Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Podsumowanie

Aby zbadać progresję guza jajnika w fizjologicznie istotnym modelu, wielokomórkowe sferoidy zostały wyhodowane w mikrourządzeniu pod symulowanym przepływem płynu. Ten dynamiczny model 3D emuluje środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutów raka jajnika.

Streszczenie

Rak jajnika charakteryzuje się rozległymi przerzutami do otrzewnej, z kulami nowotworowymi powszechnie występującymi w złośliwym wodobrzuszu. Wiąże się to ze słabymi wynikami klinicznymi i obecnie nie ma skutecznego leczenia. Zarówno środowisko trójwymiarowe (3D), jak i dynamiczne siły mechaniczne są bardzo ważnymi czynnikami w tej kaskadzie przerzutowej. Jednak tradycyjne hodowle komórkowe nie są w stanie odtworzyć tego naturalnego mikrośrodowiska guza. W związku z tym oczywiste znaczenie mają modele podobne do in vivo, które mogą naśladować środowisko wewnątrzotrzewnowe. W tym badaniu stworzono nową platformę mikroprzepływową otrzewnej, aby naśladować sytuację sferoid raka jajnika w jamie otrzewnej podczas przerzutów. Sferoidy raka jajnika powstałe w warunkach nieprzylegających do zachorowań hodowano w kanałach mikroprzepływowych pokrytych komórkami międzybłonka otrzewnej poddanymi fizjologicznie istotnemu naprężeniu ścinającemu. Podsumowując, ta dynamiczna platforma mikroprzepływowa 3D raka jajnika i mezotelium może dostarczyć nowej wiedzy na temat podstawowej biologii nowotworów i służyć jako platforma do potencjalnych badań przesiewowych i opracowywania leków.

Wprowadzenie

Rak jajnika jest najbardziej śmiertelnym nowotworem ginekologicznym i charakteryzuje się rozległym rozprzestrzenianiem się otrzewnej oraz powstawaniem złośliwych wodobrzuszy¹. To rozległe przerzuty do otrzewnej stanowią poważne wyzwanie kliniczne i wiążą się ze złymi wynikami klinicznymi. W przeciwieństwie do większości raków litych, które dają przerzuty przez krew, rak jajnika rozprzestrzenia się głównie w obrębie jamy otrzewnej. Komórki nowotworowe istnieją jako wielokomórkowe agregaty/sferoidy podczas procesu przerzutów². Fakt, że hodowla zawiesiny może wzbogacić komórki macierzyste/inicjujące nowotwór raka jajnika, sugeruje, że te sferoidy mogą być związane zarówno z agresywnością guza, jak i zwiększoną odpornością na chemoodporność^3,4. Istnieją różnice w odpowiedzi na leki między kulturami 2D i 3D, które przypuszczalnie mają różne mechanizmy molekularne⁵.

Podstawowa interakcja z mezotelium tworzy podstawowe mikrośrodowisko dla progresji guza jajnika. Te komórki międzybłonka leżą na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), gdzie fibronektyna jest wszechobecnym składnikiem. Wykazano związek między zwiększoną ekspresją fibronektyny pochodzącej z komórek międzybłonka a progresją nowotworu. Fibronektyna jest obficie obecna w złośliwym wodobrzuszu^6,7. Komórki raka jajnika są również zdolne do indukowania wydzielania fibronektyny z komórek międzybłonka w celu promowania wczesnych przerzutów raka jajnika⁸.

Pojawiające się dowody wskazują, że bodźce mechaniczne, w tym naprężenia ścinające, mogą modulować morfologię komórek, ekspresję genów, a tym samym fenotypy komórek nowotworowych^9,10,11. Ponieważ złośliwe wodobrzusze rozwija się i gromadzi podczas progresji guza, komórki nowotworowe jajnika są narażone na przepływ płynu i wynikające z tego naprężenia ścinające. Wiele grup, w tym nasza, wykazało wpływ stresu ścinającego na progresję raka jajnika, w tym modyfikacje cytoszkieletu, przejścia nabłonkowe do mezenchymalnych i macierzystość raka^12,13,14,15. W związku z tym fizjologicznie istotne mikrośrodowisko jest ważne dla badania przerzutów guza otrzewnej. Jednak obecne systemy hodowli hydrodynamicznej in vitro mają ograniczenia w naśladowaniu i kontrolowaniu stałego, niskiego, fizjologicznie istotnego naprężenia ścinającego^16,17,18,19. Konwencjonalne podejścia in vitro koncentrujące się na środowisku komórkowym lub mechanicznym są nadal ograniczone w naśladowaniu złożoności mikrośrodowiska wewnątrzotrzewnowego z odpowiednim znaczeniem fizjologicznym.

