania struktury społeczności drobnoustrojów przy jednoczesnym wykluczeniu dużej części szumu tła z materiałów niemikrobiologicznych 5,14. Metoda ta została opracowana w celu osiągnięcia równowagi między protokołami PLFA i MIDI-FA, tj. zachowania większości dokładności przy jednoczesnym zwiększeniu przepustowości, aby logistycznie i ekonomicznie możliwe było analizowanie lipidów z badań na dużą skalę z wieloma próbkami15. Przeprowadzając wstępną ekstrakcję i izolując składniki rozpuszczalne w organiach (np. lipidy) przed wykonaniem MIDI-FA i kończąc to etapem oczyszczania, protokół zapewnia równowagę między szybkością a precyzją.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas całej procedury. Aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia próbki, nie dotykaj naczyń szklanych gołymi rękami. Nosić odpowiednie rękawice podczas wykonywania czynności protokołu, które wymagają obchodzenia się z chloroformem.

1. Przygotowania (2 dni na ~40 próbek)

  1. Zbierz ziemię do sterylnych worków i przetransportuj z pola w lodówce zawierającej lód. Jeżeli nie jest możliwe przesianie świeżej gleby i natychmiastowe wysuszenie, należy przechowywać próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia analizy.
  2. Przygotuj glebę przez homogenizację. Usunąć korzenie i pestki, a bryły rozbić przez grube przesiewanie (np. 2 mm).
  3. Przygotować się do liofilizacji, umieszczając podpróbki w odpowiednim pojemniku zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji liofilizatora i jak najszybciej wysuszyć na zimno. Po wysuszeniu gleby liofilizuj ją w szczelnie zamkniętym pojemniku ze środkiem osuszającym do czasu ekstrakcji. Najlepiej przechowywać liofilizowaną glebę w temperaturze co najmniej -20 °C, ale najlepiej w temperaturze -80 °C.
  4. Przygotowując się do ekstrakcji, usuń liofilizowane gleby z magazynu i zmiel do konsystencji mąki. Metody mielenia obejmują młyn kulowy, ubijak kulowy oraz moździerz i tłuczek. Po zmieleniu ziemi przechowywać w zamrażarce (patrz 1.3).
    UWAGA: Ilość próbki użytej do ekstrakcji zależy od zawartości materii organicznej. Ogólną wytyczną jest użycie od 0,5 do 1 g gleby o zawartości od 12 do 18% węgla w masie i od 3 do 5 g w przypadku gleby o zawartości od 1 do 3% węgla w masie.
  5. Wstępnie przepłukać probówki wirówkowe o pojemności 30 ml heksanem. Dodaj około 2 do 3 ml heksanu do probówek i wiruj przez 5 sekund. Zdekantować heksan do innej probówki i wirować. Heksan (2 do 3 ml) może być używany do seryjnego płukania sześciu probówek. Rurki płukane heksanem należy przechowywać odwrócone do góry dnem w dygestorium, a zużyty heksan wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady.
  6. Zawiń szkło w 2 do 3 warstw folii aluminiowej i umieść w piecu muflowym. Piec (muflować) szklane naczynia w temperaturze 450 °C przez 4,5 godziny.
  7. Przygotuj odczynniki.
    1. Dla użytej ilości gleby dodaj chemikalia w stosunku objętościowym 0,8:1:2 dla buforu fosforanowego (bufor P):CHCl3:MeOH.
    2. Przygotować roztwór buforu P: Bufor fosforanowy: 0,1 M, pH 7,0.
      1. Dodać 61 ml sterylnego bulionu 1M K2HPO4 (substancja chemiczna powinna być klasy ACS lub lepszej). Dodać 39 ml sterylnego bulionu 1 M KH2PO4 (substancja chemiczna powinna być klasy ACS lub lepszej). Napełnij do 1000 ml wodą typu 1. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Niewykorzystany roztwór przechowywać do 7 dni w temperaturze otoczenia lub 30 dni w lodówce.
      2. Alternatywnie, odważyć 10,62 gK2HPO4 i 5,31 g KH2PO4; rozcieńczyć do 1 l wodą typu 1. Sprawdź pH, wyreguluj w razie potrzeby.
    3. Przygotować odczynnik 1, odczynnik do zmydlania.
      1. Nalej 300 ml wody typu 1. Dodać 300 mlCH3OH (stopień HPLC lub wyższy). Dodać 90,00 g NaOH (certyfikowany ACS lub lepszy). Dodaj granulki NaOH do roztworu, mieszając. Mieszaj, aż granulki się rozpuszczą. Zaleca się przechowywanie tego roztworu nie dłużej niż 30 dni.
    4. Przygotować odczynnik 2, odczynnik do metylacji.
      1. Dozować 275 mlCH3OH (klasa HPLC lub wyższa). Dodaj 325 ml certyfikowanego 6,00 N HCL, mieszając. Zaleca się przechowywanie tego roztworu nie dłużej niż 30 dni.
    5. Przygotować odczynnik 3, odczynnik ekstrakcyjny: 50 % C6H14 (heksan), 50% C5H12O (MTBE).
      1. W dygestorium połączyć 200 ml C6H14 (klasa HPLC lub wyższa) i 200 ml C5H12O (klasa HPLC lub wyższa). Dobrze wymieszaj; szczelnie zakryć. Przechowywać w szafce na materiały łatwopalne lub okapie nie dłużej niż 1 rok.
    6. Przygotuj odczynnik 4, odczynnik do płukania bazy.
      1. Wlej 900 ml wody typu 1 do zlewki. Dodaj 10,80 g NaOH (Certified ACS lub lepszy) podczas mieszania. Mieszaj, aż granulki się rozpuszczą. Zaleca się przechowywanie tego roztworu nie dłużej niż 30 dni.
    7. Przygotować roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego.
      1. Odważyć 100 mg wzorca 19:0 EE. Dodać do 50 ml kolby miarowej przepłukanej heksanem. Dodać ~15 ml roztworu Hexane-MTBE (odczynnik 3) do kolby, zamieszać do rozpuszczenia. Uzupełnić do 50 ml roztworem Hexane-MTBE (odczynnik 3). Zakręć i zamieszaj, aby wymieszać. Przenieść do szklanych probówek płukanych heksanem z nakrętkami wyłożonymi PTFE i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. DZIEŃ 1 - Ekstrakcja kwasów tłuszczowych z gleby (4 do 5 godzin dla ~40 próbek)

