Artykuł metodologiczny

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

DOI:

10.3791/55325

⸱

17 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waters Corporation

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza niskopoziomowych (1-100 ppm) zanieczyszczeń białkowych (np. białek komórek gospodarza (HCP)) w bioterapeutykach białkowych jest trudnym testem wymagającym wysokiej czułości i szerokiego zakresu dynamiki. Testy ilościowe białek oparte na spektrometrii mas zazwyczaj obejmują trawienie białek, po którym następuje monitorowanie reakcji selektywnej/monitorowanie wielu reakcji (SRM/MRM) kwantyfikacja peptydów przy użyciu tandemowego kwadrupolowego spektrometru masowego o niskiej rozdzielczości (Rs ~ 1,000). Jednym z ograniczeń tego podejścia jest zjawisko interferencji obserwowane, gdy badany peptyd ma "taką samą" masę prekursora i fragmentu (pod względem wartości m/z) jak inne peptydy koeluujące obecne w próbce (w oknie 1-Da). Aby uniknąć tego zjawiska, proponujemy alternatywne podejście spektrometryczne mas, test MRM o wysokiej selektywności (HS), który łączy separację ruchliwości jonów prekursorów peptydów z wykrywaniem fragmentów peptydów w wysokiej rozdzielczości (Rs ~ 30 000) MS. Zbadaliśmy możliwości tego podejścia w zakresie ilościowego określania standardów peptydów o niskiej liczebności wzbogaconych w trawienie przeciwciał monoklonalnych (mAb) i wykazaliśmy, że ma ono czułość i zakres dynamiki (co najmniej 3 rzędy wielkości) zwykle osiągane w analizie HCP. Wszystkie sześć wzorców peptydowych wykryto w stężeniach tak niskich, jak 0,1 nM (1 femtomol załadowany na kolumnę chromatograficzną o średnicy wewnętrznej 2,1 mm) w obecności tła peptydowego o wysokiej obfitości (2 μg trawienia mAb załadowanego na kolumnie). Biorąc pod uwagę MW fosforylazy królika (97,2 kDa), z której poprowadzono peptydy wzbogacone, LOQ tego testu jest niższy niż 50 ppm. Względne odchylenia standardowe (RSD) powierzchni pików (n = 4 kontrpróby) były mniejsze niż 15% w całym badanym zakresie stężeń (0,1-100 nM lub 1-1000 ppm) w tym badaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja dużych biomolekuł (białek) w warunkach przemysłowych opiera się obecnie na testach immunologicznych (np. ELISA), głównie ze względu na kilka zalet: czułość, wysoką przepustowość, łatwość użycia i niski koszt na próbkę. W przypadku zastosowania do analizy zanieczyszczeń białkowych o niskiej liczebności (1-100 ppm białek komórek gospodarza (HCP)) obecnych w terapiach białkowych, te testy biologiczne zazwyczaj dostarczają całkowitego stężenia HCP (zwykle wyrażonego w ppm lub ng HCP / mg mAb), ale nie mogą zidentyfikować i zmierzyć poszczególnych zanieczyszczeń HCP. Ostatnio opracowano kilka testów opartych na MS w celu uzupełnienia testów ELISA lub dostarczenia informacji, których testy ELISA nie są w stanie zaoferować1,2,3,4,5,6,7,8,9. Ze względu na złożoność próbki i wymóg wykrywania peptydów HCP w szerokim zakresie dynamicznym stężenia (co najmniej 3 rzędy wielkości), wielowymiarowe metody chromatograficzne umożliwiające ekstensywne frakcjonowanie próbek są tradycyjnie stosowane w celu identyfikacji HCP o niskiej liczebności1,2,3,4,5,6,7.

Naturalnym krokiem po identyfikacji i walidacji HCP jest śledzenie (monitorowanie) HCP w wielu partiach biofarmaceutyków. W tej sytuacji zaproponowano jednowymiarowe metody LC/MS w celu poprawy przepustowości próbki8,9. Jednak na dokładność i zakres dynamiczny pomiarów HCP w teście 1D LC/MS może mieć wpływ przytłaczająca obecność peptydów biofarmaceutycznych. W porównaniu z separacją wielowymiarową, potencjał zakłóceń sygnału 19,20,21,22 jest zwiększony w jednowymiarowej separacji chromatograficznej, ponieważ zwiększa się prawdopodobieństwo koelucji większej liczby prekursorów peptydów. Włączenie ortogonalnych środków do rozdzielania prekursorów peptydów bez wydłużania czasu rozdzielania chromatograficznego byłoby wyraźnie korzystne. Ruchliwość jonów fali przemieszczającej się (TWIM)10 ma zdolność rozpoznawania zatłoczonych widm MS w ciągu milisekund. Podczas elucji pojedynczego peptydu można przeprowadzić około 500 separacji ruchliwości, zakładając pełną szerokość piku chromatograficznego wynoszącą 10 s i biorąc pod uwagę, że czas trwania separacji IM w przyrządzie do pomiaru ruchliwości jonów wynosi 20 ms.