Tutaj, w celu opracowania nowego modelu otrzewnej, aby przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych strategii i przyspieszyć badania przedziału wewnątrzotrzewnowego w przerzutach raka, zaprojektowano platformę mikroprzepływową 3D z kontrolowanym przepływem płynu. W tym modelu sferoidy raka jajnika były hodowane wspólnie z pierwotnymi ludzkimi komórkami międzybłonka otrzewnej w chipach mikroprzepływowych pod ciągłym przepływem płynu (ryc.1A). Komórki międzybłonka poszczepiono fibronektyną. Nieprzylegające sferoidy raka jajnika zostały wysiane do kanałów mikroprzepływowych z pożywką o ciągłym przepływie, ukrwioną za pomocą pompy strzykawkowej. Zarówno środowisko 3D, jak i dynamiczne siły mechaniczne są bardzo ważnymi czynnikami kaskady przerzutowej. Platforma ta może być wykorzystywana do badania mikrośrodowiska wewnątrzotrzewnowego pod kątem złożonych interakcji komórkowych i kokulturowych, a także w odniesieniu do dynamicznych sygnałów mechanicznych.

Protokół

1. Projektowanie i produkcja urządzeń mikroprzepływowych

1. Główny projekt mikroprzepływowy
   1. Zaprojektuj i narysuj wzór kanału mikroprzepływowego za pomocą dowolnego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).
      UWAGA: Zwykle rysunek CAD można wysłać do firmy zajmującej się maską fotograficzną w celu wyprodukowania fotomaski. Konstrukcja mikroprzepływowa składa się z trzech identycznych równoległych kanałów, każdy o następujących wymiarach: 4 mm × 25 mm × 250 μm (szerokość × długość × wysokość) i oddalonych od siebie o 2 mm. Oba końce kanałów zostały zaprojektowane pod kątem 127°, aby ułatwić wchodzenie i wychodzenie cieczy (ilustracja 1B). Kanał używany w tym protokole został opisany w poprzedniej publikacji¹³.
   2. Umyj płytkę silikonową ultradźwiękami (500 W/42 kHz) w acetonie, izopropanolu i wodzie dejonizowanej przez 15 minut każdy. Wysuszyć wafel azotem pod ciśnieniem. Podgrzej wafel krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 250 °C przez 15 minut, aby całkowicie wysuszyć.
   3. Warstwa fotorezystu SU-8 2075 (o grubości 125 μm) zostanie nałożona na płytkę krzemową z prędkością wirowania 1 800 obr./min. Wafel pokryty fotorezystem wypiekać bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C, a następnie w temperaturze 95 °C w celu usunięcia nadmiaru rozpuszczalnika, odpowiednio przez 5 i 25 minut (zgodnie z instrukcją produktu SU-8).
   4. Powtórz krok 3 i obróć kolejną warstwę fotorezystu SU-8 2075 do uzyskania końcowej grubości 250 μm. Piecz wafel pokryty fotorezystem bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 7 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Powoli schładzaj wafel do temperatury pokojowej. Nie chłodzić powietrzem pod ciśnieniem.
   5. Wyrównaj i umieść fotomaskę bezpośrednio na płytce. Wystaw go na działanie światła UV przez 20 sekund, aby usieciować wzór.
   6. Piecz wafel z fotorezystem w temperaturze 65 °C i 95 °C na płycie grzejnej odpowiednio przez 5 i 12 minut, aby usunąć rozpuszczalnik do polimeryzacji (zgodnie z instrukcją produktu SU-8). Następnie schłodzić wafel do temperatury pokojowej.
   7. Usuń nieusieciowany fotorezyst, zanurzając płytkę w wywoływaczu SU-8 na 25 minut. Opłucz płytkę izopropanolem i osusz ją sprężonym powietrzem.
      UWAGA: Jeśli podczas płukania izopropanolem zaobserwowano mleczny roztwór, wskazujący na niepełne wywołanie, zanurz płytkę z powrotem w wywoływaczu SU-8 na dłuższy czas wywoływania.