  1. Przygotuj trzy pipety dozujące o pojemności od 5 do 10 ml do buforu P, chloroformu i metanolu.
    UWAGA: Zaproponowano mniej niebezpieczne alternatywy dla chloroformu jako ekstrahenty. Mogą one skutkować równoważnymi wskaźnikami odzysku lipidów 16,17, ale nie są oceniane w tym protokole.
  2. Zważyć liofilizowane gleby do probówek wirówkowych o pojemności 30 ml i zanotować masę gleby.
  3. Zrób dwa puste miejsca i dołącz standard kontrolny (gleba, która została wcześniej wydobyta).
  4. W dygestorium dodać odczynniki do gleby w probówce wirówkowej w następującej kolejności: P-bufor, CHCl3 i MeOH (Tabela 1). Poczekaj, aż gleba zwilży się po dodaniu buforu P przed dodaniem CHCl3. Szczelnie przykryj probówki wirówkowe i przykryj, aby chronić je przed światłem.
  5. Umieść je na wytrząsarce poziomo, upewniając się, że są dobrze zabezpieczone. Przy ustawieniu prędkości obrotowej 280 obr./min, potrząsaj przez 1 h18.
  6. Przygotować dwie szklane probówki o wymiarach 16 mm x 150 mm dla każdej próbki w następujący sposób: Oznaczyć probówkę i dodać taką samą objętość CHCl3 i równą objętość buforu P.
  7. Wyjąć probówki wirówkowe z wytrząsarki i wirować przez 10 minut w temperaturze 1,430 x g i temperaturze 25 °C. W szklanej probówce powinna być widoczna separacja faz
    8. .
  8. W dygestorium zdekantować supernatant z probówki wirówkowej do jednej z probówek przygotowanych w kroku 2.6. Powtórzyć kroki od 2.4 do 2.5 i zdekantować supernatant do drugiej probówki.
  9. Bezpiecznie zakryj wszystkie szklane rurki 16 mm × 150 mm nakrętkami wyłożonymi PTFE i odwróć 10 x do wymieszania.
  10. Pozostawić próbki w spokoju przez noc do całkowitego rozdzielenia dwóch faz. W tym celu należy przechowywać próbki w ciemnej szafce/pomieszczeniu lub przykryć folią aluminiową w temperaturze pokojowej. Dopuszczalne jest pozostawienie ekstraktów do rozdzielenia w ciągu weekendu.
    1. Alternatywnie, jeśli ktoś chce przejść bezpośrednio do następnego etapu lub jeśli próbki zostaną naruszone następnego dnia, należy odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Wszystkie próbki w grupie porównawczej należy poddać temu samemu czasowi separacji faz
      2. .

3. DZIEŃ 2 - Izolacja lipidów (3 do 4 godzin dla ~40 próbek)

  1. Włączyć aparat do odparowywania i pułapkę rozpuszczalnika. Ustawić aparat do odparowywania na 33 °C i podgrzać.
  2. Ustaw aspirator próżniowy w kapturze: kolbę z bocznym ramieniem podłączoną do pompy próżniowej, rurkę o wysokiej czystości i szklaną pipetę.
  3. Zassać górną warstwę i granicę faz (około 2/3 drogi w dół) dwóch szklanych rurek, zachowując warstwę wodną. Powtórzyć proces, używając czystej pipety dla każdej próbki.
  4. Połączyć wodne warstwy ekstraktu z drugiej probówki z warstwami ekstraktu z pierwszej probówki, ostrożnie dekantując. Upewnij się, że dekantowana rura jest wolna od zadrapań lub pęknięć.
  5. Po połączeniu ekstraktówCHCl 3 sprawdź płyn - powinien być klarowny. Jeśli nie, dodaj MeOH, aż będzie czysty.
  6. Wysuszyć wszystkie próbki za pomocą aparatu do odparowywania próżniowego. Zacznij od ustawień temperatury 33 °C, prędkości wiru 26% i ciśnienia 400 mbar.
  7. Umieścić próbki w układzie odparowywania i po 10 minutach powoli obniżyć ciśnienie do 350 mbar.
  8. Monitoruj postęp, a gdy poziom cieczy w rurze osiągnie poziom bloku grzewczego, zmniejsz ciśnienie do 300 mbar.
  9. Kontynuuj monitorowanie wysokości pozostałej cieczy, a gdy osiągnie ona głębokość około 1 cm, zmniejsz ciśnienie do 200 mbar.
  10. Po wyschnięciu próbek należy je usunąć i uruchomić pompę na dodatkowe 10 minut, aby usunąć opary.
  11. Szczelnie zamknąć probówki i przechowywać lipidy w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  12. Zasysaną ciecz należy utylizować zgodnie z obowiązującymi przepisami bezpieczeństwa chemicznego.