Testy spektrometryczne mas do kwantyfikacji białek zostały pomyślnie opracowane w ciągu ostatniej dekady przy użyciu dobrze przyjętego podejścia do monitorowania wybranych (wielokrotnych) reakcji (metoda SRM/MRM) wdrożonego na tandemowych spektrometrach masowych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Jednym z ograniczeń tego testu spektrometrii mas o niskiej rozdzielczości jest zjawisko interferencji19,20,21,22 obserwowane, gdy peptyd będący przedmiotem zainteresowania ma "taką samą" masę prekursora i fragmentu, jak inne peptydy koeluujące obecne w próbce (w oknie 1-Da). Istnieją dwa sposoby poprawy dokładności metod SRM/MRM: jedna opcja obejmuje dodatkowy etap separacji na poziomie prekursora w celu usunięcia zakłócających jonów prekursorowych, podczas gdy druga opcja polega na zwiększeniu rozdzielczości MS wykrywania prekursora/fragmentu, aby uniknąć nakładania się sygnałów MS. Opisany tutaj tryb akwizycji MRM o wysokiej selektywności (HS) wykorzystuje oba te podejścia poprzez sprzężenie separacji ruchliwości jonów prekursorów peptydów z detekcją MS o wysokiej rozdzielczości (Rs ~ 30 000) MS fragmentów peptydów. Opisany tutaj test obejmuje co najmniej trzy rzędy wielkości, co jest zakresem dynamiki zwykle obserwowanym w eksperymentach proteomicznych SRM/MRM17,18,24.

Użyteczność testu HS-MRM do kwantyfikacji HCP została wykazana poprzez monitorowanie liniowości sygnału wytwarzanego przez sześć wzorców peptydów wzbogaconych o różne stężenia (zakres od 0,1 do 100 nM) w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie trawienia infliksymabu (procedura ~24 h)

  1. Przygotować świeże roztwory 50 mM wodorowęglanu amonu, 1% anionowego środka powierzchniowo czynnego w 50 mM NH4HCO3, 500 mM ditiotreitolu (DTT) w 50 mM NH4HCO3 i 500 mM jodoacetamidu (IAM) w 50 mM NH4HCO3.
  2. Do 750 μl 50 mM NH4HCO3 dodać 200 μl mAb infliksymabu (10 mg/ml) i 50 μl 1% anionowego roztworu środka powierzchniowo czynnego i denaturować białko przez 15 minut w temperaturze 60 °C w obecności 0,05% anionowego środka powierzchniowo czynnego.
  3. Dodać 40 μl 500 mM DTT i redukować próbkę przez 60 minut w temperaturze 60 °C w obecności 20 mM DTT.
  4. Dodać 20 μl 500 mM IAM i alkilować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności w obecności ~10 mM IAM.
  5. Dodać zawartość probówki do mikrowirówki do szklanej fiolki zawierającej 20 μg MS Lys C/trypsyna do sekwencjonowania i trawić próbkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Dodać drugą porcję enzymu (20 μg), przenosząc strawioną próbkę do innej szklanej fiolki zawierającej 20 μg Lys C/Trypsyny MS klasy sekwencjonowania i wytrawić próbkę przez noc (12-15 godzin) w temperaturze 37 °C.
  7. Po całonocnej proteolizie dodać 5 μl 100% kwasu mrówkowego (FA) i inkubować trawienie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu rozkładu kwasowego, labilnego, anionowego środka powierzchniowo czynnego.
  8. Wirować trawienie przez 15 minut przy 4 000 x g w wirówce, aby wytrącić nierozpuszczalny składnik anionowego środka powierzchniowo czynnego.
  9. Odzyskać ~1 000 μl roztworu mineralizowanego infliksymabu i umieścić go w fiolce z automatycznym samplerem LC; stężenie w roztworze powinno wynosić ~2 mg/ml. Przechowywać digest w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu, gdy system LC/MS będzie gotowy do analizy.

2. Skok standardów peptydowych (~30 min)

  1. Rozmrozić trawienie infliksymabu, umieszczając zamrożoną próbkę w szklanej fiolce na stole w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 1 ml 0,1% FA w H2O do jednej fiolki do trawienia fosforylazy królika b (PHO), aby przygotować roztwory podstawowe 1 μM dla wszystkich sześciu wzorców peptydów z PHO zawartego w fiolce (fiolka zawiera 1 nmol każdego peptydu).
  3. Przygotować 4 x 1-mililitrowe rozcieńczenia roztworu podstawowego PHO w celu otrzymania roztworów zawierających peptydy 0,1, 1, 10 i 100 nM, używając 0,1% FA jako rozpuszczalnika rozcieńczającego. Przygotować wszystkie rozcieńczenia w szklanych fiolkach (fiolki LC z automatycznym samplerem) i dodać 100 μl roztworu do trawienia infliksymabu jako matrycę tła do wszystkich fiolek. Załadować 2 μg tła trawiącego do kolumny przy każdym wstrzyknięciu 10 μl. Przygotować ślepą próbkę, która zawiera rozcieńczony roztwór infliksymabu (w tym samym rozcieńczeniu 1:10), bez peptydów wzbogaconych.

3. Konfiguracja metody akwizycji danych LC/HDMS E

UWAGA: Przepływ pracy podsumowujący kroki wymagane do skonfigurowania akwizycji HS-MRM jest przedstawiony na rysunku 1 i jest szczegółowo opisany w sekcjach 3-6. Akwizycja niezależnego od danych zbioru danych HDMSE jest wymagana w celu ustalenia czasu retencji każdego monitorowanego peptydu, macierzystego m/z najobficiej występującego jonu peptydowego po jonizacji elektronrozpylacyjnej, oraz odpowiadającego mu CCS (kolizyjnego przekroju czynnego) uzyskanego z separacji ruchliwości jonów. Ponadto niezależny od danych zestaw danych dostarcza informacji dotyczących m/z trzech najliczniejszych jonów fragmentacyjnych dla każdego prekursora peptydu. W drugim etapie przepływu pracy (optymalizacja CE) czułość testu jest zwiększana poprzez dostrojenie energii komórki zderzeniowej w celu uzyskania najwyższej intensywności jonów dla każdego jonu fragmentu. Wreszcie, w ostatnim kroku, wszystkie opisane powyżej parametry są wprowadzane do edytora metody HS-MRM dla każdego monitorowanego peptydu.

