Ten protokół opisuje szczegółową metodologię wykrywania lokalizacji H2O2 w plemnikach Solea senegalensis przy użyciu czułego fluorochromu DCFH-DA dla ROS, żywego barwnika mitochondriów dla mitochondriów i DAPI dla wizualizacji jąder, odpowiednio. Protokół przeznaczony jest do wykonania w ciągu 2 godzin na świeżych lub rozmrożonych plemnikach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stres oksydacyjny jest jednym z ważnych czynników obniżających jakość nasienia. Opracowanie skutecznych protokołów wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w plemnikach ma duże znaczenie dla każdego gatunku, ale metody te są rzadko stosowane, a tym bardziej w teleostach. Kriokonserwacja jest przydatną techniką w akwakulturze do różnych celów, w tym do bankowania genów i gwarantowanej dostępności plemników przez cały rok. Procedury zamrażania/rozmrażania mogą powodować produkcję ROS i uszkodzić plemniki. Biorąc pod uwagę potencjalne uszkodzenia, jakie nadmierna produkcja ROS może spowodować w plemnikach w zależności od ich lokalizacji, przedstawiono szczegółową metodologię wykrywaniaH2O2i oceny jego lokalizacji wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej. W tym celu stosuje się kombinację 3 fluorochromów (dioctan 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA), żywe barwienie mitochondriów i dichlorowodorek 4′,6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI)) w celu oceny kolokalizacjiH2O2z jądrami plemników lub mitochondriami w próbkach nasienia Solea senegalesis.
Wprowadzenie
Produkcja reaktywnych form tlenu została ostatnio powiązana z jakością nasienia1. Chociaż produkcję ROS w mitochondriach można uznać za normalny proces fizjologiczny, stres oksydacyjny spowodowany nadmierną produkcją ROS jest wyraźną przyczyną uszkodzenia plemników na różnych poziomach. U ludzi stres oksydacyjny jest związany z niepłodnością męską, zmianą motoryki i zdolnością do ulegania kapacytacji2; u ssaków zmiana integralności DNA w zamrożonych próbkach nasienia była również związana z synteząH2O23.
Kriokonserwacja jest powszechną techniką bankowania genów w akwakulturze. Technologia ta jest szczególnie ważna w przypadku gatunków z problemami reprodukcyjnymi, takich jak Solea senegalensis. Ten cenny gatunek na rynku wykazuje dysfunkcję rozrodczą u osobników urodzonych w niewoli z powodu braku zalotów. Fakt ten sprawia, że kriokonserwacja nasienia jest konieczna, aby mieć dostępność plemników do sztucznego zapłodnienia. Jednak kriokonserwacja może być źródłem stresu oksydacyjnego, który może być szkodliwy dla plemników4, ponieważ badania wykazały korzystny wpływ suplementacji przeciwutleniaczami. Hamowanie ROS za pomocą przeciwutleniacza ukierunkowanego na mitochondria było podobno korzystne dla kriokonserwacji plemników u suma żółtego5.
Dlatego ważne jest, aby znać poziomy ROS w próbkach nasienia, szczególnie po krioprezerwacji6,7, ponieważ te cząsteczki zostały uznane za wadę dla przeżywalności i płodności plemników8. Co więcej, badanie rozmieszczenia ROS w komórce może mieć kluczowe znaczenie dla wywnioskowania poziomu potencjalnych uszkodzeń. Na przykład niski poziom ROS w mitochondriach można uznać za normalny i zgodny z funkcją plemników, ale wysoki poziom ROS w jądrze może być wskaźnikiem uszkodzenia DNA plemników. H2O2jest jednym z najbardziej istotnych ROS, który może zostać uwolniony z mitochondriów i przeniknąć do jądra, ponieważ jest małą i pozbawioną ładunku cząsteczką9. Dioctan dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) może specyficznie ujawniać wewnątrzkomórkowy nadtlenek emitujący zieloną fluorescencję. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół wykrywania lokalizacji wewnątrzkomórkowej H2O2w plemnikach Solea senegalensis za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Inkubacja fluorochromu i analiza konfokalna zajmą co najmniej 2-3 godziny dla próbki kontrolnej i poddanej działaniu substancji. Przetwarzanie danych nie jest uwzględniane w tym obliczaniu czasu. Wymagane materiały znajdują się w Tabeli Materiałów. Protokół ten można zastosować do plemników świeżych lub kriokonserwowanych. Solea senegalensis to gatunek ryby, który składa ikrę w zimnej wodzie, pracuje zawsze w niskich temperaturach (4-7 °C). Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym widokiem protokołu.
