Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Summary

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Abstract

Istnieje wiele dobrze rozwiniętych metod oczyszczania i badania pojedynczych białek i peptydów. Jednak większość funkcji komórkowych jest realizowana przez sieci oddziałujących kompleksów białkowych, które często są trudne do zbadania, ponieważ ich wiązanie jest niekowalencyjne i łatwo zaburzone przez techniki oczyszczania. W pracy opisano metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z tkanki niemodyfikowanej za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Lizat tkankowy jest ładowany na niedenaturujący się natywny dla niebieskiego żelu poliakrylamidowego, a następnie podawany jest prąd elektryczny, aż białko przeniesie się na niewielką odległość do żelu. Pasek żelu zawierający migrowane białko jest następnie wycinany i inkubowany z odczynnikiem sieciującym aminy dithiobis (propionian sukcynimidylu), który kowalencyjnie stabilizuje kompleksy białkowe. Pasek żelu zawierający usieciowane kompleksy jest następnie wlewany do żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu, a kompleksy są całkowicie oddzielane. Metoda opiera się na technikach i materiałach znanych większości biologów molekularnych, co oznacza, że jest niedroga i łatwa do nauczenia. Chociaż jej zdolność do odpowiedniego oddzielania ekstremalnie dużych kompleksów jest ograniczona i nie odniosła uniwersalnego sukcesu, metoda ta była w stanie uchwycić szeroką gamę dobrze zbadanych kompleksów i prawdopodobnie ma zastosowanie w wielu systemach będących przedmiotem zainteresowania.

Introduction

Normalna funkcja komórkowa zależy od interakcji białko-białko^1,2. W rezultacie, choroby ludzkie są często naznaczone zaburzeniami w składaniu i zachowaniu różnych kompleksów białkowych³. Zdolność do scharakteryzowania takich interakcji ma zatem kluczowe znaczenie. Obecne sposoby wykrywania tych interakcji wymagają oczyszczenia z białek docelowych, a następnie często ściągania ich oddziałujących partnerów. Konwencjonalne oczyszczanie odbywa się poprzez różnicowe wirowanie, wytrącanie i/lub chromatografię⁴. Metody te są czasochłonne, muszą być modyfikowane dla każd....

Protocol

1. Przygotowanie tkanek

1. Przygotować 10 ml 4x BN-PAGE bufor do próbek (200 mM Bis(2-hydroksyetylo)amino-tris(hydroksymetylo)metanu (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w/v glicerolu, 0,004% Pąs, pH 7,2).
   UWAGA: Ten roztwór podstawowy może być przygotowany wcześniej i przechowywany w temperaturze 4 °C.
2. Rozcieńczyć 250 μl 4x buforu próbki w 750 μL dH₂O zawierającym 1x komercyjny koktajl inhibitorów proteazy. Wiruj i schładzaj na lodzie.
3. Homogenizować 20 mg tkanki docelowej w 1 ml 1x lodowato zimny bufor do próbek BN-PAGE za pomocą 30 pociągnięć czystego homogenizatora z dounce.
   UWAGA: W tym eksperymencie demonstracyjnym tk....

Results

W tym eksperymencie demonstracyjnym przeprowadzono multimer-PAGE na całym lizacie mózgu szczura. Powstałe w ten sposób oddzielone białka osuszono na błonach z polifluorku winylidenu (PVDF), a następnie zbadano przeciwciałami przeciwko białkom, o których wiadomo, że tworzą kompleksy. Rysunek 1 przedstawia walidację protokołu na dwa sposoby. Po pierwsze, wykazujemy, że usieciowane białka są rozszczepialne przez dodanie środka redukującego, co oznacza, że obserwowane gatunki.......

Discussion

Interakcje białko-białko są ważne dla każdego zadania wykonywanego przez żywe organizmy. Z tego powodu są one przedmiotem intensywnych analiz i badań. Multimer-PAGE to nowatorska metoda wychwytywania, rozdzielania i analizowania szerokiej gamy kompleksów białkowych. Wcześniej wykazaliśmy jego przydatność do badania oligimeryzacji białka związanego z chorobą α-synukleiny¹¹. Jest jednak rozszerzalny na wiele kompleksów białkowych, jak pokazano na rysunku 2. W porównaniu z innymi met.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-Kwas aminokapronowy	Sigma	A2504
Akrylamid	Acros Organics	164855000	Toksyczny.
Akrylamid/bisakryloamid 37,5:1 (40% T roztwór podstawowy)	BioRad	161-0148	Toksyczny.
Nadsiarczan amonu	Sigma	A3678
Anty królik IgG-HRP z kozy	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Zestaw do oznaczania kwasu bicunchoninowego	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Zestaw podłoża chemiluminescencyjnego	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonina	Sigma	D141	Toxic.
Dimetylosulfotlenek	Fisher Scientific	D128-1
Dithiobis (sukcynimidylopropionian)	Thermo Scientific	22585
Suche mleko beztłuszczowe	LabScientific	M0841
Glicerol	Sigma	G9012
Glicyna	Fisher Scientific	BP381-5
Koktajl inhibitorów	proteazy haltThermofisher	78430
Kwas solny	Fisher Scientific	A144SI-212	Do miareczkowania. Kaustyczny.
Metanol	Fisher Scientific	A412-4	Do aktywacji membrany PVDF. Toksyczny.
Monoklonalna anty &alfa;-synukleina IgG z królika	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina	Sigma	T9281
N,N'-metylenobisakryloamid	Acros Organics	16479	Toksyczny.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Membrany transferowe z polifluorku winylidenu	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P217-3
Fosforan potasu monobasic	Sigma	P9791
Koktajl inhibitorów proteazy	Thermo Scientific	88265
Roztwór SDS (10% w/v)	BioRad	161-0416
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-212
Dodecylosiarczan sodu	Sigma	L37771
Fosforan sodu jednozasadowy	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0,5 M bufor, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1,5 M bufor, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
Oprogramowanie ImageJ	NIH
Synergy H1 czytnik mikropłytek	BioTek
Gel Former + Stojak	Biorad
Wirówka Microfuge 22R Beckman	Coulter
2 ml homogenizator
Mieszalnik wirowy	Fisher Scientific
Ultradźwiękowy homogenizator tkanek	Fisher Scientific	FB120220