  1. Wykonaj eksperymenty LC/MS na kwadrupolowym spektrometrze mas czasu przelotu (QTOF) sprzężonym z ultra-sprawnym systemem chromatografii cieczowej przy użyciu metody akwizycji niezależnej od danych (HDMSE).
    UWAGA: Więcej szczegółów dotyczących konfiguracji przyrządu znajduje się w sekcji Materiał. Ten instrument wykorzystuje urządzenie do przemieszczania jonów na fali biegnącej do separacji prekursorów peptydów10.
  2. Przygotować dwie fazy ruchome zawierające 0,1% FA w wodzie (rozpuszczalnik A) i 0,1% FA w acetonitrylu (rozpuszczalnik B).
    UWAGA: Użyj kolumny C18 z hybrydą o naładowanej powierzchni (CSH) (2,1 x 150 mm, wypełnionej cząstkami 1,7 μm) do oddzielenia wzbogaconych trawień mAb.
  3. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Create/Analysis Method" i wybierz "Generuj metodę akwizycji i przetwarzania". Wpisz nazwę metody, przejdź do folderu (katalogu) metody i kliknij "Dalej".
  4. W polu "Typ analizy" wybierz "Mapa peptydów (IMS)", a następnie w zakładce "System instrumentów" wybierz instrument "Czwartorzędowy menedżer rozpuszczalników". Edytuj ustawienia gradientu, aby uzyskać separację peptydów przy natężeniu przepływu 200 μl/min. Zastosować elucję gradientową od 1 do 40% rozpuszczalnika B w ciągu 30 minut, a następnie 2-minutowe płukanie kolumny i 9-minutową równowagę, z łącznym czasem pracy wynoszącym 50 minut. Wprowadź te parametry eksperymentalne w edytorze metody LC.
  5. W zakładce "Instrument System" wybierz instrument "Sample Manager". Ustawić temperaturę próbki na 10 °C, a temperaturę kolumny na 60 °C.
  6. Spektrometr masowy QTOF pracuje w trybie czułości ESI jonów dodatnich, z typową zdolnością rozdzielczą 30 000 FWHM.
    UWAGA: LC/HDMSE to tryb akwizycji niezależnej od danych (DIA), który działa poprzez szybkie zbieranie skanów o zmiennych energiach zderzeń (w komórce zderzeniowej) między niską energią (6 V dla skanów MS kanał 1) a podwyższoną energią (rampa od 15 do 40 V w celu wytworzenia widm fragmentacji bez wyboru prekursora w kanale MS 2).
    1. Wprowadź domyślne parametry MS związane ze źródłem w oprogramowaniu do akwizycji danych: z "Moja praca/System instrumentów" wybierz zakładkę "Vion IMS Qtof", a w menu "Narzędzia" wprowadź następujące parametry: napięcie kapilarne 3,0 kV, temperatura źródła 100 °C, przesunięcie źródła 100 V, przepływ gazu w stożku 50 l/h oraz napięcie stożka 40 V. Ustawić temperaturę desolwatacji na 250 °C, natężenie przepływu gazu do desolwatacji na 500 l/h, a napięcie odniesienia kapilary na 3,0 kV.
    2. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Create/Analysis Method" i wybierz "Generate an acquisition and processing method". Wpisz nazwę metody i przejdź do folderu (katalogu) metody, a następnie kliknij "Next".
    3. W polu "Typ analizy" wybierz "Mapa peptydów (IMS)", a w zakładce "System instrumentów" wybierz instrument "Vion IMS QTof". Kliknij "Zakończ"."
      UWAGA: Nowo utworzona metoda LC/HDMSE otwiera się automatycznie na ekranie "Konfiguracja metody instrumentu".
    4. W zakładce "Ustawienia" wprowadź następujące parametry: napięcie kapilarne 3,0 kV, temperatura źródła 100 °C, temperatura desolwatacji 250 °C, przepływ gazu stożkowego 50 l/h oraz przepływ gazu do desolwatacji 500 l/h.
    5. W ustawieniach zakładki "Eksperyment" wybierz "High Definition MSE" i wybierz "Czas wykonywania metody analizy". W zakładce "Ustawienia skanowania" wprowadź następujące parametry: niska masa – 100; wysoka masa – 2 000 oraz czas skanowania – 400 ms. W zakładce "CE" wpisz "6 V" dla ustawienia niskiego zużycia energii i wybierz rampę wysokoenergetyczną od 15 do 40 V. Upewnij się, że zaznaczona jest opcja "Wyłącz redukcję danych".
    6. Podać roztwór 50 ng/ml enkefaliny leucyny (LE) przygotowany w 50% acetonitrylu z 0,1% FA przy natężeniu przepływu 10 μl/min w celu kalibracji masy zamkniętej podczas pozyskiwania danych.
      UWAGA: Dane dotyczące masy blokady są pozyskiwane co 5 minut przy użyciu tej samej szybkości akwizycji w tym samym zakresie masy.
  7. Przeanalizować próbkę 10 nM z dodatkiem fosforanu za pomocą opisanego powyżej testu LC/HDMSE, wstrzykując 10 μl próbki (ilość załadowana na kolumnie wynosi 100 fmol dla każdego wzorca peptydu).