4. DZIEŃ 3 - Zmydlanie i metylacja (6 do 7 godzin dla ~40 próbek)

  1. Włącz łaźnie wodne. Ustaw kąpiel od 1 do 95 °C, a kąpiel od 2 do 80 °C.
  2. Ustaw dozowniki pipet i upewnij się, że dozują odpowiednią objętość.
    Odczynnik 1: 1 ml na próbkę
    Odczynnik 2: 2 ml na próbkę
    Odczynnik 3: 1,25 ml na próbkę
    Odczynnik 4: 3 ml na próbkę
    UWAGA: Proces ogrzewania spowoduje wytworzenie ciśnienia w rurze. Nie używaj porysowanych, pękniętych lub wyszczerbionych rurek.
  3. Za pomocą dozownika pipetowego dodać 1,0 ml odczynnika 1 do wysuszonych lipidów. Zakręć szczelnie, wiruj przez 5 s i umieść w stojaku.
  4. Umieścić stojak z probówkami na próbki w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na 5 minut. Zdjąć stojak z probówkami z wanny i sprawdzić, czy rurki nie przeciekają, na co wskazują pęcherzyki unoszące się w probówce. Dokręć lub załóż zaślepki nieszczelnych rurek i ponownie sprawdź, czy nie ma pęknięć lub odprysków. Kontynuuj podgrzewanie rurek w łaźni wodnej przez dodatkowe 10 minut.
  5. Wyjąć próbki z łaźni 1 i umieścić w łaźni 2 (80 °C) i kontynuować inkubację przez kolejne 15 minut.
  6. Wyjmij probówki i schłodzić próbki, umieszczając ruszt w garnku z wodą z kranu w celu schłodzenia.
  7. Dodać 2 ml odczynnika 2 do każdej próbki. Szczelnie zakryj i wiruj przez 5 do 10 sekund.
  8. Umieścić ruszt w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C i inkubować przez 10 minut.
  9. Wyjmij stojak z rurkami z łaźni wodnej i włóż do garnka z wodą z kranu w celu schłodzenia. Mieszaj stojak rur, aby przyspieszyć proces chłodzenia.
    UWAGA: Nie przekraczaj czasu i temperatury. Zbyt duże ogrzewanie może spowodować degradację FAME.
  10. Za pomocą dozownika pipetowego dodać 1,25 ml odczynnika 3 do każdej probówki z próbką, aby wyekstrahować estry metylowe kwasów tłuszczowych. Szczelnie zakręć i umieść probówki na shakerze na 10 minut.
  11. Po wstrząśnięciu pozostaw stojak z probówkami na 10 minut, aby fazy się rozdzieliły. Przenieść fazę organiczną (warstwę wierzchnią) do szklanej probówki o wymiarach 16 mm x 100 mm za pomocą szklanej pipety.
  12. Powtórzyć ekstrakcję, ponownie dodając odczynnik 3, wstrząsając, pozwalając fazom się rozdzielić i przenosząc fazę górną.
    UWAGA: Nie przenoś żadnej dolnej fazy. Dobrze jest pozostawić niewielką ilość górnej fazy w probówce.
  13. Za pomocą dozownika do pipet dodać 3 ml odczynnika 4 do probówek o wymiarach 16 mm x 100 mm.
  14. Szczelnie zakryj probówki i wiruj przez 20-30 s.
  15. Po wirowaniu wirować przez 3 minuty przy 1 000 × g.
  16. Za pomocą pipety z czystego szkła odessać górną fazę organiczną i przenieść do bursztynowej fiolki o pojemności 4 ml.
  17. Włączyć aparat do odparowywania i pułapkę rozpuszczalnika. Ustawić aparat do odparowywania na 30 °C, prędkość wiru na 26%, próżnię na 200 mbar i nacisnąć podgrzewanie.
  18. Monitoruj postępy. Po wyschnięciu próbek należy je usunąć i uruchomić pompę na dodatkowe 10 minut, aby usunąć opary.
  19. Wyjąć pipetę z butelek z odczynnikami 1 i 4 i przepompować przez rozcieńczony kwas (np. 1% HCl), a następnie wodę z roztworem dozwolonym. Przepłukać pipetę używaną do odczynnika 2, przepompowując ją przez wodę z d.I. Spuść rozpuszczalnik z pipety używanej do odczynnika 3 do odpowiedniego pojemnika i trzymaj go w kapturze, aż pozostałości rozpuszczalnika odparują.
  20. Pipety należy przechowywać odwrócone, z usuniętymi tłokami, aby zapobiec zakleszczeniu się zaworów zwrotnych.
  21. Jednorazowo należy użyć szklanych pipet, a następnie wyrzucić do odpowiedniego pojemnika.
  22. W okapie poczekaj, aż pozostałości rozpuszczalnika na szklanych naczyniach odparują.
  23. Opłucz szklane naczynia czystą wodą i roztworem detergentu.

