Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

DOI:

10.3791/55334

⸱

8 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 2Division of Experimental Radiology, Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 3NeuroImaging Centre Research, Department of Neuroscience, Ruhr-University Bochum, 4Centre for Infectious Diseases, Parasitology Unit, Heidelberg University Hospital, 5German Centre for Infection Research (DZIF), 6Department of Neuroradiology, University of Würzburg, 7Center for Childhood and Adolescent Medicine, General Pediatrics, Heidelberg University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria mózgowa jest oznaką ciężkiej choroby malarycznej i często jest zwiastunem śmierci. Podczas gdy agresywne leczenie może uratować życie, wykrycie malarii mózgowej może być trudne. Przedstawiamy eksperymentalny mysi model malarii mózgowej, który ma wiele cech charakterystycznych dla choroby ludzkiej, w tym obrzęk i patologię mikrokrążenia. Za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) możemy wykryć i śledzić przerwanie bariery krew-mózg, rozwój obrzęku, a następnie obrzęk mózgu. Opisujemy wiele technik MRI, które mogą uwidocznić te istotne zmiany patologiczne. W ten sposób pokazujemy, że rezonans magnetyczny stanowi cenne narzędzie do wizualizacji i śledzenia zmian patologicznych, takich jak obrzęk, obrzęk mózgu i patologia mikrokrążenia, in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria jest poważnym globalnym problemem zdrowotnym. 1 Ciężka malaria charakteryzuje się częściowo zajęciem mózgu i często jest złym czynnikiem prognostycznym. Zajęcie mózgu jest powszechne u dzieci poniżej piątego roku życia na obszarach o wysokiej transmisji malarii i stanowi główną przyczynę zgonów związanych z malarią w tej grupie wiekowej. 1 Podczas gdy agresywne leczenie może uratować życie, wykrycie malarii mózgowej, zwłaszcza we wczesnych stadiach, może być trudne. Procesy patologiczne związane z malarią mózgową obejmują zaburzenia mikrokrążenia i obrzęk mózgu, co może prowadzić do poważnego obrzęku mózgu. W tym artykule przedstawiamy protokół obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), który umożliwia obrazowanie in vivo całego mózgu eksperymentalnej malarii mózgowej (ECM). Metody obrazowania całego mózgu o wysokiej rozdzielczości są szeroko stosowane w tej chorobie, mimo że niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób ECM inicjuje się w ośrodkowym układzie nerwowym lub jakie konkretne mechanizmy prowadzą do choroby. In vivo (in vivo) Rezonans magnetyczny, obejmujący cały mózg, stanowi ważne narzędzie badawcze pozwalające lepiej zrozumieć patologię ECM. Rezonans magnetyczny jest w stanie ocenić globalny obrzęk mózgu mózgu, który niedawno został uznany za ważny czynnik prognostyczny zgonu nie tylko w ECM, ale także w ludzkiej malarii mózgowej. 2,3 Ciężki obrzęk mózgu występuje w przypadku śmiertelnej choroby i stanowi jedną z kilku patologicznych cech między modelami ECM a chorobą człowieka, chorobą, która charakteryzuje się zarówno zmianami zapalnymi, jak i mikronaczyniowymi. 4

ECM może być wywołany u myszy CBA lub C57BL poprzez zakażenie śmiertelnym Plasmodium berghei ANKA.5 Początek ECM zwykle występuje między 6 a 10 dniem po infekcji i powoduje napady, ataksję, niewydolność oddechową i śpiączkę, które prowadzą do szybkiej śmierci. 4 Skala Szybkiej Mysiej Śpiączki i Zachowania (RMCBS) jest pomocna do oceny objawów klinicznych ECM. Składa się z 10 parametrów, z których każdy jest oceniany w skali od 0 do 2, z maksymalną możliwą oceną 20. 6 Ostatnio wykazaliśmy dobrą zgodność między nasileniem wyników RMCBS u myszy ECM a zmianami patologicznymi wykazanymi przez MRI. 7 W tym protokole opisujemy indukcję ECM u myszy oraz rezonans magnetyczny in vivo myszy z ECM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi kategorii B Federacji Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA) oraz standardowymi wytycznymi Towarzystwa Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (GV-SOLAS) i zostały zatwierdzone przez lokalne władze niemieckie w Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe, Niemcy). Należy pamiętać, że poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 dotyczy pracy komarów i sporozoitów Plasmodium berghei ANKA.