4. Ustawienie metody Tof-MRM do optymalizacji energii zderzeń (CE)

  1. Ze zbioru danych LC/HDMSE uzyskaj czas retencji, prekursor i jon fragmentacyjny m/z dla każdego peptydu PHO. Zachowaj m/z i stan naładowania dla najliczniejszego jonu prekursorowego i odpowiadających mu trzech najobficiej występujących jonów fragmentacyjnych.
    UWAGA: Przykład widm niskoenergetycznych i wysokoenergetycznych zwykle rejestrowanych przez test LC/HDMSE przedstawiono na rysunku 2.
  2. Użyj optymalizacji energii zderzenia (CE) w eksperymencie SRM/MRM, aby uzyskać najlepszy sygnał dla każdego peptydu23.
    1. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Create/Analysis Method" i wybierz "Generuj metodę akwizycji i przetwarzania". Wpisz nazwę metody, przejdź do folderu (katalogu) metody i kliknij "Dalej".
    2. W polu "Typ analizy" wybierz "Kwantyfikuj". Wybierz "Ilościowo oznacz test chromatograficzny 2D" i kliknij "Dalej". W zakładce "System instrumentów" wybierz "Vion IMS QTof" i kliknij "Zakończ".
      UWAGA: Nowo utworzona metoda Tof-MRM otwiera się automatycznie na ekranie "Konfiguracja metody instrumentu".
    3. W zakładce "Ustawienia" wprowadź następujące parametry: napięcie kapilarne 3,0 kV, temperatura źródła 100 °C, temperatura desolwatacji 250 °C, przepływ gazu stożkowego 50 l/h oraz przepływ gazu do desolwatacji 500 l/h.
    4. W ustawieniach zakładki "Eksperyment" wybierz "Tabela funkcji" i wybierz "Jedna lub więcej funkcji MS, MSMS lub MRM". Za pomocą strzałek w dół ustaw funkcję "Tof-MRM" dla każdego peptydu, wprowadzając trzy "przejścia" (kombinacje najliczniejszego prekursora i trzech jego najliczniejszych jonów fragmentacyjnych).
      UWAGA: W trybie Tof-MRM najwyższą czułość uzyskuje się przy użyciu zaplanowanego podejścia MRM.
    5. W edytorze funkcji "Tof-MRM" wybierz jedno okno czasu retencji dla każdego peptydu (o długości co najmniej 1 minuty), ułożone zgodnie z kolejnością elucji peptydów. W edytorze funkcji "Tof-MRM" wstawić prekursor peptydu m/z i produkt m/z; wybrać okno izolacji poczwórnej jako »Niskie« (okno 4-Da) dla prekursora peptydów; wybierz stały czas skanowania 100 ms; i wybrać dwanaście różnych wartości energii zderzenia w zakresie 14-36 V, w następujący sposób: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 i 36, jak pokazano na przykładzie z rysunku 3.
      UWAGA: W przypadku metody Tof-MRM opisanej powyżej, dla każdego piku chromatograficznego zbiera się co najmniej 10 punktów danych dla każdego przejścia przy każdym określonym CE. Aby zmniejszyć rozmiar pliku danych, wybierz opcję "Szeroki" (okno 6-Da) dla sygnału jonu fragmentu. Przykłady wartości zoptymalizowanych pod kątem CE przedstawiono w tabeli 2.
    6. Przeanalizować próbkę o długości 10 nM z dodatkiem PHO za pomocą opisanego powyżej testu Tof-MRM, wstrzykując 10 μl próbki (ilość załadowana na kolumnie wynosi 100 fmol dla każdego wzorca peptydu).

5. Ustawienie końcowej metody akwizycji HS-MRM do kwantyfikacji peptydów za pomocą separacji ruchliwości jonów prekursorów peptydów

  1. W menu "Zbadaj" oprogramowania do akwizycji danych wyświetl wszystkie 11 śladów chromatograficznych wygenerowanych dla każdego CE dla każdego peptydu i zintegruj piki za pomocą przycisku "Integruj" z paska narzędzi "Opcje przetwarzania/Operacje"; najwyższy obszar piku wskaże najlepszą CE dla każdego przejścia.
  2. Porównaj wizualnie najlepsze obszary pików dla 3 fragmentów każdego peptydu i zachowaj tylko najlepsze "przejście" (jon fragmentu, który wytwarza najbardziej intensywny sygnał); Tabela 2 przedstawia najlepsze "przejścia" uzyskane z czterech peptydów PHO.
  3. Ustaw metodę HS-MRM zawierającą tylko jeden jon fragmentacyjny na peptyd. Należy użyć wartości CCS każdego prekursora peptydu ze zbioru danych LC/HDMSE.
    1. Zmodyfikuj metodę Tof-MRM utworzoną w poprzedniej sekcji (sekcja 4), wybierając funkcję "HS-MRM" zamiast funkcji "Tof-MRM".
    2. W edytorze funkcji "HS-MRM" wprowadź następujące parametry związane z prekursorem: m/z, rozdzielczość kwadrupolowa: niska (4 Da), stan naładowania, wartość prekursora CCS i rozdzielczość prekursora CCS: niska. Dla jonu produktu wprowadź jego m/z, optymalną energię zderzenia, wybierz czas skanowania 0,4 s i wybierz ustawienie widma "Szerokie" (6 Da), aby uwzględnić wszystkie jego izotopy. Przykład końcowej metody akwizycji HS-MRM dla wszystkich czterech peptydów przedstawiono na rysunku 4.
  4. Przeanalizować wszystkie próbki metodą HS-MRM, zaczynając od ślepej próby trawienia mAb (próbka bez wzbogaceń), a następnie 4 powtórzone wstrzyknięcia (po 10 μl każde) o następujących stężeniach: peptydy PHO 0,1, 1, 10 i 100 nM.