5. DZIEŃ 4 - Przygotowanie roztworu roboczego i przeniesienie FAME do fiolek GC (2-3 h dla ~40 próbek)

  1. Zebrać materiały: 4 ml bursztynowe fiolki z wysuszonymi próbkami; bursztynowe 2 ml fiolki GC; 400 μl wkłady szklane i nakrętki z płaskim dnem; szklana strzykawka 500 μl; kolba miarowa 50 ml; Roztwór podstawowy - nonadekanian etylu (wzorzec wewnętrzny 19:0 EE) w heksanie 50/50/MTBE (odczynnik 3).
  2. Za pomocą szklanej strzykawki dodać 500 μl roztworu podstawowego nonadekanianu etylu (19:0 EE) do kolby miarowej o pojemności 50 ml.
  3. Napełnij kolbę do wyniku wolumetrycznego odczynnikiem 3.
  4. Zakręć kolbę i odwróć 5x, aby wymieszać.
  5. Przenieść 3 ml do czystej fiolki o pojemności 4 ml w celu uzyskania zbiornika roztworu roboczego.
  6. Za pomocą szklanej strzykawki dodać 300 μl roztworu roboczego do każdej z 4 ml fiolek zawierających wysuszone estry metylowe kwasów tłuszczowych i nakrętkę.
  7. Wirować próbkę przez 15 s i odstawić na 15 minut.
  8. Za pomocą szklanej pipety Pasteura ostrożnie przenieść zawieszone estry metylowe kwasów tłuszczowych do fiolki o pojemności 2 ml GC zawierającej wkładkę o pojemności 400 μl.
  9. Przed analizą przechowywać szczelnie zamknięte fiolki GC w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  10. Prześlij próbki do analizy GC.
    UWAGA: Analizę należy przeprowadzić przy użyciu specjalnej kolumny GC i warunków, które są opisane w pliku uzupełniającym S1. Najlepiej, aby analiza GC została zakończona w ciągu 2 tygodni od metylacji.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tabele danych z raportów mogą być zestawione do arkusza kalkulacyjnego lub bazy danych. Po skorygowaniu o współczynnik odpowiedzi (współczynnik korekcyjny, który normalizuje odpowiedź dla różnych długości łańcucha), obszary pików można porównać z powierzchnią piku wzorców zewnętrznych lub wewnętrznych, aby uzyskać stężenie w ekstrakcie. Dzieląc przez masę wydobytej gleby, dane można wyrazić jako masę FAME na gram gleby lub, przy użyciu masy cząsteczkowej każdego FAME, częściej podawaną wartość nmol na gram gleby. Suma mikrobiologicznych FAME wskazuje na całkowitą biomasę mikrobiologiczną i może być porównywana między zabiegami (Rysunek 1). Niektóre FAME mogą być również powiązane z określonymi grupami drobnoustrojów, takimi jak bakterie Gram-dodatnie lub Gram-ujemne, promieniowce, arbuskularne grzyby mikoryzowe i grzyby saprotroficzne 19,20,21,22,23,24. Proporcje masy określonych biomarkerów mogą odzwierciedlać względną liczebność tych grup (Rysunek 2). Ogólne wzorce liczebności FAME tworzą odciski palców na poziomie społeczności, które umożliwiają porównanie różnic między społecznościami mikrobiologicznymi za pomocą technik wielowymiarowych, takich jak ordynacja (Rysunek 3). W przeciwieństwie do większości podejść opartych na DNA, dane lipidowe na poziomie społeczności mogą być analizowane jako obfitość względna lub bezwzględna. Jeśli całkowita biomasa różni się znacznie między próbkami, te dwa podejścia dadzą bardzo różne wyniki; Pytania ekologiczne leżące u podstaw eksperymentu powinny określić, które podejście zostanie zastosowane.

figure-results-1
Rysunek 1: Całkowita biomasa FAME. Porównanie całkowitej biomasy biomarkerów FAME (gleba nmol g-1) z ciągłej kukurydzy, nawożonej prerii i nienawożonej prerii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Biomasa bakterii i grzybów FAME. Porównanie leczenia biomasy biomarkerów bakteryjnych i grzybiczych FAME (gleba nmol g-1) z ciągłej kukurydzy, nawożonej prerii i nienawożonej prerii. Masa grzybowa i bakteryjna z absolutnej obfitości. Średnia (suma f/suma b). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Niemetryczne skalowanie wymiarowe biomarkerów lipidowych FAME. Porównanie całej społeczności drobnoustrojów przy użyciu bezwzględnych profili liczebności wszystkich mikrobiologicznych biomarkerów lipidowych FAME. W tym przykładzie ciągłe zbiorowiska kukurydzy i niezapłodnione prerii rozdzieliły się i są bardzo daleko od siebie, podczas gdy niektóre zapłodnione próbki prerii mają zbiorowiska mikroorganizmów przypominające te z kukurydzy, a inne przypominają niezapłodnioną prerię. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Tabela 1: T h e sol vent typ, proporcjonalnie do dodanego g-1 gruntu, and their order of addition. Jest to ważne dla prawidłowej ekstrakcji i separacji fazy organicznej i wodnej.