   8. Umieść wafel na gorącej płycie w temperaturze 180 °C na 10 minut, aby wyleczyć wzór z potencjalnych pęknięć. Wyłącz płytę grzejną i powoli schładzaj wafel do temperatury pokojowej, pozostawiając go na płycie grzejnej.
   9. Dodaj kilka kropli trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl) silanu w nasadce fiolki. Umieścić nasadkę fiolki w eksykatorze próżniowym. Umieść wafel obok nakrętki fiolki, aby sylizanizować wafel przez 10 minut.
2. Produkcja chipów PDMS
   1. Owiń wafel folią aluminiową, aby utworzyć uchwyt.
   2. Wymieszać bazę polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz w stosunku masowym 10:1 za pomocą mieszalnika odśrodkowego w funkcji mieszania i odgazowywania. Mieszaninę PDMS należy powoli wylać na wafel na wysokość około 5 mm. Odgazuj PDMS w próżni przez 40 minut. Utwardzić PDMS w piecu w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
   3. Ostrożnie oderwij płytę PDMS od urządzenia głównego i przytnij PDMS wzdłuż kanałów, aż osiągnie rozmiar szklanego szkiełka. Przebij PDMS 1-milimetrowym stemplem biopsyjnym, aby utworzyć wloty i wyloty urządzenia.
   4. Oczyść powierzchnię PDMS sprężonym powietrzem i taśmą samoprzylepną, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia PDMS.
   5. Umieść płytę PDMS, stroną kanału skierowaną do góry, w myjce plazmowej. Umieść czysty szkiełko w myjce plazmowej obok płyty PDMS.
   6. Traktuj PDMS i szkiełko pod plazmą powietrzną na wysokim poziomie RF przez 1 minutę. Zwiąż PDMS ze szkiełkiem, aby utworzyć nieodwracalne wiązanie kowalencyjne.
   7. Umieść chip PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C na 1 godzinę, aby zwiększyć siłę wiązania i przywrócić hydrofobowość PDMS przed użyciem.

2. Wyposażenie układu mikroprzepływowego w pierwotne komórki międzybłonka otrzewnej (HPMC)

1. Powłoka fibronektynowa kanałów mikroprzepływowych
   1. Wysterylizuj kanał mikroprzepływowy za pomocą 30 μl 75% etanolu. Usunąć etanol i przepłukać dwukrotnie 30 μl wysterylizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) za pomocą końcówki pipety. Dokładnie odessać PBS w kanałach.
      UWAGA: Aby zminimalizować zanieczyszczenie, mikroprzepływowa hodowla komórek powinna być ostrożnie przeprowadzana w całkowicie aseptycznych warunkach przy użyciu okapu z przepływem laminarnym.
   2. Przygotować roztwór fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w pożywce M199:MCDB105 (1:1) bez surowicy. Pipetować roztwór w górę i w dół, zwracając szczególną ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Nie wirować.
   3. Powoli napełnij każdy kanał 30 μl roztworu fibronektyny. Uszczelnić kanały taśmą i inkubować chip przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Zasiewanie HPMC do kanałów mikroprzepływowych
   1. Hodowla HPMC w 10% pożywce hodowlanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (M199:MCDB105 uzupełnionej 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny) poniżej 5% CO₂ w temperaturze 37 °C aż do 80% zbiegu.
   2. Przepłukać HPMC 3 ml PBS i trypsynizować 2 ml 0,05% roztworu trypsyny/0,01% EDTA (TE) przez 30 s. Zneutralizować 4 ml 10% pożywki hodowlanej FBS i wirować komórki w temperaturze 1,000 x g przez 5 minut.
   3. Ponownie zawiesić HPMC w 2 ml 10% pożywki hodowlanej FBS. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 3,5×10⁶/ml.
   4. Przed użyciem rozgrzać chip mikroprzepływowy pokryty fibronektyną w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Całkowicie odessać roztwór fibronektyny.
   5. Powoli odpipetować 30 μl zawiesiny HPMC do każdego kanału. Uszczelnij kanały taśmą i umieść urządzenia w inkubatorze CO_{2 na} noc.