6. Tworzenie metody przetwarzania do analizy zbioru danych HS-MRM

  1. Utwórz metodę przetwarzania na potrzeby analizy zestawu danych HS-MRM.
    1. W metodzie analizy utworzonej dla metody akwizycji danych "HS-MRM" należy kliknąć na zakładkę "Przeznaczenie" i wybrać "Zarządzaj komponentami".
    2. Z menu rozwijanego w sekcji "Typ eksperymentu" wybierz opcję "HS MS/MS / HS-MRM".
    3. Kliknij "Utwórz/Nowy wpis" i wprowadź następujące parametry w edytorze metod przetwarzania: czas retencji peptydu (RT), stan ładunku prekursora, prekursor m/z i czas dryfu prekursora (DT). Dla jonu fragmentacyjnego wprowadź jego stan m/z i naładowania, a następnie określ ślad "XIC" jako tryb ekstrakcji.
    4. W zakładce "Przeznaczenie" tej samej metody pozyskiwania "HS-MRM" kliknij na "Kwoty domyślne" i wprowadź następujące stężenia: peptydy PHO 0,1, 1, 10 i 100 nM.
    5. W polu "Ustawienia przetwarzania/ekstrakcji" należy wprowadzić następujące parametry: domyślna tolerancja masy, 10 ppm (dla m/z wszystkich jonów fragmentacyjnych) i domyślny czas dryftu, 5%; przykład metody przetwarzania peptydów PHO pokazano na rysunku 5.
    6. Jako typ kalibracji wybierz łącznik krzywej liniowej z ważeniem 1/X2.
  2. Przetwarzać dane HS-MRM w celu zintegrowania wszystkich chromatogramów i skonstruowania krzywych kalibracyjnych każdego peptydu PHO.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poszczególne sekwencje sześciu wzorców peptydu fosforylazy b zawartych w mieszaninie peptydów PHO są pokazane w Tabeli 1, wraz z ich czasami retencji i najliczniejszymi prekursorami zaobserwowanymi w eksperymencie HDMSE. Pierwszym krokiem w rozwoju testu MRM o wysokiej selektywności (HS) jest pozyskanie zestawu danych HDMSE w celu ustalenia czasów elucji każdego peptydu PHO wraz z odpowiadającym mu najliczniejszym prekursorem i trzema najliczniejszymi fragmentami. Rycina 2 przedstawia widmaHDMS E uzyskane dla jednego z peptydów PHO (Pep 6) wzbogaconych w trawieniu infliksymabu. Po ustaleniu 3 najlepszych "przejść" (kombinacji mas prekursorów i fragmentów) dla każdego peptydu, przeprowadza się eksperyment Tof-MRM w celu znalezienia optymalnej energii zderzenia, aby zmaksymalizować sygnały generowane dla każdego peptydu. Wyniki eksperymentu z optymalizacją CE podsumowano w tabeli 2. Ostateczny test HS-MRM (patrz rysunek 4) zachowuje tylko najlepsze "przejście" dla każdego peptydu i jest używany do analizy wszystkich próbek wzbogaconych. Przykłady chromatogramów HS-MRM wygenerowanych dla 4 peptydów PHO we wszystkich badanych stężeniach przedstawiono na rysunku 7. Na rysunku 8 przedstawiono cztery krzywe kalibracyjne uzyskane dla każdego peptydu po całkowaniu pików HS-MRM wyróżnionych na rysunku 7. Ponadto względne odchylenie standardowe powierzchni piku, obliczone na podstawie 4 powtórzonych wstrzyknięć, podsumowano w 4 tabelach przedstawionych w tabeli 3.

TGL TGL
peptydpeptydPrzechowywaniaStany naładowania
idSekwencjaczas (min)+ 1+ 2+ 3+ 4
Pep 1VLYPNDNFFEGKRozdział 19,4Numer katalogowy: 1442.6951Numer katalogowy: 721.8512Numer katalogowy: 481.5699Numer katalogowy: 361.4292
Pep 2TCAYTNHTVLPEALER16,0Numer katalogowy: 1874.9065Numer katalogowy: 937.9569Numer katalogowy 625.6404Numer katalogowy: 469.4821
Pep 3IGEEYISDLDQLRKNorma 18,9Numer katalogowy: 1678.8646Numer katalogowy: 839.9360Numer katalogowy: 560.2931Numer telefonu 420.4716
Pep 4LLSYVDDEAFIRDnia 21,1Numer katalogowy: 1440.7369Numer katalogowy: 720.8721Numer katalogowy: 480.9172Numer katalogowy: 360.9397
Pep 5LITAIGDVVNHDPVVGDRPytanie 19,7Numer katalogowy 1890.0080Numer katalogowy: 945.5076Numer katalogowy: 630.6742Numer katalogowy: 473.2574
Pep 6VFADYEEYVKRozdział 17,7Numer katalogowy: 1262.5939Numer katalogowy: 631.8006Numer telefonu 421.5362Numer katalogowy: 316.4039