Plik uzupełniający S1: Kliknij tutaj, aby pobrać.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku badania wielu próbek z eksperymentów z wieloma powtórzeniami i/lub jednostkami eksperymentalnymi, naukowcy mogą uznać, że analiza fosfolipidowych kwasów tłuszczowych (PLFA) jest zaporowa pod względem czasu i materiałów25. Metodą PLFA fosfolipidy błon komórkowych są ekstrahowane, oczyszczane i identyfikowane za pomocą zmodyfikowanej dwufazowej ekstrakcji wodno-organicznej Bligh and Dyer26. Następnie przeprowadza się chromatografię krzemionkową w fazie stałej w celu oddzielenia lipidów według polarności oraz zasadową metylację fosfolipidowych kwasów tłuszczowych do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. W profilowaniu PLFA wydajność lipidów może być niska, ale o bardzo wysokiej czystości. W ramach projektu Microbiologal ID wprowadzono alternatywną metodę, procedurę estru metylowego kwasów tłuszczowych (MIDI-FA). W metodzie MIDI-FA wszystkie lipidy są ekstrahowane bezpośrednio z czystych kultur lub próbek gleby/osadów 11,12,27 poprzez zmydlanie. Ta metoda ma mniejszą utratę lipidów i jest szybka, ponieważ nie ma żadnych etapów koncentracji ani oczyszczania metody PLFA. Jednakże, chociaż metoda MIDI-FA jest szybka i tańsza, ponieważ została pierwotnie zaprojektowana do identyfikacji organizmów w czystej kulturze, nie ma wstępnych etapów ekstrakcji lub oczyszczania. W związku z tym może zawierać związki podobne do lipidów ekstrahowane z materii organicznej gleby, które zniekształcają sygnaturę zbiorowiska 27,28,29. Ze względu na to, że włączenie to może również zniekształcić pomiary biomasy, MIDI-FA jest zazwyczaj używany tylko do zgrubnego jakościowego opisu lipidów w glebie13.

Opisana tutaj procedura łączy w sobie to, co najlepsze z dwóch oddzielnych procedur ekstrakcji: 1) ekstrakcję i koncentrację lipidów przy użyciu zmodyfikowanej metody Bligha i Dyera26 oraz 2) procedurę zmydlania, metylacji, ekstrakcji i płukania estrów metylowych kwasów tłuszczowych opracowanych komercyjnie. Metoda ta została opracowana w celu osiągnięcia korzyści płynących z obu tych protokołów przy jednoczesnej minimalizacji wad15. Przeprowadzając wstępną ekstrakcję i izolując składniki rozpuszczalne w organiach (np. lipidy) przed wykonaniem MIDI-FA i kończąc to etapem oczyszczania, protokół ten zapewnia równowagę między szybkością a precyzją. Chociaż metoda ta może nie być odpowiednia, gdy wymagana jest wysoka czystość (tj. do analizy 13C PLFA) lub gdy oddzielnie analizuje fosfolipidy i lipidy obojętne, w wielu przypadkach umożliwia wykrywanie reakcji społeczności drobnoustrojów na warunki środowiskowe z większą czułością niż metody oparte na DNA 30,31,32,33. Lipidy błonowe rozkładają się szybko po śmierci komórki, co pozwala im odzwierciedlać żywą społeczność drobnoustrojów w momencie pobieraniapróbek 5,7, w przeciwieństwie do środowiskowego DNA, w którym większość informacji pochodzi z martwych lub nieaktywnych organizmów34. Biorąc pod uwagę wysoki wskaźnik spoczynku obserwowany wśród mikroorganizmów glebowych35, charakterystyka żywej biomasy może być wykorzystana do zrozumienia czasowych interakcji roślina-mikroorganizmy w stosunkowo drobnej skali czasowej, a biomarkery lipidowe można wykorzystać do oceny stanu fizjologicznego społeczności drobnoustrojów7. Wykazano, że do oceny odpowiedzi mikrobiologicznej w warunkach dużego pola wymagane są metody wysokoprzepustowe25 i chociaż metoda, którą tutaj proponujemy, nie odtwarza dokładności profilowania biomarkerów PLFA, zwiększa przepustowość, jednocześnie minimalizując zmienność realizowaną za pomocą procedury MIDI-FA. Metoda ta okazała się skutecznym narzędziem w rozwiązywaniu problemów związanych z dynamiką zbiorowisk mikrobiologicznych na szerokim zakresie gleb w zakrojonych na szeroką skalę badaniach rolniczych i ekosystemowych 36,37,38,42,43,44,45,46,47,48,49,50.

Klas lipidów łączy się tą metodą i może dojść do utraty informacji zawartych w tych oddzielnych klasach22,39, ale połączenie klas lipidów może wzmocnić moc wykrywania arbuskularnego pochodzenia grzybów mikoryzowych 16:1 ω5c zarówno z lipidów fosfo-, jak i obojętnych40. Ponadto, chociaż liczba nieznanych kwasów tłuszczowych (które mogą pochodzić z nieożywionej materii organicznej) może być wyższa w przypadku tej metody, wykazano, że jest ona niższa niż MIDI-FA i pozwala na porównanie profili lipidowych z badań z wieloma próbkami, w których problemem jest przepustowość próbki15. Ogólnie uważa się, że frakcja neutralna pochodzi głównie z lipidów zapasowych wytwarzanych przez grzyby, chociaż może być również mniejszy wkład fauny glebowej41. W związku z tym opisana tutaj metoda może dać wyniki wykazujące większy udział lipidów grzybów 18:2 ω 6,9c i 18:1 ω 9c niż PLFA. Pozostałe lipidy, które mają tendencję do pojawiania się we frakcji neutralnej, to niektóre nasycone kwasy tłuszczowe, np. 16:0, 18:0, 20:0.