1. Prace przygotowawcze przed eksperymentem
- Przygotować 1 mM roztwór podstawowy do barwienia mitochondriów w DMSO klasy analitycznej.
- Przygotować 1 μg/ml roztworu podstawowego dichlorowodorku 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w wodzie dejonizowanej.
- Przygotować roztwór Ringera o stężeniu 200 mOsm/kg (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7)
- Przygotować 4 mM roztwór podstawowy dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) w metanolu o czystości analitycznej.
UWAGA: Roztwory podstawowe należy przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. - Ustawić mikrowirówkę na 4-7 °C.
2. Przygotowanie próbki przed inkubacją fluorochromu
UWAGA: Delikatne obchodzenie się z plemnikami jest pożądane podczas pipetowania i ponownego zawieszania.
- W przypadku pracy z komórkami kriokonserwowanymi przygotuj kąpiel wodną do rozmrożenia w temperaturze 40 °C dla plemników Solea senegalensis10. Zanurz próbki słomki w łaźni wodnej na 7 sekund.
- Za pomocą nożyczek do cięcia opróżnić próbkę do probówki do mikrofugi i odwirować w temperaturze 1000 x g, 4-7 °C przez 1 min.
- Usunąć osocze nasienne lub osocze nasienne za pomocą krioprotektantów z próbki kriokonserwowanej przez pipetowanie w celu odrzucenia wszelkich składników, które mogłyby zakłócać protokół barwienia.
- Zawiesić komórki w 50-100 μl roztworu Ringera o temperaturze 4 °C 200 mOsm/kg.
- Oznaczyć stężenie plemników za pomocą Neubauera lub podobnej komory liczącej pod mikroskopem stereoskopowym.
- Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1-2 x 106 komórek/ml w końcowej objętości 0,5 ml w roztworze Ringera o temperaturze 4 °C.
3. Inkubacja fluorochromu
UWAGA: Z fluorochromami należy obchodzić się w warunkach słabego oświetlenia, zwłaszcza gdy są w roztworze.
- Dodać 3,125 μl roztworu podstawowego DCFH-DA (końcowe stężenie w próbce: 25 μM) do rozcieńczenia próbki roboczej. Inkubować w temperaturze 4-7 °C przez 40 minut w ciemności10.
- Po 30 minutach dodać do próbki 0,5 μl roztworu podstawowego DAPI (stężenie końcowe w próbce: 2 μM) i 0,5 μl roztworu podstawowego barwienia mitochondriów (stężenie końcowe w próbce: 100 nM). Inkubuj oba fluorochromy przez 10 minut w ciemności.
4. Przygotowanie próbki do mikroskopii konfokalnej
- Po czasie inkubacji odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 1000 x g, 4-7 °C przez 1 min.
- Ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie.
- Dodać 10-20 μl roztworu Ringera o stężeniu 200 mOsm/kg.
- Umieścić 5 μl kropli skoncentrowanej zawiesiny komórek na szkiełku.
- Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na preparat i uszczelnij go pastą. Po wyschnięciu pasty preparat jest gotowy do mikroskopii konfokalnej.
5. Konfiguracja konfokalna przed eksperymentem
UWAGA: W zależności od mikroskopu, DCFH-DA może zostać "spalony". Najpierw ustal najlepsze warunki z próbką niewartościową.
- Włącz mikroskop, lasery, kamerę i komputer, na którym działa mikroskop.
- Ustaw lasery wzbudzenia biorąc pod uwagę maksima wzbudzenia i emisji każdego fluorochromu:
- W przypadku DAPI należy przyjąć maksimum wzbudzenia 358 nm i maksimum emisji 465 nm.
- W przypadku barwienia mitochondriów należy zastosować maksimum wzbudzenia 644 nm i maksimum emisji 662 nm.
- W przypadku DCFH-DA należy przyjąć maksimum wzbudzenia 504 nm i maksimum emisji 525 nm.
- Rozpocznij pracę z obiektywem 25X, aby skupić się na plemnikach. Wybierz kanał DAPI, aby ustawić ostrość, ponieważ ten fluorochrom zgłasza najwyższą intensywność. Po zogniskowaniu komórek użyj obiektywu 63X lub 100X w celu dokładnej oceny, ponieważ rozmiar plemników Solea senegalensis wynosi około 2 μm.