Tabela 1. Wzorce peptydu PHO zawarte w mieszance Mass PREP wzbogacone w trawienie infliksymabu. Czasy retencji peptydów i ich najliczniejsze prekursory (wyróżnione pogrubioną czcionką) są wyświetlane w formacie tabelarycznym.

peptydpeptydPrzechowywaniaPrekursor peptydówNajliczniejsze jony fragmentacyjne/ładunekoptymalny
idSekwencjaczas (min)m/z i opłataCzas dryftu (ms)jaIiIiiCE (V)
Pep 2TCAYTNHTVLPEALER16,0625.6404 (+3)6.2714.3781 (+1)807.4177 (+2)827.4621 (+1)24
Pep 4LLSYVDDEAFIRDnia 21,1720.8721 (+2)7,5865.4050 (+1)964.4734 (+1)1214.5688 (+1)22 Rozdział 22
Pep 5LITAIGDVVNHDPVVGDRPytanie 19,7630.6742 (+3)6,3642.3570 (+1)689.8391 (+2)832.4236 (+2)20
Pep 6VFADYEEYVKRozdział 17,7631.8006 (+2)7,0830.3931 (+1)945.4200 (+2)1016.4571 (+1)24

Tabela 2. Wyniki eksperymentu optymalizacyjnego Tof-MRM: wskazano trzy najliczniejsze fragmenty każdego peptydu PHO oznaczonego ilościowo w tym badaniu, wraz z odpowiadającą im zoptymalizowaną energią zderzenia.

: powiedział: powiedział: powiedział: szt. szt. TGL TGL TGL szt. szt. szt. : powiedział: powiedział: powiedział: LAT TGL SZT. TGL TGL szt. szt. szt. : powiedział: powiedział: powiedział: SZT. TGL TGL TGL szt. szt. szt. : powiedział: powiedział: powiedział: szt. TGL szt. szt. szt. szt. szt. TGL TGL
ConckwotaPep 2 Obszary Pików (Tabela 3A)
(nM)na kolumnie (fmole)Rep01 powiedziałRep02Rep03Rep04znaczyćRSD (%)
0,11490439Rozdział 462Z numerem 431Okręg wyborczy 4565,8
110Numer katalogowy: 51214842Numer katalogowy: 51984842Numer katalogowy 50013.7
10100Numer katalogowy: 63853Numer katalogowy: 64279Numer katalogowy: 66111Numer katalogowy: 62509Numer katalogowy: 641882.3
10010006123926055536132296110046105450,6
ConckwotaPep 4 Obszary Pików (Tabela 3B)
(nM)na kolumnie (fmole)Rep01 powiedziałRep02Rep03Rep04znaczyćRSD (%)
0,11Z dnia 275Okręg wyborczy 359Rozdział 325Rozdział 288Rozdział 312Rozdział 12.2
110Numer katalogowy: 3559Numer katalogowy: 36943287375435745,8
10100Numer katalogowy: 45259Numer katalogowy: 45775Numer katalogowy: 42976Numer katalogowy: 45548Numer katalogowy: 448902.9
1001000459374467927436272458994455642Wersja 3.0
ConckwotaPep 5 Obszary Pików (Tabela 3C)
(nM)na kolumnie (fmole)Rep01 powiedziałRep02Rep03Rep04znaczyćRSD (%)
0,11319432433202Numer katalogowy: 325732241,0
110Numer katalogowy: 31464Numer katalogowy: 31150Numer katalogowy: 31464Numer katalogowy: 31433Numer katalogowy: 313780,5
101003136383207123119433119433145591.3
1001000284573628400312882006286405228579560,7
ConckwotaPep 6 Obszarów Pików (Tabela 3D)
(nM)na kolumnie (fmole)Rep01 powiedziałRep02Rep03Rep04znaczyćRSD (%)
0,11490Okręg wyborczy 583440440Z numerem 488Rozdział 13,8
110Numer katalogowy: 6429Numer katalogowy: 6429Numer katalogowy: 6848Numer katalogowy: 6623Numer katalogowy: 6582Wersja 3.0
10100Numer telefonu 71295Numer katalogowy: 7040071563Numer katalogowy: 70400Numer telefonu 709150,9
1001000Numer telefonu 707640Numer telefonu 707640694461Numer katalogowy: 7294907098082.0

Tabela 3. Tabela zawierająca powierzchnie pików chromatogramów HS-MRM zarejestrowanych dla 4 peptydów PHO (Pep 2, 4, 5 i 6) dla każdego wstrzyknięcia LC/MS (16 serii LC/MS i 4 badane stężenia).
Względne odchylenie standardowe było lepsze niż 15% dla wszystkich peptydów w całym badanym zakresie stężeń.