Istnieją różne sposoby wyrażania i analizowania danych dotyczących lipidów. Najczęstszymi reprezentacjami są obfitość (nmol g-1 gleba), frakcja molowa (nmol pojedynczy lipid nmol-1 całkowity lipid) i procent molowy (frakcja molowa * 100). Znormalizowane przez całkowitą zawartość lipidów w próbce, ułamek molowy i procent molowy są miarami względnej obfitości danego lipidu. Po odpowiednim przekształceniu, np. pierwiastek kwadratowy sinus łukowy, ułamek molowy jest odpowiedni do użycia w analizie przez składowe główne lub ordynacji analizy redundancji. Obfitość to bezwzględna ilość danego lipidu wyekstrahowanego na gram gleby. Ponieważ ilość lipidów w komórce jest rozsądnie stała, a ekstrakcja lipidów jest wysoce wydajna i kompleksowa, całkowita obfitość jest dobrym oszacowaniem całkowitej ilości lipidów, a obfitość kluczowych wskaźników odzwierciedla biomasę grupy ekologicznej, którą reprezentuje17. Wreszcie, dobrym sposobem przyjrzenia się składowi społeczności drobnoustrojów jest zastosowanie metod analizy wielowymiarowej16, np. metody porządkowania, takie jak niemetryczne skalowanie wielowymiarowe (NMDS - które nie wymaga transformacji danych) lub analiza głównych składowych (PCA), mogą być przydatne do porównywania względnej obfitości wszystkich biomarkerów lipidowych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) oraz DOE OBP Office of Energy of Energy and Renewable Energy (DE-AC05-76RL01830). Autorzy pragną podziękować Andersowi Gurdzie za jego cierpliwy i umiejętny wkład w filmowanie i montaż.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RapidVapLabconco7900000System wyparny
RapidVapLabconco7491400Blok próbek
Pompa próżniowa odporna na chemikaliaLabconco7584000Pompa próżniowa
Kanister pułapki chemicznejLabconco7815300Kanister pułapki
Wkład rozpuszczalnikaLabconco7515200Wkład pułapki rozpuszczalnika
Pompa membranowaWelch7398000Pompa próżniowa DryFast
Łaźnia wodnaFisher15-462-15Q2 studniowa łaźnia wodna
Chromatograf gazowyRóżneNie dotyczyanalizy próbki
WirówkaRóżneNieDo separacji próbek
LiofilizatorRóżneNie dotyczyDo liofilizacji próbek
Repipet (6)BrandTech4720440Do dozowania odczynników
VortexFisher02-215-365Analogowy mieszalnik wirowy
Teflonowe probówkiThermo/Nalgene3114-0030Teflonowe probówki
Nakrętki Thermo/NalgeneDS3131-0020Nasadki do probówek teflonowych
ProbówkaCorning9825-16Probówki
ProbówkaCorning9825-16xxProbówki 16x150mm Nakrętki
Corning9998-1515-415 gwint czarne nasadki fenolowe z wkładką PTFE
Pipety PasteuraFisher13-678-20BSzklana
strzykawka 14,6 cm 500 uLFisher13684106LCHamilton 81217
Fiolki bursztynoweAgilent5182-07164mL Bursztynowe fiolki
NakrętkiAgilent5182-0717Niebieskie nakrętki
WkładkiAgilent5181-3377400uL płaskie wkładki szklane
Standardy
19:0 nonadekanonian etylu (nonadekanonian etylu)VWRTCN0459-5GStandard
analitycznyChemikalia
Fosforan dipotasowy (K2HPO4 - klasa ACS lub lepsza)RóżneNiewytwarzania monozasadowego fosforanu fosforanowego
fosforanu potasu (KH2PO4 - klasa ACS lub lepsza)Różnenie dotyczywytwarzania metanolu fosforanowo-buforowego
(CH3OH - klasa HPLC lub lepsza)RóżneNie dotyczywytwarzania odczynników 1 i 2
Wodorotlenek sodu (NaOH - klasa ACS lub lepsza)RóżneNie dotyczyDo wytwarzania odczynników 1 i 4
Kwas solny (6N HCL)RóżneNie dotyczywytwarzania odczynnika 2
Heksan (klasa HPLC lub lepsza)RóżneNie dotyczyDo wytwarzania odczynnika 3
MTBE (eter metylowo-tert-butylowy - klasa HPLC lub lepsza)RóżneNie dotyczyDo wytwarzania odczynnika 3
Do dotyczy wirówkowe 16x100mm dotyczy Do Do Do Do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).">Van Der Heijden, M. G. a, Bardgett, R. D., Van Straalen, N. M. The unseen majority: Soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecol Lett. 11 (3), 296-310 (2008).
  2. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25 (8), 468-478 (2010).">Bever, J. D., et al. Rooting theories of plant community ecology in microbial interactions. Trends Ecol Evol. 25 (8), 468-478 (2010).
  3. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36 (2), 137-144 (2013).">Suleiman, A. K. A., Manoeli, L., Boldo, J. T., Pereira, M. G., Roesch, L. F. W. Shifts in soil bacterial community after eight years of land-use change. Syst Appl Microbiol. 36 (2), 137-144 (2013).
  4. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).">Sayer, E. J., et al. Grassland management influences spatial patterns of soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 61, 61-68 (2013).
  5. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66 (1), 145-157 (2013).">Fernandes, M. F., Saxena, J., Dick, R. P. Comparison of Whole-Cell Fatty Acid (MIDI) or Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Extractants as Biomarkers to Profile Soil Microbial Communities. Microbial Ecol. 66 (1), 145-157 (2013).
  6. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363 (1-2), 1-5 (2013).">van der Heijden, M. G. A., Wagg, C. Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning. Plant Soil. 363 (1-2), 1-5 (2013).
  7. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69 (5), 1412-1421 (2005).">Allison, V. J., Miller, R. M., Jastrow, J. D., Matamala, R., Zak, D. R. Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence. Soil Sci Soc Am J. 69 (5), 1412-1421 (2005).