3. Formacja sferoidów raka jajnika i kokultura

1. Tworzenie sferoidów raka jajnika
   1. Utrzymuj ludzką linię komórkową nabłonkowego raka jajnika SKOV-3 w 5% pożywce hodowlanej FBS (M199:MCDB105 z 5% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny) poniżej 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przed eksperymentami.
   2. Rozpuść 0,5% agarozy w wysterylizowanej wodzie przez gotowanie. Dozować 50 μl roztworu agarozy do każdego dołka z 96-dołkowymi płytkami. Pozostaw płytki w okapie na 20 minut, aby agaroza zastygła; Zestalona agaroza pokrywająca studzienki może zapobiegać przyleganiu komórek i wskazuje, że płytki są gotowe do użycia.
   3. Przepłukać komórki SKOV-3 3 3 ml PBS. Trypsynizuj z 2 ml roztworu TE przez 3 min. Zneutralizować 4 ml 5% pożywki hodowlanej FBS i odwirowywać komórki w temperaturze 1,000 x g przez 5 minut.
   4. Policz liczbę komórek SKOV-3 za pomocą hemocytometru i ponownie zawieś komórki w 5% pożywce hodowlanej FBS o gęstości 5 000 komórek/ml. Przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do każdego studzienka pokrytego agarozą i hodować w temperaturze poniżej 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
2. Obciążenie sferoidami raka
   1. Przenieś sferoidy raka do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wstępnie zwilżonej 1 ml pożywki bez surowicy i wiruj w dół przy 750 x g przez 5 min.
      UWAGA: Wstępnie zwilżone końcówki pipet i probówki wirówkowe mogą zapobiec niepożądanemu przyczepieniu sferoidów do probówek wirówkowych.
   2. Przygotować 2,5 μg/ml roztworu dioctanu 5-chlorometylofluoresceiny (CMFDA) w podłożu M199:MCDB105 bez surowicy. Zawiesić sferoidy nowotworowe w 1 ml roztworu CMFDA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wirować przy 750 x g przez 5 min.
   3. Przepłukać sferoidy raka 2 ml pożywki bez surowicy i wirować przy 750 x g przez 5 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby usunąć pozostały barwnik fluorescencyjny z pożywki.
      UWAGA: Sygnał fluorescencyjny może być utrzymywany w sferoidach przez ponad 96 godzin.
   4. Ponownie zawiesić sferoidy nowotworowe w pożywce M199:MCDB105 bez surowicy i zmierzyć liczbę sferoidalną za pomocą hemocytometru. Dostosuj stężenie do 2 000 sferoidów/ml za pomocą pożywki bez surowicy.
   5. Przed obciążeniem sferoidowym należy powoli wstrzyknąć 100 μl pożywki M199:MCDB105 bez surowicy, aby zmyć nieprzylegające komórki międzybłonka wewnątrz kanałów.
      UWAGA: Szybkie wstrzyknięcie, aspiracja lub tworzenie pęcherzyków doprowadzi do oderwania monowarstwy międzybłonka.
   6. Załaduj 30 μl znakowanej fluorescencyjnie zawiesiny sferoidalnej do każdego kanału. Umieść chip mikroprzepływowy w inkubatorze CO_{2 .}
3. Montaż platformy perfuzyjnej i współkultura
   1. Podłączyć strzykawkę wypełnioną świeżą, pozbawioną surowicy pożywką M199:MCDB105 do probówki o długości 1 m.
   2. Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej i zabezpieczyć tłok oraz korpus strzykawki. Zainstalować pompę strzykawkową w pozycji poziomej na tej samej wysokości co chip mikroprzepływowy wewnątrz inkubatora.
      UWAGA: Liczba i rozmiar strzykawek zależą od liczby użytych kanałów i czasu trwania eksperymentu.
   3. Szybko napełnij całą probówkę medium, naciskając i przytrzymując przycisk szybkiego przewijania do przodu, aż medium przeleje się przez rurkę.
   4. Uruchomić wtrysk z żądanym natężeniem przepływu. Oszacuj naprężenie ścinające ściany, korzystając z następującego równania:
      