figure-results-1
Rysunek 1. Diagram przepływu pracy podsumowujący trzy kroki wymagane do skonfigurowania metody akwizycji HS-MRM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Przykład danych HDMSE:
(A) Widmo niskoenergetyczne przedstawiające jon prekursorowy Pep 6. (B) Wysokoenergetyczne widmo fragmentacji tego samego peptydu, przedstawiające 3 najliczniejsze jony fragmentacyjne (zakreślone) wybrane do optymalizacji energii zderzeń Tof-MRM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Parametry używane do konfigurowania eksperymentu optymalizacyjnego Tof-MRM.
Dla każdego przejścia testowano jedenaście energii zderzeń (w zakresie od 16 do 36 V). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Przykład końcowej metody HS-MRM.
Dla każdego "przejścia" wymaganych jest kilka parametrów, w tym prekursor peptydu m/z, jego stan naładowania i czas dryfu ruchliwości jonów, m/z najliczniejszego jonu fragmentacyjnego, optymalna energia zderzenia i czas akwizycji MS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Ustawienia używane przez metodę przetwarzania do analizowania zestawu danych HS-MRM.
Każdy peptyd jest monitorowany przez pojedyncze "przejście" opisane przez prekursor peptydu m/z, stan naładowania i oczekiwany czas retencji, wraz z m/z najliczniejszego fragmentu i jego stanem naładowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Schemat spektrometru masowego ruchliwości jonów.
W trybie akwizycji HS-MRM prekursory peptydu, który jest oznaczany ilościowo, są oddzielane od innych prekursorów peptydów koeluujących (interferujących) w komórce ruchliwości jonów, izolowane przez kwadrupol i fragmentowane ze stałą energią zderzenia w komórce zderzeniowej. Sygnał wytwarzany przez jony fragmentów peptydów jest wzmacniany przez regulację częstotliwości popychacza, a kwantyfikacja peptydów odbywa się przy użyciu sygnałów o wysokiej rozdzielczości MS (>30 000) wytwarzanych przez najbardziej intensywny jon fragmentacyjny każdego peptydu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Chromatogramy HS-MRM zarejestrowane dla 4 peptydów PHO w 4 różnych stężeniach obejmujących 3 rzędy wielkości (0,1, 1, 10 i 100 nM).
(A) chromatogramy Pep 2, (B) chromatogramy Pep 4, (C) chromatogramy Pep 5 i (D) chromatogramy Pep 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8. Krzywe kalibracyjne dla 4 peptydów PHO w 4 różnych stężeniach (0,1, 1, 10 i 100 nM).
Tabele pod każdą krzywą wyświetlają poszczególne obszary pików (wartości Y) zarejestrowane dla każdego wstrzyknięcia, podczas gdy druga kolumna z każdej tabeli pokazuje procentowe odchylenie od oczekiwanej odpowiedzi liniowej. (A) kalibracja Pep 2, (B) kalibracja Pep 4, (C) kalibracja Pep 5 i (D) kalibracja Pep 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (20 000 Rs) jest rutynowo stosowana do strukturalnej charakterystyki białek terapeutycznych na różnych platformach instrumentów. W przeciwieństwie do tego, kwantyfikacja białek na podstawie MS jest zwykle przeprowadzana przez SRM / MRM na tandemowych kwadrupolowych spektrometrach masowych o niskiej rozdzielczości (Rs ~ 1,000) przy użyciu peptydów sygnaturowych generowanych przez enzymatyczne rozszczepienie białek 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,Rozdział 22,23. Ponieważ jednowymiarowe rozdzielania chromatograficzne nie mogą w pełni rozpuścić złożonych mieszanin peptydów wytwarzanych w procesie trawienia enzymatycznego, koelucja peptydów jest częstym zjawiskiem, nawet w przypadku trawienia pojedynczych białek. W przypadku bardzo złożonych procesów trawienia białek (np. w celu ilościowego oznaczania 1-100 ppm HCP w obecności bogatego w peptydy tła wytwarzanego przez białko terapeutyczne) zakłócenia mogą mieć wpływ na czułość, dokładność lub liniowość testu SRM/MRM.

Testy SRM/MRM mają jednowymiarową selektywność, opierając się wyłącznie na "unikalnej" kombinacji mas prekursora/fragmentu. Z tego powodu testy te zawodzą w sytuacjach, gdy tło peptydów zmienia się nieoczekiwanie (np . w przypadku próbek biofarmaceutycznych uzyskanych z różnych procedur oczyszczania). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, proponujemy tutaj test MRM o wysokiej selektywności (HS) zaimplementowany na hybrydowym spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości z kwadrupolem czasu przelotu (QTOF) z obsługą ruchliwości jonów (schemat instrumentu, patrz rysunek 6).

Przyrząd oddziela prekursory peptydu będącego przedmiotem zainteresowania od innych prekursorów peptydów spruwających (interferujących) w komórce ruchliwości jonów, izoluje pełną otoczkę izotopową prekursora w kwadrupolu i fragmentuje ją z ustalonym CE w komórce zderzeniowej. Sygnał wytwarzany przez najliczniejszy fragment peptydu jest dodatkowo wzmacniany przez regulację częstotliwości popychacza (Target Enhancement), która selektywnie wpycha do rurki przelotowej obszary masy będące przedmiotem zainteresowania, a nie wszystkie jony, jak w przypadku pełnego skanowania. Kwantyfikacja peptydów odbywa się przy użyciu sygnałów o wysokiej rozdzielczości MS (Rs ~ 30 000) wytwarzanych przez ten jon fragmentacyjny. W porównaniu z testami SRM/MRM, test HS-MRM oferuje dwa dodatkowe poziomy selektywności: jeden jest zapewniony przez separację ruchliwości jonów na poziomie prekursora, podczas gdy drugi jest oferowany przez zwiększoną rozdzielczość masową analizatora DOF. Wyniki uzyskane dzięki poprawie selektywności są widoczne na chromatogramach HS-MRM przedstawionych na rysunku 7, które są wolne od zakłóceń w trzech rzędach wielkości.