  8. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81 (1-4), 509-520 (2002).">Kowalchuk, G. A., Buma, D. S., de Boer, W., Klinkhamer, P. G. L., van Veen, J. A. Effects of above-ground plant species composition and diversity on the diversity of soil-borne microorganisms. A van Leeuw. 81 (1-4), 509-520 (2002).
  9. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22 (3), 261-264 (1996).">Bardgett, R. D., Hobbs, P. J., Frostegard, A. Changes in soil fungal:bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland. Biol Fert Soils. 22 (3), 261-264 (1996).
  10. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43 (8), 1621-1625 (2011).">Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol Biochem. 43 (8), 1621-1625 (2011).
  11. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60 (7), 2483-2493 (1994).">Haack, S. K., Garchow, I. H., Odelson, D. A., Forney, L. J., Klug, M. J. Accuracy , Reproducibility , and Interpretation of Fatty Acid Methyl Ester Profiles of Model Bacterial Communitiest. Appl Environ Microbiol. 60 (7), 2483-2493 (1994).
  12. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).">Drenovsky, R. E., Elliott, G. N., Graham, K. J., Scow, K. M. Comparison of phospholipid fatty acid ( PLFA ) and total soil fatty acid methyl esters ( TSFAME ) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem. 36, 1793-1800 (2004).
  13. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).">Cavigelli, M. A., Robertson, G. P., Klug, M. Fatty acid methyl ester ( FAME ) profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil. 170, 99-113 (1995).
  14. https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).">Findlay, R. Determination of microbial community structure using phospholipid fatty acid profiles. Molecular microbial ecology manual. , Available from: https://www.researchgate.net/profile/Robert_Findlay2/publication/281208148_Determination_of_microbial_community_structure_using_phospholipid_fatty_acid_profiles/links/55db4f0b08aec156b9afe776.pdf 2885-2906 (2004).
  15. Balser, T. C., Liang, C., Gutknecht, J. L. Linking microbial community analysis and ecosystem studies: A rapid lipd analysis protocol for high throughput. Biol Fert Soils. , Forthcoming (2017).
  16. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55 (11), 2888-2893 (1989).">Findlay, R. H., King, G. M., Watling, L., Watling, L. E. S. Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sediments Efficacy of Phospholipid Analysis in Determining Microbial Biomass in Sedimentst. Appl Environ Microbiol. 55 (11), 2888-2893 (1989).
  17. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118 (6), 1251-1263 (2015).">Willers, C., Jansen van Rensburg, P. J., Claassens, S. Microbial signature lipid biomarker analysis - an approach that is still preferred, even amid various method modifications. J Appl Microbiol. 118 (6), 1251-1263 (2015).
  18. http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).">Balser, T. C. Phospholipid Fatty-acid Analysis (PLFA). Protocol. , Available from: http://nature.berkeley.edu/soilmicro/methods/BalserPLFA.pdf (2017).
  19. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24 (4), 317-323 (1992).">Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty-acids in phospholipids and lipopolysachharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 24 (4), 317-323 (1992).
  20. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3605-3617 (1993).">Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. Phospholipid fatty-acid composition, biomass, and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3605-3617 (1993).
  21. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24 (3), 365-374 (1986).">Federle, T. W., Dobbins, D. C., Thorntonmanning, J. R., Jones, D. D. Microbial biomass, activity, and community structure in subsurface soils. Ground Water. 24 (3), 365-374 (1986).
  22. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39 (8), 535-541 (1989).">Vestal, J. R., White, D. C. Lipid analysis in microbial ecology - quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience. 39 (8), 535-541 (1989).
  23. Wilkinson, S. G. Gram negative bacteria. Microbial Lipids. , 299-488 (1988).
  24. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37 (3), 601-604 (2005).">Balser, T. C., Treseder, K., Ekenler, M. Using lipid analysis and hyphal length to quantify AM and saprotrophic fungal abundance along a soil chronosequence. Soil Biol Biochem. 37 (3), 601-604 (2005).
  25. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).">Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  26. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).">Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Phys. (37), 911-917 (1959).
  27. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of Fatty Acid Methyl Ester (FAME) Methods for Characterizing Microbial Communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
  28. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).">Jandl, G., Leinweber, P., Schulten, H., Ekschmitt, K. Contribution of primary organic matter to the fatty acid pool in agricultural soils. Soil Biol Biochem. 37, 1033-1041 (2005).
  29. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).">Nielsen, P., Petersen, S. O. Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem. 32, 1241-1249 (2000).
  30. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).">Duncan, D. S., Jewell, K. A., Suen, G., Jackson, R. D. Detection of short-term cropping system-induced changes to soil bacterial communities differs among four molecular characterization methods. Soil Biol Biochem. 96, 160-168 (2016).