1. Infekcja

  1. Zainfekuj komary Anopheles stephensi Plasmodium berghei ANKA, karmiąc je przez 15 minut myszą gametocytemiczną. Utrzymuj zakażone komary w temperaturze 80% wilgotności i 21 °C.
  2. Zbierz samice komarów z klatki od 17 do 22 dni po posiłku z krwi. Umieść je na lodzie, aby je znieczulić.
  3. Za pomocą kleszczy umieść trzy do czterech komarów na szklanym szkiełku pokrytym kroplą zimnego podłoża RPMI. Umieść szkiełko pod mikroskopem.
  4. Za pomocą kleszczy ostrożnie rozciągnij komara między głową a ciałem. Odizolować gruczoł ślinowy za pomocą strzykawki i igły. Powtórz tę procedurę z pozostałymi komarami.
  5. Pobrać gruczoły ślinowe ze szkiełka podstawowego, zasysając je szklaną pipetą, a następnie umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: W zależności od wskaźników infekcji, zwykle można uzyskać od 8 000 do 15 000 zakaźnych sporozoitów na gruczoł ślinowy.
  6. Przez około 3 minuty rozbij izolowane gruczoły ślinowe w probówce wirówkowej małym, plastikowym patyczkiem, aby wyizolować sporozoity z tkanki gruczołu ślinowego.
  7. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 1 000 x g i w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia sporozoitów z pozostałej tkanki.
  8. Odpipetować supernatant, który zawiera sporozoity (SPZ), do nowej probówki wirówkowej i odliczyć oczyszczone sporozoity w hemocytometrze Neubauera.
  9. Dostosuj stężenie oczyszczonych sporozoitów do 10 000/ml, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami.
  10. Wstrzyknij łącznie 1,000 sporozoitów (0,1 ml) do żył ogonowych wsobnych myszy C57BL/6, aby zainicjować infekcję. Aby ułatwić wstrzykiwanie, umieść myszy C57BL/6 w ograniczniku i umieść ogony w ciepłej (około 37 °C) wodzie, aby pomóc w wizualizacji żył ogonowych;
    UWAGA: Samo wstrzyknięcie jest krótkim zabiegiem, który można wykonać w ciągu kilku sekund.
  11. Raz dziennie sprawdzaj parazytemię w fazie krwi w rozmazach krwi od 3 dnia po zakażeniu SPZ.
    UWAGA: Monitorowanie parazytemii zostało wcześniej zwizualizowane w artykule JoVE autorstwa Muellera i wsp.8
  12. Oceniaj myszy raz dziennie za pomocą skali szybkiej mysiej śpiączki i zachowania (RMCBS), zaczynając od 5 dnia po wstrzyknięciu sporozoitu.
    UWAGA: Szczegółowy opis tej procedury, w tym demonstracja wideo, został opublikowany przez Caroll i wsp.6
  13. Oceń myszy za pomocą obrazowania MRI zgodnie z wynikiem RMCBS i pytaniem badawczym, na które należy odpowiedzieć. 6

2. Konfiguracja obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

  1. Wykonaj rezonans magnetyczny na skanerze małych zwierząt 9,4 T przy użyciu rezonatora objętościowego do transmisji fal radiowych i 4-kanałowej cewki odbiorczej z układem fazowym. Włącz łaźnię wodną o kontrolowanej temperaturze do 42 °C, aby utrzymać temperaturę ciała myszy.
  2. Wywołaj znieczulenie w komorze za pomocą 2% izofluranu i sprężonego powietrza, aż mysz przestanie reagować na uszczypnięcie palca u nogi. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1-1,5%.
  3. Umieść cewnik do żyły ogonowej w żyle ogonowej myszy. Ustaw mysz do rezonansu magnetycznego, kładąc ją na brzuchu i z chrupniętym grzbietem na łóżku dla zwierząt wyposażonym w blokadę głowy i listwę zębatą, aby zminimalizować ruchy głowy. Uważaj, aby nie wyprostować odcinka szyjnego kręgosłupa myszy.
  4. Podłączyć system do wstrzykiwania środka kontrastowego do cewnika do żyły ogonowej. Należy użyć specjalnie przygotowanego systemu iniekcyjnego wypełnionego strzykawką Gd-DTPA (0,3 mmol/kg) lub użyć rurki PE podłączonej do strzykawki Gd-DTPA (0,3 mmol/kg).
  5. Nałóż maść do oczu z dekspantenolem na oba oczy. Umieść 4-kanałową cewkę głowicy odbiornika powierzchniowego z układem fazowym na główce myszy. Umieść podkładkę oddechową z tyłu myszy i podłącz ją do urządzenia monitorującego oddech.