W przeciwieństwie do testów SRM/MRM, istnieje kilka parametrów, które można dostosować w celu optymalizacji testów HS-MRM: okno RT wokół prekursora peptydu (zwykle ustawiane na 0,2 min), okno izolacji kwadrupolowej (4 Da), okno czasu dryfu otaczające prekursor (± FWHM piku prekursora z odpowiedniego mobilogramu jonowego) oraz rozdzielczość MS jonu fragmentacyjnego (20 000-40 000). Testy HS-MRM są bardzo czułe: najniższa wykryta ilość dla każdego peptydu PHO to 1 femtomol na kolumnie (lub 0,1 nM pod względem stężenia peptydu). Biorąc pod uwagę peptyd MW (patrz Tabela 1 dla dokładnych MW), ilość wykryta na kolumnie jest rzędu 1-2 pg, podczas gdy kolumna jest obciążona znacznie większą ilością (2 μg) peptydów tła z trawienia mAb.

Biorąc pod uwagę masę cząsteczkową pełnowymiarowego białka PHO (97,2 kDa), z którego uzyskano peptydy wzbogacone, test jest w stanie wykryć 50 ppm zanieczyszczenia białkowego w obecności jonów tła o wysokiej obfitości. Dolne granice wykrywalności (5-10 ppm) są osiągalne dla HCP o niższej masie cząsteczkowej (10-20 kDa). Test obejmuje trzy rzędy wielkości (jak pokazano na krzywych kalibracyjnych z rysunku 8), co oznacza, że może mierzyć HCP w zakresie 1-1,000 ppm. Również odtwarzalność testów HS-MRM, zilustrowana w tabeli 3, bardzo dobrze pasuje do odtwarzalności małocząsteczkowych testów SRM/MRM, w których RSD o powierzchni pików są lepsze niż 15%.

Zbadaliśmy możliwości nowego testu do ilościowego oznaczania wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych (mAb) i wykazaliśmy jego czułość i użyteczność w celu pokrycia szerokiego zakresu dynamiki (co najmniej trzy rzędy wielkości) zwykle spotykanego w analizie HCP. Wszystkie sześć wzorców peptydowych wykryto w stężeniach tak niskich, jak 0,1 nM (1 femtomol załadowany na kolumnę chromatograficzną o średnicy wewnętrznej 2,1 mm) w obecności tła peptydowego o wysokiej obfitości (2 μg trawienia mAb załadowanego na kolumnie). Dzięki zastosowaniu zarówno ukierunkowanego HRMS, jak i separacji prekursorów ruchliwości jonów, test HS-MRM ma ogromny potencjał, aby stać się szybkim, wysokowydajnym testem monitorowania wielu HCP w wielu partiach biofarmaceutyków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Waters Corporation, która jest producentem kilku odczynników i przyrządów wykorzystanych w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Lesley Malouin i Tony'emu Catlinowi z Waters Corporation za przygotowanie rysunku 6 manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektrometr masowy Vion IMS QtofWody186009214
Acquity Klasa H Menedżer rozpuszczalników czwartorzędowych (QSM)Wody186015041
Acquity Menedżer próbek FTN klasy H (SM)Wody186015040
Acquity Menedżer kolumn klasy H (CM)Wody186015043
Acetonitryl (ACN)Fisher ChemicalA996-4
Wodorowęglan amonuSigma Aldrich40867-50G-F
2,1 x 150 mm CSH C18 Kolumna UPLC, 1,8 i mikro; m cząstkiWody186005298
Ditiotreitol (DTT)Sigma AldrichD5545-5G
Kwas mrówkowy, dodatek eluentowy do LC/MSSigma Aldrich56302-10X1ML-F
Hi3 fosforylaza królicza (PHO) MassPREP standardWody186006011
Jodoacetamid (IAM)Sigma AldrichI-1149-5G
Fiolki LC (fiolki szklane 12x32 mm, zakręcana szyjka)Wody186000327c
Hydrat soli octanu enkefaliny LeucynaProbówka Sigma AldrichL9133-10MG
Białko LoBind 2,0 ml (2x50)Eppendorf22431102
RapiGest SFWaters186001861
Mieszanka enzymów trypsyny/Lys-C, klasa masowa (5 x 20 i mikro; g)PromegaV5073
Woda, klasa LC / MSSigma Aldrich39253-1L-R

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doneanu, C. E., et al. Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry. MAbs. 4, 24-44 (2012).
  2. Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).
  3. Zhang, Q., et al. Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6, 659-670 (2014).
  4. Farrell, A., et al. Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E). Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).
  5. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).
  6. Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).
  7. Zhang, Q., et al. Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification. Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).
  8. Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise. Anal Biochem. , 1-6 (2014).
  9. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis. MAbs. 7, 1128-1137 (2015).
  10. Giles, K., et al. Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).
  11. Anderson, V., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).
  12. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).
  13. Picotti, P., et al. High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods. 7, 43-46 (2010).
  14. Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry. Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).
  16. Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification. J Vis Exp. (102), (2015).
  17. Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate. Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).
  18. Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics. Cell. 138, 795-806 (2009).
  19. Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy. Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).
  20. Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
  21. Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring. Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).
  22. Bao, Y., et al. Detection and correction of interference in SRM analysis. Methods. 61, 299-303 (2013).
  23. Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
  24. Mbasu, R. J., et al. Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis. Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczanie ilo ci peptyd wanaliza biofarmaceutycznaVion IMS QTofinterferencje MRMwzorce peptydowekrzywa kalibracyjna

Powiązane artykuły