- Dla każdego kanału zoptymalizuj otworek, wzmocnienie i napięcie. W ten sam sposób dostosuj przesunięcie cyfrowe, aby zmniejszyć tło. Gdy wszystkie parametry zostaną zoptymalizowane pod kątem użytego fluorochromu, zapisz ustawienia. Do rutynowego eksperymentu na pojedynczym plemniku Solea senegalensis użyliśmy następujących parametrów (parametry te mogą się zmieniać w każdym eksperymencie): otworek 1 i napięcie wzmocnienia 750 V.
6. Akwizycja obrazów
- Wybierz żądane warunki jakości akwizycji obrazu. Zdefiniuj ustawienia akwizycji, takie jak głębia bitowa, format obrazu, grubość jasnego arkusza i wybierz jednostronne oświetlenie. Do rutynowego eksperymentu na pojedynczym plemniku Solea senegalensis użyliśmy następujących parametrów (parametry te mogą ulec zmianie w każdym eksperymencie): rozmiar klatki 1024 px; bitów na piksel 16; szybkość skanowania 2-4).
- Otwórz i wyśrodkuj obszar skanowania, aby rozpocząć i zrobić zdjęcie pola.
- Za pomocą narzędzia do przycinania wybierz obszar zainteresowania i naciśnij na żywo.
- Za pomocą narzędzia wskaźnika zasięgu dostosuj przesunięcie cyfrowe, aby zmniejszyć tło. Zrób to dla każdego kanału i zrób zdjęcie.
- Sprawdź jakość poszczególnych kanałów dla każdego fluorochromu i ich kombinacji.
7. Tworzenie filmu z obrazem 3D
- Ustawienia akwizycji Z-stack.
- Wybierz opcję Z-stack w oprogramowaniu.
- Zaznacz pojedynczą komórkę, grupę komórek lub obszar zainteresowania i ustaw na nim fokus .
- Ogranicz stos Z za pomocą opcji "Pierwszy plasterek" i "Ostatni plasterek" i ustal krok z do interwału 0,2 μm za pomocą precyzyjnego ogniskowania. Wybierz kanał DAPI, aby ustawić ostrość, ponieważ ten fluorochrom może zgłaszać najwyższą intensywność i możesz łatwo wybrać całą głowę plemników. Wybierz optymalne parametry pozyskiwania dla każdego kanału i przeprowadź eksperyment.
- Uruchom eksperyment Z-stack. Podziel kanały i obserwuj lokalizację każdego sygnału w komórkach.
- Proces Z-stack.
- Renderowanie woluminu: Po zakończeniu eksperymentu wybierz opcje oprogramowania do przetwarzania stosu Z i wybierz opcję renderowania woluminu. Wybierz liczbę kroków i stopnie obrotu (360°). Zapisz plik z rozszerzeniem wideo.
- Anaglif stereo: Wybierz anaglif stereo w oknie procesu opcji. To narzędzie pozwala na stworzenie obrazu 3D wideo z podzielonymi kanałami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mikroskopia konfokalna jest idealną metodą oceny wewnątrzkomórkowych ROS w plemnikach ryb kostnoszkieletowych. Połączenie trzech fluorochromów (DAPI, barwnika mitochondriów oraz DCFH-DA) przedstawione w niniejszej pracy (Rysunek 1) dostarcza wielu użytecznych informacji, które mogą zostać wykorzystane w badaniach podstawowych oraz znaleźć zastosowanie w ulepszaniu procedur stosowanych w przemysłowych zakładach akwakultury, takich jak protokoły kriokonserwacji...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Powszechnie wiadomo, że mitochondria są kluczowymi organellami dla ruchliwości i funkcji plemników. Te organelle są jednocześnie bezpośrednio zaangażowane w produkcję ROS. Co ciekawe, kontrolowane poziomy ROS są potrzebne do prawidłowego funkcjonowania plemników1. Wykazano pozytywne związki między płodnością a stresem oksydacyjnym u ssaków11 , ale nadmierne poziomy wpływają na jakość nasienia12. Jednym z kluczowych czynników, który może mieć decydują...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Prace te zostały wsparte finansowo w ramach projektu AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce został sfinansowany przez Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) i Fondo Social Europeo. Autorami są dr Ana Riaza i Stolt Sea Farm S.A., dr Paulino de Paz, dr Ignacio Martínez Montero i José Ramón Guiérrez. Dziękujemy również Pauli Fernández Colado za filmowanie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dioctan 2&,,7&-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4&,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Mikroskopia konfokalna | Zeiss | LSM800 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, klasa analityczna | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Metanol, klasa analityczna | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerGłęboka czerwień | Termo Fisher Scientific | M22426 | |
| Mikrowirówka (z chłodzeniem) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Zjeżdżalnie | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
Bibliografia
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