3. Protokół obrazowania

UWAGA: Wybierz sekwencje obrazowania z poniższego protokołu zgodnie z pytaniami badawczymi, które mają być odniesione. Wszystkie wymienione parametry są ważne dla oprogramowania MRI, ale mogą wymagać dostosowania, jeśli używane są inne programy.

  1. Zacznij od wykonania skanowania lokalizacyjnego, aby upewnić się, że mózg myszy znajduje się w izocentrum magnesu.
  2. Aby jakościowo ocenić obrzęk naczyniopochodny, użyj obrazowania 3D T2-zależnego, wybierając wielorzędową sekwencję RARE.
    1. Wprowadź następujące parametry do oprogramowania MRI: czas powtórzenia = 2.000 ms, czas echa = 22 ms, rozdzielczość izotropowa = 0,1 mm, pole widzenia = 20 x 10 x 12 mm3; matryca = 200 x 100 x 120, kąt odwrócenia = 90-180°; (spin-echo) i rzadki czynnik = 8. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 10 minut 48 s, aby uzyskać surowe obrazy.
  3. Aby ilościowo ocenić obrzęk naczyniopochodny, należy wykonać relaksometrię T2, wybierając wielorzędową, wieloczęściową sekwencję echa spinowego.
    1. Użyj następujących parametrów: czas powtarzania = 3.100 ms, czas echa = 8-136 ms w krokach co 8 ms, liczba plasterków = 17, grubość warstwy = 0,7 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie = 0,116 mm x 0,116 mm, pole widzenia 20 x 20 mm2, matryca = 172 x 172, kąt odwrócenia = 90-180 stopni; (echa spinowe). Rozpocznij sekwencję i odczekaj 8 minut 53 s, aby uzyskać surowe obrazy.
  4. Aby ilościowo ocenić zarówno obrzęk naczyniopochodny, jak i obrzęk cytotoksyczny, należy przeprowadzić obrazowanie zależne dyfuzją/mapowanie współczynnika pozornej dyfuzji (ADC), wybierając sekwencję dyfuzji EPI spin-echo.
    1. Użyj następujących parametrów: czas powtarzania = 3.400 ms, czas echa = 20 ms, grubość warstwy = 0,7 mm, liczba warstw = 17, liczba kierunków uczulonych dyfuzji = 30, wartość b = 1.500 s/mm2, δ = 3 ms, Δ = 9 ms, częściowy współczynnik przyspieszenia kodowania Fouriera = 1,51, pole widzenia = 12 x 15 mm2, matryca = 96 x 128, Rozdzielczość w płaszczyźnie = 0,125 mm x 0,117 mm, kąt odwrócenia = 90-180 stopni i liczba wycinków nasycenia (strzałkowa) = 1. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 7 minut 56 s, aż zostaną uzyskane obrazy raw.
  5. Aby ocenić mikrokrwotoki, użyj obrazowania 3D T2*-zależnego. Wybierz sekwencję FLASH z kompensacją przepływu.
    1. Wprowadź następujące parametry do oprogramowania MRI: czas powtarzania = 2.000 ms, czas echa = 22 ms, rozdzielczość izotropowa 0,08 mm, pole widzenia = 32 x 15 x 8 mm3, rozmiar matrycy = 400 x 188 x 100 i kąt odwrócenia = 12 stopni. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 15 minut 40 s, aby uzyskać surowe obrazy.
  6. Aby ocenić drożność tętnic, użyj angiografii czasu lotu, wybierając sekwencję 3D FLASH.
    1. W oprogramowaniu MRI należy użyć następujących parametrów: czas powtarzania = 16 ms, czas echa = 3,5 ms, grubość warstwy = 0,07 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie = 0,104 x 0,104 mm, pole widzenia = 20 x 20 x 10 mm3, matryca = 192 x 192 x 142 i kąt odwrócenia = 15 stopni. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 7 minut 16 s, aż obrazy zostaną uzyskane.
  7. Aby ocenić przerwanie bariery krew-mózg, należy zastosować obrazowanie 3D T1-zależne przed i po wstrzyknięciu środka kontrastowego w ilości 0,3 mmol/kg. Wybierz sekwencję FLASH z zakłóceniem częstotliwości radiowej z globalnym wzbudzeniem częstotliwości radiowej.
    1. Użyj następujących parametrów sekwencji w oprogramowaniu MRI: czas powtarzania = 5 ms, czas echa = 1,9 ms, rozdzielczość izotropowa = 0,156 mm, pole widzenia 20 x 18,7 x 18,7 mm3, matryca 128 x 120 x 120 i kąt odwrócenia = 8,5°;. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 1 minutę i 14 sekund, aż obrazy zostaną pobrane.

4. Przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Aby przeanalizować zakłócenie bariery krew-mózg, odejmij 3D nieulepszone obrazy T1 zależne od ulepszonych obrazów T1 za pomocą narzędzia arytmetycznego lub kalkulatora obrazów w ImageJ. Oceń obrazy odejmowania pod kątem wzrostu sygnału, który odpowiada przerwaniu bariery krew-mózg. 9
  2. Aby przeanalizować objętość mózgu, użyj natywnych zestawów danych 3D T1 lub 3D T2-ważonych. Nakreśl mózg od opuszki węchowej do móżdżku za pomocą edytora segmentacji. 10
  3. Obrzęk naczyniopochodny
    1. Przetwarzaj dane relaksometryczne T2 za pomocą oprogramowania MRI lub użyj nieliniowej procedury dopasowania najmniejszych kwadratów. 11 Przetwarzaj dane ważone dyfuzją, aby uzyskać mapy ADC za pomocą oprogramowania MRI lub zestawu narzędzi FDT (zobacz Tabelę materiałów).
    2. Ręczne umieszczanie obszarów zainteresowania w różnych regionach anatomicznych.
      UWAGA: Automatyczne umieszczanie obszarów zainteresowania może rejestrować się nieprawidłowo z powodu znacznego obrzęku mózgu. W ten sposób uzyskuje się wartości czasów T2 i ADC wybranych obszarów anatomicznych.
  4. Aby przeanalizować objętość mikrokrwotoku, należy nakreślić mikrokrwotoki, które pojawiają się jako jajowate, ciemne ogniska na zestawach danych ważonych T2*, za pomocą edytora segmentacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U myszy C57BL/6 pierwsze objawy kliniczne ECM można zaobserwować między 6 a 10 dniem po zakażeniu sporozoitami P. berghei ANKA. ECM rozwija się u 60 - 80% zakażonych myszy i szybko przechodzi w śpiączkę i śmierć w ciągu 24 do 48 godzin. Natomiast myszy, u których nie rozwinie się ECM, umierają po drugim tygodniu po zakażeniu z powodu ciężkiej niedokrwistości spowodowanej hiperpasożytemią. 12

W ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisujemy protokół MRI całego mózgu w celu nakreślenia zmian w eksperymentalnej malarii mózgowej. Uważamy, że do tej pory rezonans magnetyczny nie był w pełni wykorzystywany w badaniach nad malarią i mamy nadzieję, że nasze protokoły pomogą innym badaczom. Chcielibyśmy opisać kilka dodatkowych punktów, które mogą być pomocne.

Jeśli obrazowane są poważnie chore myszy, kluczowe znaczenie ma pozycjonowanie. Ze względu na zwiększone ciśnienie śródczaszkowe myszy są podatne na śmierć...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy za fachową pomoc techniczną Miriam Reinig. AH otrzymał dofinansowanie ze stypendium podoktorskiego Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Heidelbergu. MP jest wspierany przez stypendium Fundacji Else-Kröner-Fresenius. AKM jest stypendystką Niemieckiego Centrum Badań nad Zakażeniami (DZIF) w ramach stypendium urlopowego DZIF. JP jest stypendystą stypendium Heidelberg Research Center for Molecular Medicine (HRCMM) Career Development Fellowship. Wyrażamy również wdzięczność Julii M. Sattler i Friedrichowi Frischknechtowi za stworzenie przykładowego filmu o ruchu sporozoitowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneBaxter1001747do znieczulenia
DotaremGuebert1086923środek kontrastowy Gd-DTPA; 0,5 mmol/ml
Amira (program do przetwarzania obrazu)FEI GroupWersja Amira 5.3.2
MATLAB MathWorks, Inc.,wydanie 2012b
Zestaw narzędzi FDT Biblioteka oprogramowaniaFMRIBhttp://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
  3. Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
  4. de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
  5. Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
  6. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
  7. Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470(2016).
  8. Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829(2014).
  9. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  10. Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
  11. Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56(2009).
  12. Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. Experimental models of cerebral malaria. Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).
  13. Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
  14. Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528(2014).
  15. Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982(2012).
  16. Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236(2014).
  17. Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210(2015).
  18. Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bariera krew m zgobrz k wazogennyobrazowanie T2 zale neobrazowanie dyfuzyjneangiografia Time Of Flightkontrast Gd DTPAeksperymentalny model mysi

Powiązane artykuły