      gdzie τ oznacza naprężenie ścinające ścianę wewnątrz komory, Ǫ = natężenie przepływu, μ = lepkość (0,01 g ^cms-1); h = wysokość komory przepływowej, a w = szerokość komory przepływowej.
   5. Podłącz rurkę do wlotu kanału. Umieścić nadmiar rurki wlotowej w inkubatorze, aby upewnić się, że pożywka została ogrzana przed wstrzyknięciem do kanałów. Aby ułatwić połączenie między rurką a kanałem, można dobrać odpowiednie złącza. UWAGA: Uważaj, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków do strzykawki, rurki i połączeń.
   6. Podłącz wylot kanału do stożkowej rurki o pojemności 50 ml, aby zebrać wypływające medium za pomocą krótkiej rurki wyjściowej.
      UWAGA: Kompletny dynamiczny system kokultur pokazano na rysunku 1D.

4. Obserwacja HPMC i sferoid nowotworowych po perfuzji

1. Obserwuj HPMC i sferoidy nowotworowe za pomocą mikroskopu jasnego pola lub mikroskopu fluorescencyjnego i zrób zdjęcia po 1 godzinie perfuzji.

Wyniki

Korzystając z tego protokołu, stworzono platformę mikroprzepływową do modelowania sferoid raka jajnika z komórkami międzybłonka w warunkach hydrodynamicznych. Pierwotne ludzkie komórki międzybłonka otrzewnej hodowano w mikrourządzeniu przez 16 godzin i obserwowano pod mikroskopem jasnego pola. Jak pokazano na rysunku 2A, dno kanału zostało z powodzeniem pokryte monowarstwą HPMC. Ważne jest, aby pamiętać, że tworzenie się pęcherzyków podczas modelowania fibronektyny lub HP...

Dyskusja

Test ten oferuje elastyczny i fizjologicznie istotny model, który można włączyć do różnych testów biochemicznych i komórkowych, w tym między innymi testów adhezji, testów klirensu międzybłonka i badań przesiewowych leków. Może być stosowany do oceny wpływu mikrośrodowiska wewnątrzotrzewnowego na progresję nowotworu. Jednak kilka warunków eksperymentalnych może wymagać optymalizacji, w zależności od celów projektu (np. liczba HPMC i sferoidów nowotworowych wysiewanych na kanał, czas kohodowli itp.). Inne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wafel krzemowy	Wafel uniwersytecki	1196	100 mm
SU-8 2075 fotorezystor	Microchem
SU-8	Microchem	108-65-6
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silan	Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polidimetylosiloksan (PDMS) + zestaw utwardzacza
do biopsji	Miltex	33-31AA	Średnica 1 mm
Myjka plazmowa	Harrick Plasma	PDC-002
Rurka polietylenowa	SCI	BB31695-PE/5	0,86 mm (średnica wewnętrzna)
Strzykawka	Terumo
Pompa strzykawkowa	Dłuższa pompa precyzyjna	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Dodać 2,2 g/L wodorowęglanu sodu
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyklon	SH30068.02
Penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15070-063
Trypsyna EDTA, roztwór	Gibco	25300-054	0,05% Trypsyna - 0,01% EDTA, czerwień fenolowa
Fibronektyna ludzka		BD 354008
Agaroza	Invitrogen	15510-027
Dioctan 5-chlorometylofluoresceiny	technologies	C7025	Zielony inkubator CMFDA
CO2	SANYO	MCO-18AIC
Wirówka	Hitachi	CT15RE
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon		Model: 80i lub ECLIPSE Ti; oprogramowanie: SPOT
SKOV-3& nbsp;			Prezent od dr N. Auersperga (Uniwersytet Kolumbii Brytyjskiej)