  31. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).">Liang, C., et al. Switchgrass rhizospheres stimulate microbial biomass but deplete microbial necromass in agricultural soils of the upper Midwest, USA. Soil Biol Biochem. 94, 173-180 (2016).
  32. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43 (10), 2184-2193 (2011).">Jangid, K., et al. Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties. Soil Biol Biochem. 43 (10), 2184-2193 (2011).
  33. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49 (2), 191-205 (2004).">Ritz, K., et al. Spatial structure in soil chemical and microbiological properties in an upland grassland. FEMS Microbiol Ecol. 49 (2), 191-205 (2004).
  34. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53 (9), 1689-1699 (2013).">Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. J Chem Inf Model. 53 (9), 1689-1699 (2013).
  35. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9 (2), 119-130 (2011).">Lennon, J. T., Jones, S. E. Microbial seed banks: The ecological and evolutionary implications of dormancy. Nat Rev Microbiol. 9 (2), 119-130 (2011).
  36. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).">Gutknecht, J. L. M., Field, C. B., Balser, T. C. Microbial communities and their responses to simulated global change fluctuate greatly over multiple years. Glob Change Biol. 18, 225-269 (2012).
  37. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).">Pei, Z., et al. Soil and tree species traits both shape soil microbial communities during early growth of Chinese subtropical forests. Soil Biol Biochem. 96, 180-190 (2016).
  38. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).">Oates, L. G., Duncan, D. S., Sanford, G. R., Liang, C., Jackson, R. D. Bioenergy cropping systems that incorporate native grasses stimulate growth of plant-associated soil microbes in the absence of nitrogen fertilization. Ag Ecosys Environ. 233, 396-403 (2016).
  39. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45 (4), 373-383 (2003).">Bååth, E. The use of neutral lipid fatty acids to indicate the physiological conditions of soil fungi. Microbial Ecol. 45 (4), 373-383 (2003).
  40. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807(2012).">Ngosong, C., Gabriel, E., Ruess, L. Use of the signature Fatty Acid 16:1ω5 as a tool to determine the distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in soil. J Lipids. 2012, 236807(2012).
  41. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).">Sharma, M. P., Buyer, J. S. Comparison of biochemical and microscopic methods for quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in soil and roots. Appl Soil Ecol. 95, 86-89 (2015).
  42. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).">Oates, L. G., Balser, T. C., Jackson, R. D. Subhumid pasture soil microbial communities affected by presence of grazing, but not grazing management. Appl Soil Ecol. 59, 20-28 (2012).
  43. Liang, C. Potential legacy effects of biofuel cropping systems on soil microbial communities in southern Wisconsin, USA. Ag Sci. 2 (2), 131-137 (2011).
  44. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9 (12), 1-14 (2014).">Herzberger, A. J., Duncan, D. S., Jackson, R. D. Bouncing Back Plant-Associated Soil Microbes Respond Rapidly to Prairie Establishment. PloS One. 9 (12), 1-14 (2014).
  45. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87 (3), 570-579 (2006).">Fraterrigo, J. M., Balser, T. C., Turner, M. G. Microbial community variation and its relationship with nitrogen mineralization in historically altered forests. Ecology. 87 (3), 570-579 (2006).
  46. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39 (2), 517-525 (2007).">Kao-Kniffin, J., Balser, T. C. Elevated CO2 differentially alters belowground plant and soil microbial community structure in reed canary grass-invaded experimental wetlands. Soil Biol Biochem. 39 (2), 517-525 (2007).
  47. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284 (1-2), 85-100 (2006).">Mentzer, J. L., Goodman, R. M., Balser, T. C. Microbial response over time to hydrologic and fertilization treatments in a simulated wet prairie. Plant Soil. 284 (1-2), 85-100 (2006).
  48. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40 (10), 2699-2702 (2008).">Ushio, M., Wagai, R., Balser, T. C., Kitayama, K. Variations in the soil microbial community composition of a tropical montane forest ecosystem: Does tree species matter. Soil Biol Biochem. 40 (10), 2699-2702 (2008).
  49. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7 (1), 27-49 (2005).">Bartelt-Ryser, J., Joshi, J., Schmid, B., Brandl, H., Balser, T. Soil feedbacks of plant diversity on soil microbial communities and subsequent plant growth. Perspect Plant Ecol. 7 (1), 27-49 (2005).
  50. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).">Fichtner, A., von Oheimb, G., Härdtle, W., Wilken, C., Gutknecht, J. L. M. Effects of anthropogenic disturbances on soil microbial communities in oak forests persist for more than 100 years. Soil Biol Biochem. 70, 79-87 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipid ExtractionSoil MicrobesPLFA AnalysisFatty Acid Methyl EsterMicrobial Community StructureVacuum EvaporationGas ChromatographySaponification MethylationHexane ExtractionFreeze Drying

Related Articles